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Neuroscience

बरकरार neuroepithelium में माउस घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स के छिद्रित पैच दबाना रिकॉर्डिंग: एक की पहचान odorant रिसेप्टर व्यक्त न्यूरॉन्स की कार्यात्मक विश्लेषण

doi: 10.3791/52652 Published: July 13, 2015

Abstract

विशिष्ट ligands के साथ जब उत्तेजित घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स की शारीरिक प्रतिक्रियाओं (OSN) का विश्लेषण करना घ्राण संचालित व्यवहार और उनके मॉडुलन के आधार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। ये कोडिंग गुण गंध अणु और घ्राण रिसेप्टर (या) के बीच प्रारंभिक बातचीत पर भारी निर्भर OSNs में व्यक्त की है। व्यक्त या आलोचना कर रहे हैं की पहचान, विशिष्टता और ligand स्पेक्ट्रम। या की लिगेंड खोजने के लिए संभावना उपकला भीतर बेतरतीब ढंग से चुनी एक OSN में बहुत कम है व्यक्त की है। इस चुनौती का पता करने के लिए, इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से परिभाषित अन्य रैंकों के प्रमोटर के नियंत्रण के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP व्यक्त की गईं चूहों का उपयोग करता है। OSNs पड़ोसी कोशिकाओं को अपनी परिपक्वता और समारोह को प्रभावित करने के साथ, नाक गुहा की परत एक तंग और संगठित उपकला में स्थित हैं। यहाँ हम OSNs ई के गुणों को एक अक्षुण्ण घ्राण उपकला अलग करने और पैच दबाना रिकॉर्डिंग के माध्यम से रिकॉर्ड करने के लिए एक विधि का वर्णनपरिभाषित odorant रिसेप्टर्स xpressing। प्रोटोकॉल पड़ोसी ऊतक के प्रभाव रखते हुए एक OSN झिल्ली गुण चिह्नित करने के लिए अनुमति देता है। पैच दबाना परिणामों के विश्लेषण लिगेंड / या बातचीत, पारगमन रास्ते और औषध विज्ञान, OSNs 'कोडिंग के गुण और झिल्ली स्तर पर अपनी मॉडुलन का एक सटीक मात्रा का ठहराव अर्जित करता है।

Introduction

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घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स (OSN) घ्राण धारणा का पहला कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृन्तकों में नाक गुहा अस्तर घ्राण उपकला में स्थित है, वे मस्तिष्क के लिए अपने अक्षतंतु के माध्यम से भेजा कार्रवाई क्षमता में odorants की रासायनिक जानकारी बदलना। बेहतर घ्राण कोडिंग तंत्र को समझने के लिए, यह OSNs के पारगमन और झिल्ली गुण चिह्नित करने के लिए आवश्यक है। अभी हाल तक, स्तनधारी OSNs के गुणों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक का सबसे अलग OSNs 1-4 पर बाहर किए गए। पृथक्करण की प्रक्रिया अपने वातावरण से OSNs मुक्त करने के लिए विभिन्न यांत्रिक और रासायनिक (यानी, एंजाइम) प्रक्रियाओं का उपयोग करता है। इन प्रक्रियाओं रिकॉर्डिंग के लिए उपलब्ध कोशिकाओं की कम संख्या को प्रेरित। यह कम संख्या GFP के लेबल की कोशिकाओं के मामले में और भी अधिक महत्वपूर्ण हो सकता है। हदबंदी भी OSNs और surviv वृद्धि कर सकते हैं कि घ्राण उपकला के अन्य कोशिकाओं के बीच स्थानीय सेल करने वाली सेल बातचीत को हटाअल और OSNs 'गुण के मॉडुलन। हदबंदी प्रक्रिया को बायपास करने के लिए, एक अक्षुण्ण तैयारी 5 विकसित किया गया था।

प्रत्येक OSN एक बड़ी बहुजीनीय परिवार 6 से चयनित (या) एक घ्राण रिसेप्टर व्यक्त करता है। माउस में मुख्य घ्राण उपकला में व्यक्त 1,000 अन्य रैंकों ~ कर रहे हैं। कारण जंगली प्रकार के पशुओं में या की बड़ी संख्या के लिए, संभावना है कि एक ही व्यक्त OSNs रिकॉर्ड या बहुत कम कर रहे हैं करने के लिए। इन सीमाओं को पार करने के लिए, जीन लक्षित चूहों उपलब्ध हैं जिसमें एक की पहचान या एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन 7-9 के साथ लेबल रहे व्यक्त सभी OSNs। ये लेबल वाले OSNs अलग तैयारियाँ पहले उल्लेख किया है कमियों के साथ 7,10,11 में कार्यात्मक विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। आनुवंशिक रूप से लेबल चूहों से एक अक्षुण्ण उपकला तैयारी 5 इसलिए इन मुद्दों पर गतिरोध उत्पन्न। यह छठी में करीब के रूप में एक ऐसे वातावरण में ठीक से परिभाषित अन्य रैंकों व्यक्त OSNs की गतिविधि की निगरानी की अनुमति देता हैसंभव के रूप में VO। इसके अलावा, OSNs का पैच दबाना रिकॉर्डिंग भी झिल्ली गुण, पारगमन मार्ग औषध विज्ञान, लिगेंड / या बातचीत की सटीक विश्लेषण अनुमति देते हैं। इन सभी विषयों को शायद ही कोशिकी रिकॉर्डिंग का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है। हम odorant रिसेप्टर्स SR1 और MOR23 12,13 व्यक्त OSNs की प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया। तकनीक की व्यवहार्यता न्यूरॉन्स 15,16 व्यक्त OSNs 14 व्यक्त MOR23 पर अन्य समूहों के साथ ही पर अन्य अन्य रैंकों द्वारा पुष्टि की गई। OSNs का एक परिभाषित आबादी की निगरानी 17 उम्र बढ़ने, इस तरह के विकास 14 के रूप में कई अलग अलग संदर्भों में उनके गुणों का विश्लेषण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, odorant प्रेरित प्लास्टिसिटी 18, और 15 कोडिंग गंध में odorant रिसेप्टर के अनुक्रम में बदलाव की भूमिका। इस प्रोटोकॉल के इस प्रकार झिल्ली स्तर पर निर्धारित OSNs के कार्यात्मक संपत्तियों की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।

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Protocol

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इस प्रोटोकॉल Université de Bourgogne के जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों के बाद और Université de Bourgogne आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. पशु

  1. जैक्सन प्रयोगशाला में उपलब्ध अनुवांशिक इंजीनियर या IRES-tauGFP चूहों का उपयोग करें। इन चूहों घ्राण प्रणाली 19 के अक्षतंतु लक्ष्य-निर्धारण और विकास का विश्लेषण करने के क्रम में डॉ पीटर Mombaerts 'प्रयोगशाला में विकसित किए गए। उदाहरण के लिए, MOR23-IRES-tauGFP लाइन, शेयर संख्या 006,643, सरकारी तनाव नाम बी -6 भालू, 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; इसी तरह, SR1-IRES-tauGFP लाइन, शेयर संख्या 6717 आधिकारिक नाम बी -6 भालू, 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ।
  2. जानवरों की उम्र के बारे में: प्रोटोकॉल का एक बेहतर परिणाम के लिए, उम्र के 2 और 4 सप्ताह के बीच जानवरों का उपयोग करें। इस आयु वर्ग में, विच्छेदन आसान (नरम हड्डियों, मजबूत घ्राण उपकला) और वृक्ष के समान knobs के द्विवार्षिक हैंgger बड़े जानवरों की तुलना करें।

इलेक्ट्रोड और समाधान की 2. तैयारी

  1. उत्तेजक pipettes के लिए: खरीद pipettes उत्तेजक prepulled। अन्यथा, स्वयं उन्हें तैयार करते हैं।
    1. एक लौ का उपयोग करना, टिप से लगभग 1 सेमी से कम छह 1 मिमी कांच pipettes मोड़। एक सुराख़ से मजबूत बनाने के लिए 1.5 सेमी गर्मी हटना टयूबिंग में इन छह pipettes के साथ साथ एक सीधे 7 वें डालें।
    2. हीट एक साथ संलग्न बैरल बनाए रखने के लिए ट्यूबिंग हटना। बैरल के दूसरे छोर के लिए एक अतिरिक्त गर्मी टयूबिंग हटना संलग्न। एक मल्टी बैरल खींचने के साथ इस उत्तेजक पिपेट खींचो।
    3. Bended सुझावों को मजबूत करने के सुराख़ के आसपास कुछ सफेद तरल गोंद जोड़ें। शुष्क हे / एन करते हैं।
  2. सामान्य घंटी कोशिकी समाधान के 1 या 2 एल तैयार (मिमी में: NaCl 124, KCl 3, MgSO 4 1.3, 2 CaCl 2, 3 NaHCO 26, नाह 2 पीओ 4 1.25, ग्लूकोज 15, पीएच 7.6 और 305 mOsm)। 4 डिग्री सेल्सियस पर रखेंउपयोग करें जब तक।
  3. (मिमी में) इंट्रासेल्युलर शेयर समाधान तैयार: KCl 70, KOH के 53, methanesulfonic एसिड 30, EGTA 5, HEPES के 10, सूक्रोज 70; पीएच 7.2 (KOH) और 310 mOsm। उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। कई हफ्तों के लिए अच्छा है।
  4. प्रयोग से पहले (अंतिम क्षण में) बिना तैयारी किए हुए Nystatin साथ intracellular रिकॉर्डिंग समाधान तैयार है।
    1. DMSO के 50 μl जोड़ें, Nystatin के 3 मिलीग्राम वजन; पूरी तरह पतला तक भंवर 20 सेकंड फिर 2-3 मिनट के sonicate।
    2. इंट्रासेल्युलर शेयर समाधान के 5 मिलीलीटर में DMSO के-Nystatin समाधान के 20 μl जोड़ें। भंवर 20 सेकंड है, तो 3 मिनट sonicate। 4 डिग्री सेल्सियस पर इस समाधान रखें और प्रत्यक्ष प्रकाश से बचाने, Nystatin प्रकाश के प्रति संवेदनशील है। यह समाधान कुछ घंटों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हर दिन बदलें।
    3. घ्राण उपकला तैयारी खुर्दबीन के नीचे है एक बार, इलेक्ट्रोड को भरने के लिए एक लौ-लम्बी पीले टिप के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में इस समाधान से कुछ लेना; प्रत्यक्ष प्रकाश से रक्षा करते हैं। आरटी पर, Nystatin समाधान एक बारस्थिर नहीं है; हर घंटे सिरिंज या बर्फ में रख एमएल 1 में समाधान की जगह।
  5. आंतरिक Nystatin समाधान के साथ 15-20 MΩ के प्रतिरोध के साथ लंबी गर्दन और छोटे टिप (~ 2 माइक्रोन) प्राप्त करने के लिए एक खींचने के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड खींचो।
  6. धूआं हुड के नीचे DMSO में 0.5 एम पर odorant समाधान तैयार है; विभाज्य और उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं। वांछित एकाग्रता जब तक घंटी समाधान में odorant पतला। उत्तेजक विंदुक भरें।

घ्राण उपकला 3. तैयारी

नोट: या IRES-tauGFP चूहों या प्रमोटर के नियंत्रण के तहत tauGFP व्यक्त करते हैं। इन चूहों में, ब्याज या व्यक्त सभी न्यूरॉन्स GFP के साथ लेबल रहे हैं। इस प्रोटोकॉल के सभी क्षेत्रों में व्यक्त अन्य रैंकों के लिए अनुकूलित है। हालांकि, dissections और रिकॉर्डिंग पृष्ठीय क्षेत्र में व्यक्त अन्य रैंकों के लिए आसान कर रहे हैं।

  1. Ketamine और xylazine (150 मिलीग्राम / किग्रा और 10 मिलीग्राम / किग्रा बीओडी का मिश्रण इंजेक्शन द्वारा पशु anesthetizeY वजन, क्रमशः)। कत्ल युवा चूहों के लिए या बड़े चूहों के लिए एक ठीक से बनाए रखा कृंतक गिलोटिन के साथ तेज कैंची के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है।
    1. का प्रयोग अंगूठी विदारक कैंची पृष्ठीय त्वचा के माध्यम से एक अनुदैर्ध्य औसत दर्जे का चीरा बनाते हैं। यह अलग खींच द्वारा त्वचा निकालें। कैंची का प्रयोग, संयुक्त जबड़े पर निचले जबड़े में कटौती। दांतों के लिए एक राज्याभिषेक कटौती समानांतर द्वारा ऊपरी सामने दांत निकाल दें।
    2. आंखों के पीछे सिर के राज्याभिषेक कटौती करें और सिर के केवल पूर्वकाल हिस्सा रहते हैं। दायरे के तहत विच्छेदन के लिए ठंडा घंटी समाधान में डुबकी।
  2. दायरे के तहत काटना: उदर पक्ष में, ऊपरी जबड़े / दांत के साथ एक अनुदैर्ध्य काट कर। नाक गुहा की Dorso-पार्श्व की ओर निम्न, अनुलंबीय पृष्ठीय हड्डियों काटें। सबसे हड्डियों और तालू निकालें; आरटी पर ऑक्सीजन घंटी में इसे से जुड़ी पट और उपकला हस्तांतरण।
  3. अंतिम विच्छेदन के लिए: राइट रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहलेसत्र, संदंश के साथ अंतर्निहित पट से उपकला दूर छील। संदंश के साथ और आसंजन मजबूत है जहां पट के पूर्वकाल भाग में दो 4-5 मिमी कैंची कटौती (प्रयोग microvannas कैंची) के साथ उपकला को अलग करें।
    1. ध्यान से सेप्टल उपकला करने के लिए अपने पृष्ठीय कनेक्शन के साथ इसे बाहर काटने से vomeronasal अंग को हटा दें। सामना करना पड़ रहा बलगम परत के साथ एक रिकॉर्डिंग कक्ष उपकला स्थानांतरण; वीणा के साथ कक्ष में फ्लैट इसे रख लो।
  4. प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी और एक संवेदनशील कैमरे से लैस एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के नीचे कक्ष स्थापित करें। एक 40x पानी विसर्जन उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर 0.8) और एक आवर्धक लेंस के द्वारा प्राप्त एक अतिरिक्त 2x या 4x बढ़ाई के माध्यम से उच्च वृद्धि पर कंप्यूटर स्क्रीन पर तैयारी कल्पना। आरटी पर ऑक्सीजन घंटी (1-2 मिलीग्राम / मिनट) के साथ लगातार छिड़कना।

4. रिकॉर्डिंग सत्र

  1. फ्लोरोसेंट सेल के लिए खोजें: 480 पर तैयारी उत्तेजित530-550 एनएम रेंज में प्रकाश का उत्सर्जन करता है जो EGFP के लिए एनएम,; प्रतिदीप्ति में और उज्ज्वल क्षेत्र के अंतर्गत मज़बूती से दिख रहा है, जो एक वृक्ष के समान घुंडी लक्ष्य।
  2. Nystatin साथ intracellular समाधान के साथ इलेक्ट्रोड भरें; धीरे इलेक्ट्रोड पर दोहन द्वारा बुलबुले को दूर।
  3. इलेक्ट्रोड धारक पर इलेक्ट्रोड डालने पिपेट में सकारात्मक दबाव लागू होते हैं; प्रतिरोध 15-20 MΩ होना चाहिए।
  4. सेल के करीब इलेक्ट्रोड लाओ; प्रतिरोध ~ 40 MΩ में पहुँचता है, सकारात्मक दबाव जारी है और एक gigaseal तक पहुंचने के लिए थोड़ा नकारात्मक दबाव लागू होते हैं।
  5. सील पर पहुंच गया है, एक बार के बारे में -75 एम वी पर झिल्ली क्षमता सेट;
  6. सेल खोला है एक बार, उत्तेजना प्रोटोकॉल, औषधीय उपचार के साथ आगे बढ़ना। एक भी odorant उत्तेजना, रिकॉर्ड सहज गतिविधि के 200-500 मिसे के जवाब मापने के लिए, 500 मिसे के लिए प्रोत्साहित करना और अप करने के लिए 10 सेकंड 13 के लिए सेल की प्रतिक्रिया को मापने। औषधीय उपचार के लिए, पर औषधीय एजेंटों छिड़कनावांछित एकाग्रता 20।

5. डेटा विश्लेषण

  1. बाद के रूप में odorant उत्तेजना द्वारा हासिल की धाराओं का विश्लेषण करें: (मिसे में अधिकतम आयाम का 90% तक पहुँचने के लिए आवश्यक समय,) अधिकतम आयाम, उदय समय, कुल वर्तमान (पीए में वक्र के तहत क्षेत्र), समय के 50% पर (शुरुआत और मिसे में, अधिकतम आयाम के 50% पर प्रतिक्रिया की भरपाई के बीच का समय)।
    1. आकर्षित और हिल समीकरण का उपयोग कर एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र फिट, अलग सांद्रता में (अधिकतम आयाम तक पहुँच) शिखर पारगमन धाराओं का प्रयोग: मैं = आईमैक्स / (1 ​​+ (कश्मीर 1/2 / सी) एन) मैं मौजूदा शिखर का प्रतिनिधित्व करता है, जहां , अधिकतम प्रतिक्रिया के आधे तक पहुँच गया था, जिस पर K1 / 2 एकाग्रता, सी odorant की एकाग्रता और एन हिल गुणांक saturating सांद्रता में अधिकतम प्रतिक्रिया IMAX।
  2. , अधिकतम विध्रुवण के लिए वर्तमान दबाना में tota झिल्ली क्षमता की रिकॉर्डिंग का विश्लेषण करेंएल क्षमता (mVsec में वक्र के तहत क्षेत्र) हासिल; 30 सेकंड के लिए 1 मिनट रिकॉर्डिंग से अधिक रिकॉर्ड सहज spiking गतिविधि; धाराओं (5-10 PA) के इंजेक्शन द्वारा हासिल spikes के माध्यम से रिकॉर्ड excitability के।

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Representative Results

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इस प्रोटोकॉल के परिणाम विच्छेदन की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। इस विच्छेदन चरणों कम (कम से कम 10 मिनट के लिए 15) और (यानी, उपकला के नुकसान से बचने के लिए) स्पष्ट होना चाहिए। चित्रा 1 एक आदर्श तैयारी अलग बढ़ाई स्तरों पर की तरह लग रहा है दिखाता है कि कैसे। उज्ज्वल क्षेत्र के अंतर्गत एक कम बढ़ाई (जैसे कोशिकाओं का समर्थन OSNs की knobs के रूप में) विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से अलग पहचाना (चित्रा 1 ए) कर रहे हैं। उच्चतम बढ़ाई स्तर पर, आम तौर पर 80X 160x के लिए, उज्ज्वल क्षेत्र में, OSNs के वृक्ष के समान knobs के समर्थन कर कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) से स्पष्ट रूप से पहचाने होना चाहिए। फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत, केवल वृक्ष के समान knobs और GFP के लेबल की कोशिकाओं के सिलिया (चित्रा 1C) दिखाई दे रहे हैं। 2 छवियों की तुलना करके, लेबल कोशिकाओं रिकॉर्डिंग पिपेट (चित्रा -1) के साथ संपर्क किया जा सकता है।

विच्छेदन का तापमान इतनाlution और विच्छेदन के समय महत्वपूर्ण हैं। विच्छेदन के पहले भाग में, पट (3.2 करने के लिए खंड 3.1.1) की तैयारी ठंडा समाधान में 5 से 10 मिनट के भीतर जगह ले जाना चाहिए। अंतिम विच्छेदन (3.3) कमरे के तापमान पर कम से कम 5 मिनट पिछले चाहिए। वृक्ष के समान knobs के उपकला की सतह से ऊपर चल रहे हैं, और मृत कोशिकाओं सदृश: मामले में विच्छेदन भी लंबे समय के लिए चली, या विच्छेदन समाधान भी गर्म में प्रदर्शन किया गया था, तैयारी सदा ही तेजी से क्षतिग्रस्त लग रहा है।

एक सील तक पहुँच जाता है और सेल Nystatin के प्रभाव के तहत खुल जाने के बाद ठेठ वोल्टेज gated धाराओं (2A चित्रा) मनाया जा सकता है। आकार और इन धाराओं की विशेषताओं सेल के स्वास्थ्य पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: सील की गुणवत्ता कम हो रही है एक मरते हुए सेल में या तो, इन धाराओं 'आयाम में कमी होगी। वर्तमान दबाना विन्यास के अंतर्गत, कार्रवाई क्षमता या तो अनायास दर्ज किया जा सकता है (चित्रा 2बी) या एक depolarizing वर्तमान (चित्रा -2) के इंजेक्शन के द्वारा। वर्तमान इंजेक्शन द्वारा प्रेरित फायरिंग गुण दर्ज की न्यूरॉन के excitability की विशेषताएँ। अलग OSNs 'जनसंख्या के excitability (शास्त्रीय आवृत्ति और आईएसआई गणना का उपयोग) की तुलना में किया जा सकता है।

अलग odorants और / या odorants के विभिन्न सांद्रता के साथ भरी हुई एक multibarrel पिपेट दबाव इंजेक्शन द्वारा कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस odorant प्रेरित प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए अनुमति देता है। या ब्याज की सेल में व्यक्त पर odorants और सांद्रता उदाहरण के लिए Lyral MOR23, M71 के लिए acetophenone, mOREG के लिए eugenol के लिए लिगेंड है, के आधार पर चुना जाना चाहिए। चित्रा 3 पर सचित्र प्रयोग में, दर्ज की MOR23-IRES-tauEGFP न्यूरॉन्स छवि (वर्तमान दबाना मोड (चित्रा 3) के तहत या वोल्टेज दबाना मोड के तहत, Lyral, MOR23 के लिए एक ligand के विभिन्न सांद्रता के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त कीure 3 बी)। वोल्टेज दबाना मोड रिकॉर्डिंग में, विभिन्न विशेषताओं (-समय वृद्धि, वर्तमान कुल हासिल, आदि।, अधिकतम आयाम) इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में प्रतिष्ठित प्रदर्शन के रूप में प्रतिक्रिया यों के लिए नजर रखी जा सकती है। Odorant प्रेरित प्रतिक्रिया की अधिकतम आयाम का उपयोग करना, खुराक प्रतिक्रिया साजिश रची और हिल समीकरण का उपयोग कर लगाया जा सकता है। पता लगाने दहलीज, अस्थायी गतिशील, गतिशील रेंज और संतृप्ति स्तर: ये परिणाम प्रत्येक OSN की एन्कोडिंग गुणों के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। खुराक प्रतिक्रिया घटता के उदाहरण चित्रा -3 सी पर दिखाए जाते हैं। इन सभी विवरण आबादी के भीतर संभावित विविधता को मापने के लिए अलग-अलग OSNs के बीच तुलना में किया जा सकता है; वे भी साथ या संभावित मॉडुलन और plasticity को मापने के लिए एक इलाज के आवेदन के बिना OSNs के बीच तुलना की जा सकती।

चित्र 1


चित्रा 1: एक स्वस्थ तैयारी के प्रतिनिधि छवियों 40X बढ़ाई उज्ज्वल क्षेत्र शर्त के तहत मनाया एक SR1-IRES-tauGFP ट्रांसजेनिक माउस की नाक गुहा से निकाले (ए) बरकरार घ्राण उपकला।। OSN वृक्ष के समान knobs के (काला तीर सिर) का समर्थन कोशिकाओं (एससी) और बोमन ग्रंथियों (बीजी) के जाल में संलग्न हैं। उज्ज्वल क्षेत्र हालत (सफेद और लाल तीर सिर) के तहत मनाया OSNs व्यक्त SR1 (बी) वृक्ष के समान knobs के। (सी) SR1 व्यक्त OSNs के वृक्ष के समान knobs के दिखा फ्लोरोसेंट रोशनी के नीचे (बी) के रूप में ही क्षेत्र। (डी) उज्ज्वल क्षेत्र के अंतर्गत एक SR1 व्यक्त OSN से आ रिकॉर्डिंग पिपेट। (- डी बी) लाल नोक में एक ही SR1 OSN का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार: 5 माइक्रोन।


चित्रा 2: प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त प्रतिनिधि झिल्ली गुण परिणाम:। 40 झिल्ली से संभावित -67 एम वी depolarizing चरणों में वृद्धि से हासिल एक SR1-IRES-tauGFP OSN के वृक्ष के समान घुंडी पर पैच दबाना रिकॉर्डिंग (ए) वोल्टेज gated धाराओं एम वी। (बी) के वर्तमान दबाना विन्यास में दर्ज की सहज गतिविधि; कार्रवाई क्षमता 15 सेकंड रिकॉर्डिंग युग के दौरान देखा जा सकता है। एक सात पीए उत्तेजक वर्तमान द्वारा हासिल (सी) लड़ाई क्षमता; इस प्रोटोकॉल सेल के excitability के बारे में जानकारी प्रदान करता है।

चित्रा 3A

3B चित्रा


चित्रा 3:। Lyral, MOR23 रिसेप्टर के एक ligand के एक MOR23-IRES-tauEGFP न्यूरॉन में odorant प्रेरित प्रतिक्रियाओं के प्रतिनिधि उदाहरण बढ़ाने से सांद्रता वर्तमान दबाना (ए) में और वोल्टेज दबाना (बी) में दोनों प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने के लिए प्रेरित। झिल्ली क्षमता -67 एम वी पर clamped किया गया था। (सी) हिल समीकरण के साथ acetophenone की सांद्रता में वृद्धि के जवाब में तीन M71 न्यूरॉन्स पर हासिल कर लिया और फिट व्यक्ति खुराक प्रतिक्रिया घटता के उदाहरण हैं।

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Discussion

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सही ढंग से स्वस्थ OSNs के गुण नजर रखने के लिए इस प्रोटोकॉल की क्षमता तैयारी की गुणवत्ता पर काफी निर्भर करता है। इसलिए, विच्छेदन चरणों महत्वपूर्ण हैं। पहले यह गुणवत्ता (पीएच, परासारिता), oxygenation और तापमान (ठंडा लेकिन स्थिर नहीं) विच्छेदन माध्यम के लिए ध्यान देना महत्वपूर्ण है। दूसरा, विदारक उपकरणों के साथ उपकला के हेरफेर के रूप में नुकसान से बचने के लिए संभव के रूप में सीमित किया जाना चाहिए। अंत में, यह संभव के रूप में सबसे बड़ा OSN आबादी की पहुँच के लिए संभव के रूप में फ्लैट एक तैयारी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।

विच्छेदन की गुणवत्ता एक स्वस्थ तैयारी प्राप्त करने के लिए मौलिक है। विच्छेदन पृष्ठीय के लिए यहाँ हम एक उदर मौजूद है, लेकिन कुछ उपयोगकर्ताओं को तेजी से नाक गुहा खुला और घ्राण उपकला के सेप्टल अवकाश के लिए एक तेजी से पहुँच के लिए विच्छेदन पृष्ठीय शुरू करने के लिए पसंद कर सकते हैं: हालांकि, अलग अलग दृष्टिकोण विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रत्येक उपयोगकर्ता इसलिए जनसंपर्क कर सकते हैं अनुकूलरुचि के क्षेत्र की एक स्वस्थ तैयारी तक पहुँचने के लिए सबसे कारगर रणनीति के लिए otocol।

तैयारी खुर्दबीन के नीचे है एक बार, तैयारी के स्वास्थ्य की स्थायी निगरानी की आवश्यकता है। दरअसल, एक अस्वस्थ तैयारी एक gigaseal तक पहुँचने के लिए एक कम संभावना हो जाती है। Gigaseals प्राप्त करने में एक कम क्षमता स्वस्थ OSNs खोजने के लिए तैयारी पर ब्याज के क्षेत्र बदलकर सुधार किया जा सकता है। एक और अधिक कठोर समाधान के लिए एक नया एक के द्वारा पूरी तरह से तैयार करने की जगह है। सील पर पहुंच गया है, एक बार एक कम संभावना "खोला" राज्य जगह नहीं ले सकता तक पहुँचने के लिए। यह आंतरिक समाधान की गुणवत्ता के कारण हो सकता है। आंतरिक समाधान प्रयोग से पहले शीघ्र ही तैयार रहना चाहिए। Nystatin की घुलनशीलता बल्कि कम है क्योंकि भंवर और sonication के उपयोग के लिए महत्वपूर्ण हैं। उद्घाटन की संभावना में सुधार करने के लिए, आंतरिक समाधान फिर से 10 सेकंड के लिए vortexed और फिर 30 से 60 सेकंड के लिए sonicated किया जाना चाहिए। यह अमूमनसहयोगी सेल खोलने की दक्षता में सुधार।

Odorants के साथ दर्ज OSN को प्रोत्साहित करने के लिए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक 7 बैरल उत्तेजक पिपेट का उपयोग करता है। पिपेट इस प्रकार का odorants और / या सात करने के लिए प्रत्येक दर्ज की कोशिकाओं पर परीक्षण odorants की एकाग्रता की संख्या में कमी का तात्पर्य। यह एकाग्रता के 7 प्रवेश इकाइयों को कवर कर सकते हैं के बाद से यह सीमा एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र के मामले में अपेक्षाकृत महत्वपूर्ण नहीं है। हालांकि, अलग odorants जांच की जाती है, जिसमें स्क्रीनिंग प्रयोगों के मामले में, एक सात बैरल पिपेट सीमाएं दिखा सकते हैं। प्रयोगों स्क्रीनिंग में, लक्ष्य एक अनाथ या व्यक्त लेबल वाले OSNs के लिए एक ligand मिल रहा है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग odorant मिश्रण के उपयोग की आवश्यकता होगी। एक प्रतिक्रिया जानने प्रत्येक मिश्रण तो व्यक्तिगत odorants में विभाजित किया जाएगा। इस OSNs 16 व्यक्त TAAR पर एमाइन odorants स्क्रीन करने के लिए किया गया था। इन प्रयोगों में, फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स TAARs व्यक्त की और ligand UNK थाNown। प्रोटोकॉल का प्रयोग, लेखकों मिश्रण में एमाइन odorants के कई दर्जनों स्क्रीन सकता। एक प्रतिक्रिया जानने के मिश्रण तो सबसे कुशल ligand के खोजने के क्रम में एकल odorants करने के लिए नीचे टूट गए थे।

रिकॉर्डिंग साइट और उत्तेजक पिपेट के बीच की दूरी सेल 20 के यांत्रिक उत्तेजना कम करने के लिए बुद्धिमानी से चुना जाना चाहिए। दबाव और / या (20 माइक्रोन से नीचे) भी छोटी दूरी (30 हमारे रिकॉर्डिंग की स्थिति में साई ऊपर) बहुत अधिक है, तो कुछ OSNs में यांत्रिक प्रतिक्रिया भी odorant प्रतिक्रिया मुखौटा कर सकते हैं। Puffing पिपेट और रिकॉर्डिंग साइट के बीच दबाव और दूरी भी उत्तेजना के दौरान समाधान विदेशी मुद्रा नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण हैं। न्यूरॉन तक पहुँचने एकाग्रता पहले से परीक्षण 13 साल की एक श्रृंखला के माध्यम से पिपेट में एकाग्रता पेश करने के लिए संभव के रूप में बंद होने का मूल्यांकन किया गया था। इन परीक्षणों के लिए एक समाधान शुरुआत को मापने के लिए नीले रंग के साथ रंग और टी की भरपाई के लिए इस्तेमाल कियावह उत्तेजना। 20 साई के दबाव और 30 माइक्रोन दूरी का उपयोग करना, उत्तेजना की अधिकतम तीव्रता 300 मिसे के भीतर पहुँच गया था। प्रोत्साहन की भरपाई भी ध्यान से मूल्यांकन किया गया था: तैयारी perfused समाधान के सतत प्रवाह के अधीन है, के बाद से प्रोत्साहन 0.8-0.9 सेकंड 13 के भीतर बाहर धोया था।

OSNs के गुणों कोडिंग गंध ऐतिहासिक विवो में कोशिकी रिकॉर्डिंग के माध्यम से या अलग कक्षों पर प्रयोगों के माध्यम से या तो मापा गया। स्तनधारियों में, बाह्य रिकॉर्डिंग चूहों 21 में vivo में पहली बार में प्रदर्शन किया गया। कोशिकी रिकॉर्डिंग में, या दर्ज सेल में व्यक्त इस प्रकार का परीक्षण odorant का जवाब देने के लिए एक सेल को खोजने के लिए सफलता का अनुपात सीमित अज्ञात है। प्रोटोकॉल उपकला के सेलुलर वातावरण में न्यूरॉन्स में रिकॉर्डिंग और परिभाषित रिसेप्टर्स के लक्षण वर्णन अनुमति देता है। रिसेप्टर्स 'के गुण इसलिए विभिन्न स्तरों पर विश्लेषण किया जा सकता है: विशिष्ट लिगेंडपारगमन मार्ग के पहले चरण के दौरान / या बातचीत; नतीजतन, एगोनिस्ट / परीक्षण किया विविध ligands के प्रतिपक्षी बातचीत; मिश्रण परिभाषित अन्य रैंकों के एकीकरण और OSNs 'विशिष्टता के लिए पारगमन मार्ग की भूमिका के गुणों; उपकला के भीतर (जैसे अंतराल जंक्शन के रूप में) सेल करने वाली सेल बातचीत की घ्राण कोडिंग पर प्रभाव; और अंत में पारगमन मार्ग के मॉडुलन औषधीय एजेंटों का उपयोग करते हुए।

अलग सेल रिकॉर्डिंग में, जैसा कि पहले उल्लेख किया है, हदबंदी प्रक्रिया बलगम और घ्राण उपकला के भीतर सेल करने वाली सेल बातचीत को हटा। इस OSNs की कोडिंग गुणों में परिवर्तन उत्पन्न हो सकता है। अलग कक्षों पर कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों अक्सर सूचित किया गया है। उदाहरण के लिए, M71 acetophenone के जवाब में OSNs व्यक्त की खुराक प्रतिक्रिया घटता 7 सूचित किया गया है। ये खुराक प्रतिक्रिया घटता प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त खुराक प्रतिक्रियाओं घटता से steeper हैंयहां 4 प्रस्तुत किया। इन विसंगतियों के कारण अक्षुण्ण तैयारी में सेल करने वाली सेल बातचीत करने के लिए और भी अलग कक्षों में बलगम को हटाने के लिए हो सकता है। बलगम घ्राण पारगमन 22,23 के लिए मौलिक perireceptor घटनाओं में शामिल कई प्रोटीन और एंजाइम को रोकने के लिए जाना जाता है। प्रोटोकॉल यहां बताया में, घ्राण उपकला की संरचना के संरक्षण और बलगम की ख्यात उपस्थिति OSNs में odorant कोडिंग की देशी सुविधाओं को संरक्षित करने के लिए योगदान करते हैं। प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सांद्रता मोल / एल में संकेत दिया है और आम तौर पर 10 -7 -10 -3 रेंज में हैं। इन सांद्रता हवा-चरणबद्ध रिकॉर्डिंग (या तो स्थानीय क्षेत्र की क्षमता या बाह्य रिकॉर्डिंग में) में इस्तेमाल सांद्रता की तुलना में अधिक है। इन विसंगतियों) मैं की वजह से हो सकता है (और इसलिए) उत्तेजना की रिकॉर्डिंग के तरल चरण और हो सकता द्वितीय) रिकॉर्डिंग के दौरान छिड़काव से बलगम की धीमी वार्शआउट। Muc की वास्तव में, वार्शआउटअमेरिका और विच्छेदन के दौरान OSNs 'axons की अनुभाग प्रस्तुत तैयारी संभवतः एक' छद्म बरकरार "के बजाय एक" पूरी तरह से बरकरार "तैयारी के रूप में योग्य हो कि समर्थन कर सकते हैं। यह तैयारी है, तथापि, संभव के रूप में vivo में के रूप में करीब है और अभी तक जानने की रिकॉर्डिंग शर्तों पैच दबाना रिकॉर्डिंग का प्रतिनिधित्व करता है। एक स्तनधारी जीव से किसी में इन विट्रो तैयारी के रूप में अस्तित्व के समय सीमित रहता है। इस सीमा बलगम की वार्शआउट की वजह से हो सकता है, OSNs 'axons की खंड के रूप में अच्छी तरह से तैयारी के भीतर रक्त परिसंचरण के अभाव।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स की झिल्ली गुण रिकॉर्ड करने के लिए अनुमति देता है। इस तकनीक ऐसी झिल्ली OSNs के गुण, OSNs के औषधीय जांच, OSNs के odorant कोडिंग संपत्तियों की मॉडुलन, और अन्य रैंकों के deorphanization के विश्लेषण के रूप में कई आवेदन किया है सकते हैं। कैल्शियम इमेजिंग के दौरान दर्ज की घटनाओं slo रहे हैंडब्ल्यू और लंबे समय तक चलने। झिल्ली के स्तर पर घ्राण पारगमन मार्ग में तेजी की घटनाओं के बारे में डेटा को वर्तमान प्रोटोकॉल नेतृत्व में पैच दबाना रिकॉर्डिंग।

यहाँ प्रस्तुत रिकॉर्डिंग पैच दबाना विन्यास में प्रदर्शन कर रहे हैं। इस विन्यास में, दर्ज सेल की झिल्ली गुण यह घ्राण पारगमन मार्ग मशीनरी या शामिल वोल्टेज gated धाराओं है, चाहे विश्लेषण किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगों OSNs के गुणों कोडिंग odorant के मॉडुलन के बारे में डेटा प्रदान कर सकते हैं। औषधीय एजेंटों अलग अलग परिस्थितियों में घ्राण पारगमन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: उदाहरण के लिए, MDL12330A, adenylate साइक्लेज तृतीय (ACIII) 24,25 के एक अवरोधक एक odorant जवाब में ACIII की भूमिका की जांच करने के लिए छिड़काव समाधान में लागू किया जा सकता है। साथ ही, इस प्रोटोकॉल <ऐसे घ्राण वातावरण के रूप में कोडिंग के गुण अलग अलग परिस्थितियों में संग्राहक हैं कैसे घ्राण जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसमर्थन> 18 या खिलाने व्यवहार 26 में शामिल हार्मोन के प्रभाव में। अंत में, इस प्रोटोकॉल भी / ligand के संपर्क और परिभाषित अन्य रैंकों पर या यहाँ तक कि बेतरतीब ढंग से चुनी रिसेप्टर्स 27 में एगोनिस्ट / प्रतिपक्षी गतिविधियों का गूढ़ रहस्य या के बारे में डाटा को चुरा सकते हैं।

अंत में, 7 बैरल उत्तेजक पिपेट के कारण सीमाओं के साथ, इस प्रोटोकॉल भी अन्य रैंकों deorphanizing के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इससे पहले, इस मामले में उल्लेख किया है, कई odorant मिश्रण का परीक्षण किया जा सकता है। एक प्रतिक्रिया जानने मिश्रण तो अन्य कोशिकाओं पर परीक्षण व्यक्तिगत odorants में विभाजित किया जाना चाहिए।

परिभाषित अन्य रैंकों व्यक्त OSNs को लक्षित करके, इस प्रोटोकॉल अन्य रैंकों, ligands / अन्य रैंकों बातचीत, पारगमन मार्ग गुणों के बारे में शक्तिशाली डेटा प्रदान करता है और विभिन्न स्थितियों में OSNs की परिभाषित आबादी के गुणों की तुलना करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
vibration table with Faraday cage TMC 63-500 SERIES required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment
optics
microscope Olympus BX51WI upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference
objectives Olympus LUMPLFL40XW at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
magnifier Olympus U-TVCAC ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode
camera Olympus DP72 a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary
filters Olympus/Chroma depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m
amplifier HEKA EPC10 USB monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer
software HEKA Patchmaster controls the amplifier during the experiment
micromanipulator Sutter MP225 precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift
electrode puller Sutter P97 with a FT345-B wide trough filament;  to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution
glass Sutter BF120-69-10 in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets
recording chamber Warner Instruments RC-26G a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.
stimulation
glass WPI TW100F-4 attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes
multibarrel puller MDI PMP-107-Z by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels
precision pressure injector  Toohey Company P/N T25-1-900 Single Channel    this precision pressure injector  controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V  TTLs
micromanipulator Narishige YOU-1 a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site
tubings N/A tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette
solutions/perfusion/chemicals
vacuum pump gardner denver 300 series a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps
perfusion system N/A N/A gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber
nystatin Sigma-Aldrich N3503 mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp
DIMETHYL SULFOXIDE Sigma-Aldrich D5879 used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch 
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 extracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 intracellular/extracellular solution
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 extracellular solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S9638 extracellular solution
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) Sigma-Aldrich 63140 extracellular solution
Glucose Sigma-Aldrich G8270 extracellular solution
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 extracellular solution
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) Sigma-Aldrich E3889 internal solution
Potassium hydroxyde Sigma-Aldrich P1767 internal solution
Methyl Sulfoxide Sigma-Aldrich W387509 intracellular solution
Hepes-Na Sigma-Aldrich H7006 intracellular solution
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 intracellular solution

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References

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बरकरार neuroepithelium में माउस घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स के छिद्रित पैच दबाना रिकॉर्डिंग: एक की पहचान odorant रिसेप्टर व्यक्त न्यूरॉन्स की कार्यात्मक विश्लेषण
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Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor. J. Vis. Exp. (101), e52652, doi:10.3791/52652 (2015).More

Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor. J. Vis. Exp. (101), e52652, doi:10.3791/52652 (2015).

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