Abstract
Il diabete di tipo 2 è una malattia cronica che colpisce 382 milioni di persone nel 2013, e si prevede un aumento di 592 milioni entro il 2035 1. Nel corso degli ultimi 2 decenni, il ruolo di una disfunzione delle cellule beta nel diabete di tipo 2 è stato chiaramente stabilito 2. Progresso della ricerca ha richiesto metodi per l'isolamento di isole pancreatiche. Il protocollo di isolamento delle isole qui presentata condivide molte fasi comuni con protocolli di altri gruppi, con alcune modifiche per migliorare la resa e la qualità delle isole isolate sia dal tipo selvatico e diabetico db LEPR (db / db) topi. Un live-cell imaging metodo 2-fotone è quindi presentata che può essere utilizzato per studiare il controllo della secrezione insulinica entro isolotti.
Introduction
Il ruolo della disfunzione delle cellule beta nella malattia è stato ampiamente riconosciuto 3,4. Le linee cellulari, come il MIN6 e INS-1 sono strumenti utili per comprendere la biologia del comportamento delle cellule beta. Tuttavia, il controllo fisiologico della secrezione di insulina avviene all'interno delle isole di Langerhans. Questi isolotti contengono migliaia di cellule beta fitte, così come i vasi sanguigni e di altri tipi di cellule endocrine. Questo ambiente all'interno dell'isolotto influenza la secrezione di insulina, ed è probabile che sia importante nel diabete. Pertanto, per comprendere il controllo fisiologico della secrezione di insulina, e la fisiopatologia della malattia, è essenziale studiare isolotti intatti.
Isolamento Islet
Isole umane vive e, in particolare, isolotti umani provenienti da pazienti affetti da diabete di tipo 2 sono difficili da ottenere. Inoltre, isole umane hanno limitate possibilità di manipolazione molecolare sperimentale. I ricercatori hanno quindi impiegato èlascia da animali e modelli animali di diabete di tipo 2. Un tale modello di malattia è il mouse db / db. Si tratta di una mutazione spontanea che i modelli di diabete di tipo 2 con una progressione fenotipo che ricorda molto da vicino la malattia umana 5,6. Il protocollo presentato qui per l'isolamento delle isole da diabetici db / db topo ha molti punti in comune con gli altri gruppi con alcuni filtri per migliorare la resa, la purificazione e la sopravvivenza delle isole migliorata.
Imaging 2 fotone
Il live-cella 2 fotoni test qui descritta permette ai ricercatori di quantificare il numero e valutare le caratteristiche dei singoli granuli insulina contenente da molte cellule del diabetico 7 e wild type isolotti 8,9.
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Protocol
NOTA: Tutte le presenti esperimenti sono stati eseguiti secondo le locali procedure di etica animale dell'Università di Queensland (approvati dalla University of Queensland, anatomico Biosciences Comitato Etico).
1. Islet Isolamento
- Preparazione dei reagenti
- Miscela di enzimi
- Per la digestione pancreatica, utilizzare una miscela di liberase e collagenasi tipo IV. Diluire liberase TL (termolisina basso) 1 flacone di 5 mg con 26 ml di DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium).
- Preparare collagenasi di tipo IV in tampone di Hank ad una concentrazione di 0,5 mg / ml, supplementato con 5 mM HEPES, 0.5mm CaCl 2, 0,1 mg / ml e DNAsi 1mg / ml sieroalbumina bovina.
- Mescolare il TL liberase e soluzioni collagenasi in un rapporto di 4: 1 (in volume), cioè, 4 ml liberase TL + 1 ml di collagenasi. Aliquota della miscela di enzimi per 2,5 ml ciascuna e conservare a -20 ° C.
NOTA: Le ore di incubazione tessuto vary un po 'tra i lotti di enzima (30 sec a differenza di 1 min). Pertanto, un test di gruppo può essere richiesto.
- RPMI Isolamento media
- Sciogliere una fiala di RPMI 1640 polvere in 1 l di acqua a temperatura ambiente e integrare con 2 g NaHCO 3, 4.02 g HEPES.
- Combina i media isolamento RPMI in una grande beuta, mescolare con agitatore magnetico, regolare a pH 7,4 con NaOH, filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
- RPMI Media Cultura
- Utilizzare coltura RPMI con 10% di siero fetale bovino e 1% di antibiotici (ad esempio, penicillina 100 U / ml, streptomicina 100 mg / ml).
- Miscela di enzimi
- Isolamento Islet e Coltura
- Sacrificio animale
- Sacrificio topi di dislocazione cervicale o di CO 2 asfissia secondo le procedure di etica dell'istituzione locale. Spruzzare accuratamente il corpo del mouse con il 70% di etanolo.
- Perfusione pancreas
- USE 2 tagli lunghi lateralmente attraverso la pelle addominale e del peritoneo per fare un lembo a forma di V. Tirare il lembo della pelle fino a scoprire l'intera cavità addominale, messo da parte dell'intestino e mantenere il fegato in posizione da una carta velina ripiegata per rivelare il dotto biliare comune (figure 1 e 2). Mettere l'animale in modo che la testa verso il chirurgo e la coda dal chirurgo.
- Applicare un morsetto vascolare nella ampolla sulla parete del duodeno per bloccare gli enzimi iniettati di entrare duodeno (Figura 1).
NOTA: Questo è un passo importante in quanto determina se gli enzimi iniettati andranno nel dotto pancreatico e profumato il pancreas o reflusso al sito di iniezione (oltre morsetto) o andare nel duodeno (sotto pinza). - Incannulare dotto biliare comune con un ago G 31 nei pressi dello svincolo del dotto epatico comune e dotto cistico (Figura 1) e lasciare spazio per una seconda iniezione se the pancreas non riesce a perfusione la prima volta. Lentamente (sopra ~ 10 sec) iniettare circa 2 ml di miscela di enzimi freddo nel mouse dotto biliare comune.
NOTA: Il pancreas saranno perfusi rapidamente se la pinza è nella posizione corretta. - Regolare la posizione di blocco se l'ago si trova all'interno del dotto biliare comune, ma non può profumato pancreas (es., Spostare la pinza un po 'lontano dal fegato se oltre bloccato o spostarlo verso il basso un po' per il fegato se sotto bloccato).
NOTA: L'ago volte va nella capsula circostante piuttosto che il lume del dotto. Un segno utile per verificare se l'ago è all'interno del dotto biliare comune è la dilatazione del condotto d'iniezione. Se il pancreas non riesce a perfusione, un'alternativa è la miscela enzima potrebbe essere iniettato a più siti del pancreas con minore rendimento previsto. La perfusione del sito sinistra del pancreas (lobo splenica) è importante per la massimizzazione della resa isolotto. - Dopo il pancreas è perfused, rimuovere rapidamente il pancreas, metterla in una fiala (~ 20 ml, vetro) e incubare per ~ 19 min in un bagno di 37 ° C Acque.
NOTA: Il tempo di incubazione può variare un po 'a seconda del ceppo di topo ed età. - Dopo il tempo di incubazione, arrestare il processo di digestione aggiungendo ~ 20 ml di terreni di isolamento freddo. Agitare delicatamente il flacone di interrompere il pancreas e versare attraverso un normale colino del tè (diametro dei pori di 1 mm) in una sterile tubo da 50 ml. Rabboccare il tubo con terreni di isolamento e centrifugare a 400 xg per 1 min a 4 ° C con freno off.
- Sciogliere di nuovo il pellet in terreni di isolamento e trasferire due provette da 15 ml, quindi si centrifuga a 400 xg per 1 min a 4 ° C con freno off. Dopo l'aspirazione del surnatante, miscelare i due palline bene con 6 ml di mezzi di separazione cellulare gradiente di densità (Histopaque soluzione 1077) per provetta nel vortex o pipettando su e giù. Poi aggiungere delicatamente ~ 6 ml dei terreni di isolamento al lato del tubo in cimai mezzi di separazione gradiente di densità e centrifugare a 100 xg per 15 min a 4 ° C con freno off.
- Raccogliere il surnatante nella parte superiore (terreni di isolamento), media e bassa (densità cellulare gradiente di mezzi di separazione) strato in 3 piatti separati. Handpick isolotti in questi 3 piatti, usando una pipetta sotto un microscopio da dissezione.
NOTA: Lo strato intermedio contiene la maggior parte degli isolotti. Isolotti sono riconosciuti come strutture compatte di ~ 50 a 500 micron di dimensione (Figura 3). Otteniamo ~ 200 isolotti in topi WT e 300- <100 isolotti nei topi db / db.
- Islet Culturing
- Per aiutare gli isolotti riprendersi dalla digestione enzimatica, gruppi culturali di 40 isolotti in un 25 centimetri capsula di Petri con 6 ml RPMI terreni di coltura (10mM glucosio) a 37 ° C, 5% / 95% di CO 2 / O 2 per 2 giorni prima dal vivo -cell 2-photon imaging. Modificare il terreno di coltura quotidiano.
- Sacrificio animale
2. Live Cell 2-Photon Imaging
- Preparazione dei reagenti
- Extracellulare Buffer
- Preparare il sodio ricco tampone extracellulare per il test 2-fotone con 140 mM NaCl, KCl 5 mM, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5 NaHCO 3 e 10 mM HEPES mM.
- Extracellulare Dye
- Per il saggio 2 fotoni, preparare magazzino SRB 8 mm in tampone extracellulare, aliquota in piccoli tubi e conservare a -20 ° C. Diluire lo stock SRB 1:10 in tampone fresco extracellulare per ottenere una concentrazione di lavoro di 0,8 mm.
- Extracellulare Buffer
- fotone Imaging
- Innanzitutto, pre-incubare 2 giorni isolotti coltivate in 3 mM glucosio tampone extracellulare per 30 min.
NOTA BENE: Usiamo isolotti tra 2 e 5 giorni in coltura. - Quindi, inserire un vetrino sulla camera termo-controllo montato sul palco microscopio. Utilizzare del grasso per impedire la fuoriuscita di soluzione.
- Coprire la camera con 500 ml di ExtracellBuffer colare contenente 0,8 SRB mm con differenti concentrazioni di glucosio (3 mm, 6 mm, 15 mm e 20 mm) di glucosio.
- Quindi, posizionare l'isolotto di pre-incubazione nel mezzo della camera e si concentrano a 3-4 strati di cellule nel isolotto dove, nelle isole di roditori, immunocolorazione per l'insulina mostra che la maggior parte delle cellule sono cellule beta.
NOTA: Il SRB illustrerà tutte le membrane delle cellule dell'isolotto rapidamente e l'isolotto è pronto per l'immagine. - Utilizzare un microscopio 2 fotoni con un obiettivo 60X immersione in olio (NA 1.42) e software di imaging (ad es., Scanimage 11). La Figura 4 illustra una tipica disposizione microscopia. Immagine eventi esocitosi utilizzando SRB come una membrana impermeant marcatore extracellulare fluorescente eccitato da impulsi laser a femtosecondi a 880 nm, con la fluorescenza rilevati a 550-650 nm. Registrare le risposte isolotto alla stimolazione.
- Identificare gli eventi esocitosi singoli dall'improvvisa apparizione di una piccola macchia fluorescente (risoluzione 10 pixel /1; m) e confermare con la fase veloce di salita del segnale fluorescente sopra una regione di interesse (~ 0,78 micron 2).
- Innanzitutto, pre-incubare 2 giorni isolotti coltivate in 3 mM glucosio tampone extracellulare per 30 min.
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Representative Results
Resa Islet e purificazione
Per un normale topo wild-type, sono attesi circa 200 isolotti. Isolotti sani guardare luminoso, di forma circolare e un bordo liscio. Un lotto di isolamento su digerito di solito ha piccole e sfocate isolotti mentre un partita sotto-digerito ha meno isolette e isolotti di cellule attaccato acinar (Figura 3). Per diabetici db / db topo, la resa isolotto e l'aspetto dipende dalla progressione della malattia con migliori topi glicemico sono più grandi, isolotti più luminoso e più (fino a 300 isolotti) rispetto al peggio topi glicemico che hanno isolette più piccole con un aspetto traslucido (sotto 100 isolotti)
Test 2 fotoni
Immagini 2-photon è un test indiretto per misurare la secrezione di insulina a livello di singola fusione dell'insulina granulo. In risposta a stimoli come glucosio o di potassio, granuli insulina fondono con la membrana plasmatica e il colorante SRB extracellulare entra the granuli cui risultato è la comparsa di una improvvisa fluorescente posto ~ 400 nm di diametro (Figura 5). Vari esperimenti sono stati condotti per validare questo test come misura della fusione dei granuli contenente insulina come la dose di glucosio dipendente di aumentare il numero di eventi granuli di fusione con la quantità prevista di secrezione di insulina, la dimensione coerente delle cellule risposto in 2 fotone con quello di una cellula beta, il diametro dei granuli simile misurata dal fotone 2 e il microscopio elettronico, la colocalizzazione della captazione colorante e insulina colorazione 8.
Entro il tempo di registrazione, tutti gli eventi di esocitosi in risposta allo stimolo sono identificati e la posizione degli eventi, il tempo di comparsa, la durata e il tipo di eventi di fusione come-and-run bacio o completa fusione sono caratterizzati ( Figura 5, 6). Queste caratteristiche del processo di fusione sono utili per valutare qualsiasi difetto nella fusione dei granuli in modelli di diabete di tipo 2. La nostra precedente relazione con questo metodo dimostra che il difetto in diabetici isolotti db / db è la perdita completa fusione dei granuli e non un cambiamento nelle caratteristiche cinetiche dei singoli granuli fusion 7. Inoltre, abbiamo dimostrato che il fattore più importante nella diminuzione della secrezione insulinica in malattia è una riduzione del numero di cellule responsive 7.
Figura 1:. Un diagramma dei siti di serraggio e iniezione Iniettare gli enzimi al dotto biliare comune vicino alla confluenza del dotto epatico comune e dotto cistico. Bloccare l'ampolla di Valter da un morsetto vascolare per facilitare l'enzima iniettato al dotto pancreatico.
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Figura 2: Il processo di iniezione nei topi. Cifra superiore illustra l'ago all'interno del coledoco con un morsetto vascolare applicata presso l'ampolla di Valter. La figura in basso mostra il pancreas liberase-perfusione dopo l'iniezione.
Figura 3: immagini tipici di tipo selvaggio e isolotti db / db isolati (A) tipo selvatico isolato isolotti.. (B) db / db isole isolate. (C) Under-digerito isolotti con cellule acinari annessi (frecce). (D) Oltre digerito isolotti con le piccole e sfocate isolotti (frecce). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. I componenti principali del microscopio 2 fotoni misura Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Esempio di un singolo evento di insulina granulo fusione come registrato con microscopia a 2 fotoni figura sinistra rappresenta la cella prima (A) e dopo (B) la comparsa di un evento esocitica (freccia) in risposta a 15 mM stimolazione di glucosio.. (C) illustra l'etichettatura SRB con l'entrata del colorante SRB extracellulare nel granulo quando fonde con la membrana plasmatica. (D) mostra l'intensità di fluorescenza su una regione di interesse di un evento esocitica nonché la sequentiaimmagini di questo evento l esocitica (scala bar 1 micron). Immagine modificata da Do et al 2014 7. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6:. Le risposte di tipo selvatico e diabetici isolotti db / db al microscopio 2 fotoni con SRB come il colorante extracellulare In questi eventi granello di fusione esperimenti di insulina in risposta alla stimolazione glucosio 15mm vengono registrati. Cerchi gialli sono luoghi degli eventi esocitosi durante 20 minuti di registrazione. Immagine modificata da Do et al 2014 7.
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Discussion
Il fattore più critico nell'isolamento isolotto è la perfusione iniziale del pancreas; un sotto perfuso pancreas risultati in una resa isolotto notevolmente inferiore. Altri fattori influenzano anche la qualità di isolamento, come il tempo di digestione e il livello di agitazione che potrebbe in parte compensare il livello di perfusione. Ad esempio, un pancreas pienamente perfuso dovrà essere incubate a 37 ° C per ~ 18 min 30 sec agitatore, al contrario un sotto digerito pancreas possono richiedere ~ 20 min digestione difficile con agitazione. La miscela di due enzimi digestivi nelle nostre mani fornisce una migliore isolamento delle isole di solo uno dei due. Per la collagenasi unico metodo, il tempo di digestione influenza criticamente la resa isolotto e differenze di tempo di soli 30 secondi possono influenzare notevolmente la qualità. Per liberase soltanto, la resa è accettabile, ma sotto-digestione volte succede, riteniamo che l'aggiunta di collagenasi aiuta a digerire il tessuto connettivo meglio.
Ci sono un certo numero di esperimenti possibili che possono essere eseguite dopo gli isolotti sono stati isolati. Isolato isole possono essere fissati in paraformaldeide o metanolo immediatamente dopo l'isolamento e utilizzati in immunofluorescenza per determinare la posizione di proteine di interesse 10. Isolate isole possono essere disperse in cellule singole. Questo può essere fatto nello stesso giorno di isolamento delle isole o dopo alcuni giorni di coltura isolotto. Le singole cellule sono poi placcati fuori ed è questa preparazione che è stato il pilastro per tecniche come patch clamp e totale microscopia a riflessione interna. Negli esperimenti che misuranola secrezione di insulina, così come per live-cell immagini 2-photon, abbiamo trovato che le isole richiedono 2 giorni di coltura in modo da fornire dati riproducibili. Quello che sta accadendo nella cultura non è ben compreso, ma è pensato per essere un periodo di ripresa del processo di isolamento e la digestione.
La tecnica 2 fotoni presentato qui permette ai ricercatori di immagine del processo di secrezione di insulina, a livello dei singoli fusione dei granuli da molte cellule all'interno isolette intatte. Abbiamo scoperto che il numero di eventi granuli di fusione e il loro calendario è in linea con gli importi e del profilo temporale della secrezione di insulina 8. Questo suggerisce il metodo rileva la maggioranza degli eventi di fusione dell'insulina granuli. Dato che l'ingresso in tintura ai granuli di fusione non è un metodo specifico per la rilevazione di insulina eventi di fusione dei granuli che abbiamo fatto di tutto per condurre esperimenti di controllo per dimostrare che la fusione di insulina granello in cellule beta sono allo studio 7,8
Ci sono una serie di problemi tecnici con il microscopio a 2 fotoni che sono generici per tutti gli approcci di imaging. Ad esempio, bilanciamo attentamente i fattori opposti di cercare di ottenere abbastanza luce per le isole in modo da poter ridurre il guadagno dei rivelatori, e di conseguenza ridurre il rumore, con la messa tanta luce per le isole che causare danni alle cellule. Nel nostro sistema, una cella di Pockels viene utilizzato per attenuare il laser pulsato (Figura 3); tutti i sistemi commerciali hanno meccanismi per alterare l'intensità della luce che cade sul campione.
In sintesi, la combinazione di un attento isolamento di db / db isolotti e tutto-isolotto microscopia 2 fotone presentano nuove opportunità per studiare i processi di secrezione di insulina e determinano gli elementi chiave difettosi nel diabete di tipo 2.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TL 5 mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
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