Lepr<sup> Db</sup> Mus Modell av Type 2 Diabetes: Bukspyttkjertel Islet Isolasjon og Live-celle 2-Photon Imaging av intakte holmer
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
Type 2-diabetes er en kronisk sykdom som rammer 382 millioner mennesker i 2013, og ventes å stige til 592 millioner i 2035 1. I løpet av de siste to tiårene, rollen beta-celle dysfunksjon ved type 2 diabetes har blitt klart etablert to. Forskning fremskritt har krevd fremgangsmåter for isolering av Langerhans øyer. Protokollen fra holmen isolasjon presenteres her deler mange vanlige fremgangsmåten med protokoller fra andre grupper, med noen endringer for å forbedre utbyttet og kvaliteten på isolerte øyer fra både villtype og diabetisk Lepr db (db / db) mus. En levende celle-2-foton avbildningsmetode blir deretter presentert som kan brukes til å undersøke regulering av insulinsekresjon innenfor holmer.
Introduction
Rollen som beta-celle dysfunksjon i sykdommen har blitt anerkjent 3,4. Cellelinjer som MIN6 og INS-1 er nyttige verktøy for å forstå biologien til beta celle atferd. Imidlertid tar den fysiologiske regulering av insulinsekresjon sted innenfor de Langerhanske øyer. Disse øyer inneholder tusenvis av tettpakkede beta-celler, så vel som blodkar og andre endokrine celletyper. Dette miljøet innenfor holmen påvirker insulinsekresjon og vil trolig være viktig i diabetes. Derfor, for å forstå den fysiologiske regulering av insulinsekresjon, og patofysiologien av sykdommen, er det viktig å studere intakte øyer.
Holme isolasjon
Levende menneskelige holmer og i særdeleshet menneskelige holmer fra type 2 diabetes pasienter er vanskelig å skaffe. I tillegg menneskelige holmer har begrensede muligheter for eksperimentell molekylær manipulasjon. Forskere har derfor ansatt erlar fra dyr og dyremodeller av type 2 diabetes. En slik sykdomsmodell er den db / db mus. Dette er en spontan mutasjon som modeller type 2 diabetes med en fenotype progresjon som tett paralleller menneskelig sykdom 5,6. Protokollen presenteres her for holme isolasjon fra diabetiske db / db mus har mange trinn felles med andre grupper med noen avgrensninger for bedre avkastning, rensing og forbedret holme overlevelse.
2 foton bildebehandling
Live-celle to-foton analysen beskrevet her gjør at forskere å kvantifisere antall og vurdere egenskapene til enkeltinsulinholdige partikler fra mange celler av diabetiker 7 og villtype holmer 8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest kritiske faktoren i holmen isolasjon er den første perfusjon i bukspyttkjertelen; en under perfusert bukspyttkjertel resulterer i en betydelig lavere holme utbytte. Andre faktorer som også påvirker isolasjonskvaliteten slik som koketiden og graden av rystelsene som delvis kunne kompensere for nivået av perfusjon. For eksempel vil en fullt perfusert bukspyttkjertel må inkuberes ved 37 ° C i ~ 18 minutter 30 sekunder under forsiktig rysting, i motsetning til en under spaltet bukspyttkjertel kan kreve ~ 20 m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
