Lepr<sup> Db</sup> Musmodell av typ 2-diabetes: Pancreatic Islet Isolering och Live-cell 2-Photon Imaging av intakt cellöar
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
Typ 2-diabetes är en kronisk sjukdom som drabbar 382 miljoner människor under 2013, och förväntas stiga till 592 MSEK år 2035 1. Under de senaste två decennierna, roll betacellfunktion vid typ 2-diabetes har tydligt etablerat 2. Forskning framsteg har krävs metoder för isolering av pankreatiska cellöar. Protokollet av holmen isolering presenteras här delar många gemensamma steg med protokoll från andra grupper, med vissa ändringar för att förbättra avkastningen och kvaliteten på isolerade öar från både vildtypen och diabetes Lepr db (db / db) möss. En live-cell 2-fotonen avbildningsmetod presenteras sedan som kan användas för att undersöka kontrollen av insulinutsöndring inom holmar.
Introduction
Rollen av betacellfunktion i sjukdom har allmänt erkänd 3,4. Cellinjer som MIN6 och INS-1 är användbara verktyg för att förstå biologi betacellbeteende. Men den fysiologiska kontrollen av insulinutsöndring sker inom Langerhanska öarna. Dessa öar innehåller tusentals tätt packade betaceller, såväl som blodkärlen och andra endokrina celltyper. Denna miljö inom holmen påverkar insulinutsöndring och kommer sannolikt att vara viktig vid diabetes. Därför att förstå den fysiologiska kontrollen av insulinutsöndring, och patofysiologi sjukdom är det viktigt att studera intakta öar.
Islet isolering
Live humana öar och, i synnerhet, humana öar från typ 2-diabetespatienter är svåra att få tag på. Dessutom, mänskliga holmar har begränsade möjligheter till experimentell molekyl manipulation. Forskare har därför används ärlåter från djur och djurmodeller för typ 2-diabetes. En sådan modell sjukdom är db / db-mus. Detta är en spontan mutation som modeller typ 2-diabetes med en fenotyp progression som nära paralleller mänskliga sjukdomar 5,6. Protokollet presenteras här för holme isolering från diabetiska db / db möss har många steg i likhet med andra grupper med vissa förbättringar för bättre avkastning, rening och ökad holme överlevnad.
2 fotonavbildning
Den levande cell 2-fotonen analysen beskrivs här gör det möjligt för forskare att kvantifiera antalet och utvärdera egenskaperna hos enskilda insulininnehållande granulat från många celler av diabetiker 7 och vildtyp cellöar 8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest kritiska faktorn i holmen isolering är den initiala perfusion av bukspottkörteln; en under perfusion pankreasresulterar i en betydligt lägre holme avkastning. Andra faktorer påverkar också isolerings beskaffade uppslutningstiden och nivån av skakning vilket delvis kan kompensera för den nivå av perfusionen. Till exempel kommer ett fullt perfusion bukspottkörtel måste inkuberas vid 37 ° C under ~ 18 min 30 sek under omskakning försiktigt, i motsats en under digere bukspottkörteln kan kräva ~ 20 min…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
