Lepr<sup> ДБ</sup> Мышь Модель сахарного диабета 2 типа: поджелудочной Островок изоляции и живых клеток 2-Фотон изображений интактных островков
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
Сахарный диабет 2 типа является хроническим заболеванием, поражающим 382 млн человек в 2013 году, и, как ожидается, возрастет до 592 млн к 2035 году 1. В течение последних 2 лет, роль дисфункции бета-клеток при диабете 2 типа был четко определен 2. Исследования прогресс требуется методов выделения панкреатических островков. Протокол выделения островков, представленные здесь много общих шагов с протоколами от других групп, с некоторыми изменениями, чтобы улучшить урожайность и качество отдельных островков как из дикого типа и диабетической Lepr дБ (дБ / дБ) мышей. Способ визуализации 2-фотонов живых клеток затем представлены, которые могут быть использованы для исследования контроль секреции инсулина в течение островков.
Introduction
Роль дисфункции бета-клеток при болезни была широко признана 3,4. Клеточные линии, такие как MIN6 и INS-1 являются полезными инструментами, чтобы понять биологию поведения бета-клеток. Тем не менее, физиологический контроль секреции инсулина происходит в островках Лангерганса. Эти островки содержат тысячи плотно упакованных бета-клеток, а также кровеносные сосуды и другие эндокринные типы клеток. Эта среда в островок влияет секрецию инсулина и, вероятно, будет важным при диабете. Поэтому, чтобы понять физиологический контроль секреции инсулина и патофизиологии болезни, важно, чтобы изучить интактные островки.
Изоляция Островок
Живые человеческие островки и, в частности, человека островков от пациентов с диабетом типа 2 трудно получить. Кроме того, человека островки имеют ограниченные возможности для экспериментального молекулярной манипуляции. Исследователи поэтому используется впозволяет от животных и животных моделях диабета 2 типа. Одной из таких моделей болезнь дБ / дБ мыши. Это спонтанных мутаций, что модели сахарного диабета 2 типа с прогрессированием фенотипа, что тесно параллели болезни человека 5,6. Протокол, представленные здесь для изоляции островок с сахарным диабетом дБ / дБ мышей имеет много шагов, общих с другими группами с некоторыми уточнениями для лучшего урожая, очистки и расширения выживания островков.
Изображения 2 фотона
Живых клеток 2-фотон анализа, описанного здесь позволяет исследователям определить число и оценить характеристики отдельных инсулина гранул, содержащих от многих клетках диабетическая 7 и дикого типа островков 8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важным фактором в изоляции островков является начальным перфузии поджелудочной железы; под перфузии поджелудочной железы приводит к значительно более низким выходом островков. Другие факторы также влияют на качество изоляции, таких как время варки и уровнем встряхивании, к?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
