Lepr<sup> Db</sup> Mus Model af type 2 diabetes: Pancreas Islet Isolering og live-cell 2-Photon Imaging af intakte Islets
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
Type 2-diabetes er en kronisk sygdom, der påvirker 382 mio mennesker i 2013, og forventes at stige til 592 millioner i 2035 1. I løbet af de sidste 2 årtier, rolle beta-celle dysfunktion hos type 2-diabetes har klart fastslået 2. Forskning fremskridt har krævet metoder til isolering af Langerhanske øer. Protokollen af holmen isolation præsenteres her deler mange fælles skridt med protokoller fra andre grupper, med nogle ændringer for at forbedre udbyttet og kvaliteten af isolerede øer fra både vildtype og diabetisk Lepr db (db / db) mus. En live-cell 2-foton imaging metode er da præsenteret som kan anvendes til at undersøge kontrollen med insulinsekretion inden øer.
Introduction
Den rolle, som beta-celle dysfunktion i sygdom er blevet bredt anerkendt 3,4. Cellelinjer såsom MIN6 og INS-1 er nyttige værktøjer til at forstå biologi beta celle adfærd. Men den fysiologiske kontrol af insulinsekretion finder sted inden for de Langerhanske øer. Disse øer indeholder tusinder af tætpakket betaceller, samt blodkar og andre endokrine celletyper. Dette miljø inden holmen påvirker insulinsekretion og vil sandsynligvis være vigtigt i diabetes. Derfor, for at forstå den fysiologiske kontrol af insulinsekretion, og patofysiologien af sygdom, er det vigtigt at studere intakte øer.
Islet isolation
Levende menneskelige holme og især humane øer fra type 2-diabetikere er vanskelige at opnå. Desuden humane øer har begrænsede muligheder for eksperimentel molekylær manipulation. Forskere har derfor anvendes, erlader fra dyr og dyremodeller af type 2-diabetes. En sådan sygdomsmodel er db / db mus. Dette er en spontan mutation, modeller type 2-diabetes med en fænotype progression, der nøje paralleller human sygdom 5,6. Protokollen præsenteres her for holm isolation fra diabetiske db / db-mus har mange trin til fælles med andre grupper med nogle justeringer for bedre udbytte, rensning og forbedret ø overlevelse.
2 foton billedbehandling
Den levende celle 2-foton-assayet beskrevet her giver forskere at kvantificere antallet og evaluere egenskaberne af enkelt insulin-holdige granuler fra mange celler af diabetisk 7 og vildtype holme 8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest kritiske faktor i islet isolation er den oprindelige perfusion af pancreas; en under perfunderet bugspytkirtel resulterer i et betydeligt lavere ø-udbytte. Andre faktorer påvirker også isolation kvalitet, såsom fordøjelse tid og niveauet for omrystning som dels kunne kompensere for niveauet af perfusion. For eksempel vil en fuldt perfunderet pancreas skal inkuberes ved 37 ° C i ~ 18 min 30 sek mens forsigtig omrystning i modsætning en under fordøjet bugspytkirtlen kan kræve ~ 20 min fordøjelse med hå…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
