We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Tip 2 diyabet 2013 yılında 382 milyon kişiyi etkileyen kronik bir hastalıktır, ve, son 2 yıl boyunca. 2035 1 ile 592.000.000 açıkça 2 kurulmuştur tip 2 diyabette beta hücre disfonksiyonu rolünü artması bekleniyor. Araştırma ilerleme pankreas adacık izolasyonu için yöntemler gerektirmiştir. Adacık izolasyon protokolü yabani tip ve diyabetik Lepr db (db / db) fareler, hem izole adacıklar verim ve kalitesini artırmak için bazı değişikliklerle, hisseleri burada diğer gruplardan protokolleri ile birçok ortak adımlar sundu. Bir canlı hücre 2-foton görüntüleme yöntemi, daha sonra adacıklara olan insülin salgılanmasının kontrol araştırmak için kullanılabileceğini sunulmuştur.
hastalıkta p-hücresi işlev bozukluğu rolü yaygın 3,4 kabul edilmiştir. Böyle MIN6 ve INS-1 gibi hücre hatları beta hücre davranış biyolojisinin anlaşılmasında yararlı araçlardır. Bununla birlikte, insülin salgılanmasının fizyolojik kontrol Langerhans adacıklarında içinde yer alır. Bu adacıklar sıkıca paketlenmiş beta hücreleri binlerce yanı sıra kan damarları ve diğer endokrin hücre tiplerini içerir. Adacık içinde bu ortam insülin salgılanmasını etkiler ve diyabette önemli olması muhtemeldir. Bu nedenle, insülin sekresyonunun fizyolojik kontrol ve hastalığın patofizyolojisi anlamak için, sağlam adacıklar çalışma gereklidir.
Adacık izolasyonu
Tip 2 diyabetli hastaların özellikle insan adacıklarında Canlı insan adacık ve elde etmek güçtür. Buna ek olarak, insan adacıklar deneysel moleküler manipülasyon için kısıtlı imkanları vardır. Araştırmacılar bu nedenle kullanılan adresHayvanlar ve tip 2 diyabet hayvan modellerinden sağlar. Böyle bir hastalık modeli, db / db faredir. Bu modeller yakından insan hastalığı 5,6 paralellikler bir fenotip ilerlemesi ile tip 2 diyabete kendiliğinden mutasyon olduğunu. diyabetik db / db farelerde adacık izolasyonu için burada sunulan protokol daha iyi verim, saflaştırma ve gelişmiş adacık hayatta kalmak için bazı iyileştirmeler ile diğer gruplarla ortak birçok adım vardır.
2 foton görüntüleme
Burada anlatılan canlı hücre 2-foton tahlil sayısını ölçmek ve 7 ve yabani tip diyabetik 8,9 adacıklar birçok hücrelerinden insülin tek içeren granüllerin özelliklerini değerlendirmek için araştırmacılar sağlar.
adacık izolasyonu en kritik faktör pankreasın ilk perfüzyon ise; Bir altında oldukça düşük adacık verim pankreas sonuçları perfüze. Diğer faktörler de bu sindirim zaman ve kısmen perfüzyon seviyesinin telafi olabilir çalkalama düzeyi gibi izolasyon kalitesini etkiler. Örneğin, tam olarak perfüze pankreas hafifçe çalkalama sırasında bir küçük pankreas daha çalkalanarak ~ 20 dakika sindirim gerektirebilir sindirilmiş aksine, 18 dakika, 30 saniye ~ 37 ° C'de inkübe edilmesi gerekecektir…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |