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Neuroscience

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

doi: 10.3791/52652 Published: July 13, 2015

Abstract

Analysieren der physiologischen Reaktionen von Riechzellen (OSN), wenn sie mit spezifischen Liganden stimuliert ist kritisch, um die Basis der olfaktorischen getriebenen Verhaltensweisen und deren Modulation zu verstehen. Diese Codierungseigenschaften hängen stark von der anfänglichen Interaktion zwischen Geruchsmolekülen und der Geruchsrezeptor (OR), ausgedrückt in der OSN. Die Identität, Spezifität und Ligandenspektrum der ausdrücklich oder kritisch sind. Die Wahrscheinlichkeit, den Liganden des OR finden Ausdruck in einer nach dem Zufallsprinzip im Epithel gewählt OSN ist sehr gering. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wird in diesem Protokoll genetisch tagged Mäusen das fluoreszierende Protein GFP unter der Kontrolle des Promotors des definierten Randlage zum Ausdruck. OSNs sind in einer engen und organisierte Epithel der Nasenhöhle gelegen, mit Nachbarzellen zu beeinflussen ihre Reifung und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um eine intakte Riechepithel zu isolieren und durch Patch-Clamp-Aufnahmen erfassen die Eigenschaften OSNs expressing definierten Geruchsrezeptoren. Das Protokoll kann eine OSN Membraneigenschaften zu charakterisieren, während der Einfluss der benachbarten Gewebe. Analyse der Patch-Clamp-Ergebnisse ergibt eine präzise Quantifizierung der Ligand / oder Wechselwirkungen, Übertragungswege und Pharmakologie, OSNs "Kodierungseigenschaften und deren Modulation an der Membranebene.

Introduction

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Riechzellen (OSN) stellen den ersten Schritt der Geruchswahrnehmung. Das Hotel liegt im Riechepithel Auskleidung der Nasenhöhle in Nagetieren, verwandeln sie die chemische Informationen von Geruchsstoffen in Aktionspotentiale durch ihre Axon an das Gehirn gesendet. Die Duftverarbeitung Mechanismen besser zu verstehen, ist es notwendig, die Transduktion und Membraneigenschaften OSNs charakterisieren. Bis vor kurzem waren die meisten Techniken verwendet werden, um die Eigenschaften von Säugetier OSNs charakterisieren wurden an dissoziierten OSNs 1-4 durchgeführt. Die Dissoziation Verfahren verwendet verschiedene mechanische und chemische (dh Enzyme) Prozesse, die OSNs aus ihrer Umgebung zu befreien. Diese Prozesse führen zu einer geringen Anzahl von verfügbaren Zellen für Aufzeichnungen. Diese geringe Zahl kann im Fall von GFP markierten Zellen noch kritisch. Dissoziation entfernt auch die lokale Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen OSNs und anderen Zellen des olfaktorischen Epithels surviv erhöhen kannal und Modulation OSNs 'Eigenschaften. Um die Dissoziation Verfahren umgehen, wurde ein intaktes Präparat 5 entwickelt.

Jedes OSN drückt eine Geruchsrezeptor (OR), die aus einer großen Multigenfamilie 6. Es gibt ~ 1.000 OPs im Haupt Riechepithel in der Maus zum Ausdruck gebracht. Aufgrund der großen Anzahl von OR in Wildtyp-Tiere, die Chancen zu OSNs exprimieren denselben Datensatz oder sehr gering sind. Um diese Einschränkungen zu überwinden, sind Gen gerichtet Mäusen vorhanden, in der alle OSNs exprimieren eine bestimmte oder mit einem fluoreszierenden Protein, 7-9 bezeichnet. Diese markierten OSNs wurden verwendet, um Funktionsanalyse in dissoziierten Vorbereitungen 7,10,11 mit den bereits erwähnten Nachteilen zu tun. Ein intaktes Epithel Vorbereitung 5 aus genetisch markierten Mäusen umgeht daher diese Fragen. Es erlaubt die Überwachung der Aktivität des OSNs exprimieren genau definierten ORs in einer Umgebung so dicht in vivo wie möglich. Außerdem Patch-Clamp-Aufnahmen von OSNs erlauben auch genaue Analyse der Membraneigenschaften, Übertragungsweg Pharmakologie, Ligand / oder Wechselwirkungen. Alle diese Themen kaum mit extrazellulären Aufnahmen analysiert werden. Wir nutzten diese Technik, um die Reaktionen der OSNs Expression der Geruchsrezeptoren SR1 und MOR23 12,13 überwachen. Die Machbarkeit der Technik wurde von anderen Gruppen auf MOR23 ausdrücken OSNs 14 sowie auf andere Regionen in äußerster Rand exprimierenden Neuronen 15,16 bestätigt. Die Überwachung eines definierten Population von OSNs können zur Analyse ihrer Eigenschaften in vielen verschiedenen Zusammenhängen wie Entwicklung 14 führen, Alterung 17, Geruchsstoff induzierter Plastizität 18, und die Rolle der Veränderungen in Folge der Geruchsrezeptor in Duftkodierung 15. Dieses Protokoll stellt somit ein leistungsfähiges Werkzeug, um die funktionellen Eigenschaften definiert OSNs an der Membranebene zu überwachen.

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Protocol

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Dieses Protokoll folgt den Tierpflege Richtlinien der Université de Bourgogne und wurde von der Université de Bourgogne Ethikkommission genehmigt.

1. Tiere

  1. Verwenden gentechnisch OR-IRES-tauGFP Mäuse verfügbar am Jackson Laboratory. Diese Mäuse wurden in Dr. Peter Mombaerts 'Labor, um Axon-Targeting und Entwicklung des olfaktorischen Systems 19 Analyse entwickelt. ZB die MOR23-IRES-tauGFP Linie, Fahrzeugnummer 006643, trägt den offiziellen Namen Stamm B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; Auch die SR1-IRES-tauGFP Linie, Fahrzeugnummer 6717 trägt den offiziellen Namen B6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
  2. In Bezug auf das Alter der Tiere: für ein besseres Ergebnis der Protokoll verwenden Tieren zwischen 2 und 4 Wochen alt sind. In dieser Altersgruppe ist die Präparation leichter (weicher Knochen, festere Riechepithel) und die dendritischen Knöpfe sind bigger Vergleich zu älteren Tieren.

2. Herstellung von Elektroden und Lösungen

  1. Für die anregende Pipetten: Kauf prepulled anregende Pipetten. Andernfalls manuell vorzubereiten.
    1. Unter Verwendung einer Flamme, biegen sechs 1 mm Glaspipetten bei etwa 1 cm von der Spitze. Legen Sie diese sechs Pipetten sowie eine gerade 7. in 1,5 cm Schrumpfschlauch zu stärken durch eine Öse.
    2. Schrumpf den Schlauch, um die Fässer miteinander verbunden zu halten. Bringen Sie eine zusätzliche Schrumpfschlauch, um das andere Ende der Fässer. Ziehen Sie diese anregende Pipette mit einem Multi-Barrel Magnet.
    3. Fügen Sie etwas weiß Flüssigkleber rund um die Öse, um die gebogenen Spitzen zu stärken. Trocknen lassen O / N.
  2. Vorbereitung 1 oder 2 L normaler Ringer- extrazelluläre Lösung (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO 4 1.3, CaCl 2 2, NaHCO 3 26, NaH 2 PO 4 1,25, Glucose 15, pH 7,6 und 305 mOsm). Halten bei 4 ° Cbis zur Verwendung.
  3. Vorbereitung intrazellulärem Stammlösung (in mM): KCl 70, KOH 53, Methansulfonsäure 30, EGTA 5, HEPES 10, Saccharose 70; pH 7,2 (KOH) und 310 mOsm. Halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. Gut für mehrere Wochen.
  4. Bereiten intrazellulären Recording-Lösung mit Nystatin aus dem Stegreif (in letzter Minute), bevor Experiment.
    1. Wiegen 3 mg Nystatin, fügen Sie 50 ul DMSO; Wirbel 20 sec beschallen dann 2-3 Minuten, bis vollständig verdünnt.
    2. Mit 20 & mgr; l DMSO-Nystatin-Lösung in 5 ml Stammlösung intrazellulär. Vortex 20 sec, dann 3 min beschallen. Diese Lösung wird bei 4 ° C und vor direktem Licht schützen, ist Nystatin lichtempfindlich. Diese Lösung kann für einige Stunden verwendet werden. Jeden Tag zu ersetzen.
    3. Sobald das Riechepithel Präparat unter dem Mikroskop, nehmen Sie etwas von dieser Lösung in einer 1-ml-Spritze mit einer Flamme und gedehnten gelber Spitze, um die Elektroden zu füllen; vor direktem Licht schützen. Sobald bei RT, der Nystatin-Lösungnicht stabil ist; ersetzen Sie die Lösung in der 1 ml Spritze jede Stunde oder halten Sie es in Eis.
  5. Ziehen Aufzeichnungselektroden mit einer Abziehvorrichtung langen Hals und kleine Spitze (~ 2 & mgr; m) mit einem Widerstand von 15-20 MOhm mit dem internen Nystatin-Lösung zu erhalten.
  6. Bereiten Geruchsstoff-Lösung mit 0,5 M in DMSO unter Abzug; aliquoten bringen und -20 ° C bis zur Verwendung. Verdünnte Riechstoff in Ringer-Lösung, bis die gewünschte Konzentration. Füllen Sie den stimulierenden Pipette.

3. Herstellung von Riechepithel

Hinweis: oder-IRES-tauGFP Mäuse exprimieren das tauGFP unter der Steuerung der ODER-Promotor. Bei diesen Mäusen werden alle Neuronen, die oder von Interesse mit GFP markiert. Dieses Protokoll wird für die Regionen in äußerster Rand in allen Zonen ausgedrückt angepasst. Allerdings sind Dissektionen und Aufnahmen einfacher für OPs im Rückenbereich ausgedrückt.

  1. Betäuben das Tier durch Injektion einer Mischung aus Ketamin und Xylazin (150 mg / kg und 10 mg / kg BODy Gewicht, respectively). Enthauptung kann mit einer scharfen Schere für junge Mäuse oder mit einem ordnungsgemäß gewartet Nagetier Guillotine für ältere Mäuse durchgeführt werden.
    1. Verwendung Ring Präparierscheren einen mittleren Längsschnitt durch die Rückenhaut. Entfernen Sie die Haut, indem Sie sie auseinander. Mit der Schere, schneiden Sie die Unterkiefer im Kiefergelenk. Entfernen Sie die oberen Frontzähne durch einen koronalen Schnitt parallel zu den Zähnen.
    2. Machen Sie einen koronalen Schnitt des Kopfes hinter den Augen, und nur den vorderen Teil des Kopfes zu halten. Tauchen sie in eiskaltes Ringer-Lösung für die Präparation in den Geltungsbereich.
  2. Sezieren in den Anwendungsbereich: in der Bauchseite, stellen einen Längsschnitt entlang der Oberkiefer / Zähne. Schneiden Sie die dorsalen Knochen in Längsrichtung nach der dorsolateralen Seite der Nasenhöhle. Entfernen Sie die meisten Knochen und Gaumen; übertragen die Scheidewand und das Epithel mit ihm verbunden in Sauerstoff angereichert Ringer bei RT.
  3. Für die endgültige Präparation: Kurz vor Beginn der AufzeichnungSitzung, abziehen der Epithel von der zugrunde liegenden Septum mit einer Pinzette. Nehmen Sie das Epithel mit einer Pinzette und mit zwei 4-5 mm Scherenschnitte (Verwendung microvannas Schere) auf den vorderen Teil der Nasenscheidewand, wo die Haftung ist stärker.
    1. Entfernen Sie vorsichtig die Vomeronasalorgans durch Ausschneiden entlang der dorsalen Verbindung zum Septum-Epithel. Übertragen Sie das Epithel zu einer Aufzeichnungskammer, die mit der Schleimschicht nach oben; halten Sie es flach in der Kammer mit einer Harfe.
  4. Installieren Kammer unter einem aufrechten Mikroskop mit Fluoreszenzoptik und einer empfindlichen Kamera ausgestattet. Visualisieren Sie die Vorbereitung auf dem Computerbildschirm bei hoher Vergrößerung durch ein 40-fach Wasserimmersionsobjektiv (numerische Apertur 0,8) und ein extra 2X oder 4X Vergrößerung durch eine Vergrößerungslinse erreicht. Perfundieren kontinuierlich mit Sauerstoff angereichert Ringer bei RT (1-2 ml / min).

4. Recording Session

  1. Suchen Sie für fluoreszierende Zelle: regen die Herstellung bei 480nm für EGFP, die Licht im Bereich 530-550 nm emittiert; Ziel einer dendritischen Knopf, der in der Fluoreszenz und unter Hellfeld zuverlässig sichtbar ist.
  2. Füllen Elektrode mit intrazellulären Lösung mit Nystatin; entfernen Luftblasen durch leichtes Antippen auf der Elektrode.
  3. Einfügen Elektrode auf Elektrodenhalter, gelten positive Druck in der Pipette; Widerstand sollte 15-20 MOhm sein.
  4. Bringen Elektrode in der Nähe der Zelle; einmal Widerstand erreicht ~ 40 MOhm, lassen Druck und mit leichtem Unterdruck wird eine undurchlässige erreichen.
  5. Sobald Dichtung erreicht ist, setzen Sie das Membranpotential von etwa -75 mV;
  6. Sobald die Zelle geöffnet wird, fahren Sie mit Stimulationsprotokolle, pharmakologische Behandlungen. Um die Antwort auf eine einzelne Riechstoff Stimulation Rekord 200-500 ms von spontaner Aktivität zu messen, zu stimulieren für 500 ms und messen die Antwort der Zelle bis zu 10 sec 13. Für pharmakologische Behandlungen, durchströmen die pharmakologischen Mitteln andie gewünschte Konzentration 20.

5. Datenanalyse

  1. Analysieren von Geruchsstoffströme Stimulation ausgelöst wie folgt: die maximale Amplitude, die Anstiegszeit (Zeit notwendig, 90% der Maximalamplitude erreichen, in msec), dem Gesamtstrom (Fläche unter der Kurve in PAS), die Zeit, zu 50% (Zeit zwischen dem Beginn und dem Versatz der Reaktion bei 50% der maximalen Amplitude in ms).
    1. Mit den Spitzenübertragungsströme (maximale Amplitude erreicht) in unterschiedlichen Konzentrationen, ziehen und passen eine Dosis-Wirkungs-Kurve mit der Hill-Gleichung: I = Imax / (1 ​​+ (K 1/2 / C) n), wobei I den Spitzenstrom Imax die maximale Antwort bei sättigenden Konzentrationen, K1 / 2 die Konzentration, bei der die Hälfte der maximalen Reaktion erreicht war, C die Konzentration des Geruchsstoffs und n der Hill-Koeffizient.
  2. Analysieren Sie Aufnahmen von Membranpotential in Stromzange für die maximale Depolarisation, die total Potential ausgelöst (Fläche unter der Kurve in mVsec); Rekord spontane spiking Aktivität über 30 sec bis 1 min-Aufnahmen; Rekord Erregbarkeit durch Spikes durch Injektion von Strömen (5-10 pA) ausgelöst.

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Representative Results

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Das Ergebnis dieses Protokolls ist abhängig von der Qualität der Präparation. Diese Dissektion Schritte müssen kurz (weniger als 10 bis 15 min) und präzise (dh auf Schäden des Epithels zu vermeiden) sein. Die 1 veranschaulicht, wie eine ideale Vorbereitung sieht aus wie bei verschiedenen Vergrößerungsstufen. Bei einer niedrigen Vergrößerung unter Hellfeld die verschiedenen Zelltypen (wie Knöpfe OSNs, Stützzellen) sind zu unterscheiden (Abbildung 1A). Bei der höchsten Vergrößerungsstufe, in der Regel 80X zu 160X, in Hellfeld, die dendritischen Knöpfen der OSNs sollte deutlich von den Stützzellen (1B) sein. Unter Fluoreszenzlicht, sind nur die dendritischen Knöpfen und Zilien von GFP markierten Zellen sichtbar (Abbildung 1c). Durch den Vergleich der Bilder 2, können die markierten Zellen mit dem Aufzeichnungspipette (1D) anzufahren.

Die Temperatur des so Dissektionlösung und der Zeitpunkt der Dissektion sind kritisch. Der erste Teil der Präparation, die Vorbereitung der Scheidewand (Abschnitt 3.1.1 bis 3.2) sollte innerhalb von 5 bis 10 min in eiskalten Lösung zu nehmen. Die endgültige Präparation (3,3) weniger als 5 min bei Raumtemperatur dauern. Für den Fall, dauerte die Dissektion zu lange oder wurde in Dissektion Lösung zu warm durchgeführt wird, das Präparat immer sieht schnell beschädigt: dendritischen Knöpfe über der Oberfläche des Epithels schwimmenden und toten Zellen ähneln.

Sobald eine Abdichtung erreicht wird und die Zelle unter der Wirkung von Nystatin geöffnet wird, können typische Spannungs gesteuerten Ströme beobachtet werden (Abbildung 2A). Die Form und die Eigenschaften dieser Ströme können verwendet werden, um die Gesundheit der Zelle überwacht werden: in einer sterbenden Zelle oder wenn die Qualität der Dichtung abnimmt, wird Amplitude dieser Ströme 'zu verringern. Unter der Stromzange Konfiguration können Aktionspotentiale entweder spontan aufgenommen werden (Abbildung 2B) oder durch Injektion eines depolarisierenden Strom (2C). Die Brenneigenschaften durch Strominjektion induziert charakterisieren die Erregbarkeit der Neuronen aufgezeichnet. Die Erregbarkeit der Bevölkerung verschiedene OSNs 'kann (unter Verwendung klassischer Frequenz und ISI Berechnungen) verglichen werden.

A mehrgehäusigen Pipette mit verschiedener Riechstoffe und / oder unterschiedliche Konzentrationen von Geruchsstoffen beladen können die Zellen durch Druckausstoß stimulieren. Dies erlaubt es, die Geruchsstoff induzierten Reaktionen zu messen. Die Geruchsstoffe und Konzentrationen müssen je gewählt auf der OR in der Zelle von Interesse zum Ausdruck gebracht werden, zum Beispiel Lyral ist der Ligand für MOR23, Acetophenon für M71, Eugenol für mOREG. In der auf der Abbildung 3 dargestellten Experiment reagierte die aufgenommenen MOR23-IRES-tauEGFP Neuronen auf verschiedene Konzentrationen von Lyral, Ligand für MOR23 unter Stromklemme Modus (3A) oder unter dem Spannungsklemmmodus (Figure 3B). In voltage clamp Modus Aufnahmen können unterschiedliche Eigenschaften überwacht werden, um die Reaktion (maximaler Amplituden-Zeit steigen, Gesamtstrom ausgelöst, etc.,), Wie klassisch in der Elektrophysiologie durchgeführt zu quantifizieren. Verwendung der maximalen Amplitude der Riechstoff-induzierte Reaktion kann Dosis-Antwort aufgezeichnet werden und mit der Hill-Gleichung angepasst. Diese Ergebnisse geben Auskunft über die Eigenschaften der einzelnen Codierungs OSN: Nachweisschwelle, zeitliche Dynamik, Dynamikbereich und Sättigungsgrad. Beispiele für Dosis-Antwort-Kurven sind in Figur 3C gezeigt. All diese Details können zwischen einzelnen OSNs verglichen werden, um mögliche Heterogenität innerhalb einer Population zu messen; sie können auch zwischen OSNs mit oder ohne Anwendung einer Behandlung zur Potentialmodulation und Plastizität Messung verglichen werden.

Abbildung 1


Abbildung 1: Repräsentative Bilder eines gesunden Zubereitung (A) Intact Riechepithel der Nasenhöhle eines SR1-IRES-tauGFP transgenen Maus unter Hellfeldbedingung an der 40-facher Vergrößerung beobachtet extrahiert.. OSN dendritischen Noppen (schwarze Pfeilspitzen) in einem Netz von Stützzellen (SC) und Bowman Drüsen (BG) eingeschlossen ist. (B) Dendritische Knöpfe von SR1 exprimieren unter Hellfeldbedingung (weiße und rote Pfeilspitzen) beobachtet OSNs. (C) das gleiche Feld wie in (B) unter Fluoreszenzlicht, die dendritischen Knöpfen von SR1 ausdrücken OSNs. (D) Aufnahmepipette Annäherung an ein SR1-exprimierenden OSN unter Hellfeld. Die rote Pfeilspitze stellt die gleiche SR1 OSN in (B - D). Maßstab: 5 um.


Abbildung 2: Repräsentative Membraneigenschaften Ergebnisse mit den Protokoll erhalten:. Patch-Clamp-Aufnahmen auf der dendritischen Knauf eines SR1-IRES-tauGFP OSN (A) Spannungsgesteuerte durch Erhöhung depolarisierende Schritte vom Membranpotential -67 mV bis +40 ausgelöst Ströme mV. (B) Spontanaktivität in der Stromklemme Konfiguration aufgezeichnet; Aktionspotentiale können während der 15 sec Aufzeichnungs Epoche beobachten. (C) Aktionspotentiale durch eine 7 pA erregenden Strom hervorgerufen; Dieses Protokoll enthält Informationen über die Erregbarkeit der Zelle.

3A

3B


Fig. 3: Repräsentative Beispiele von Geruchs induzierte Antworten in einem MOR23-IRES-tauEGFP Neuron Steigende Konzentrationen Lyral, eines Liganden der MOR23 Rezeptors induzieren Erhöhung Antworten sowohl in Stromklemme (A) und der Spannungsklemme (B). Das Membranpotential wurde bei -67 mV geklemmt. (C) Beispiele für einzelne Dosis-Wirkungskurven auf drei M71 Neuronen in Reaktion auf steigende Konzentrationen von Acetophenon erworben und mit der Hill-Gleichung angepasst.

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Discussion

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Die Fähigkeit dieses Protokoll, um die Eigenschaften der gesunden OSNs korrekt überwachen hängt stark von der Qualität der Vorbereitung. Daher sind die Dissektion Schritte kritisch. Zunächst ist es wichtig, auf die Qualität (pH, Osmolarität), Sauerstoffzufuhr und Temperatur (eiskalten, aber nicht gefroren) der Dissektion Medium zu zahlen. Zweitens müssen die Manipulation der Epithel mit Präparierbesteck so begrenzt wie möglich ist, Schäden zu vermeiden. Schließlich ist es wichtig, eine Zubereitung so flach wie möglich, um die größte OSN Bevölkerung wie möglich Zugang zu erhalten.

Die Dissektion Qualität ist von grundlegender Bedeutung für eine gesunde Zubereitung zu erhalten. Allerdings können verschiedene Ansätze für die Präparation verwendet werden: Hier präsentieren wir eine ventral dorsal Dissektion aber einige Nutzer es vorziehen, das Sezierung dorsal in die Nasenhöhle schnell zu öffnen und haben einen schnellen Zugang zu unseren septal Vertiefung des olfaktorischen Epithels starten. Jeder Benutzer kann die pr daher anzupassenotocol für die effizienteste Strategie, um eine gesunde Zubereitung von dem interessierenden Bereich zu erreichen.

Sobald die Zubereitung unter dem Mikroskop wird eine permanente Überwachung der Gesundheit des Präparats erforderlich. In der Tat führt eine ungesunde Vorbereitung auf eine geringe Wahrscheinlichkeit, eine Giga-Dichtung zu erreichen. Eine geringe Effizienz bei der Beschaffung Gigaseals kann durch Änderung der Bereich von Interesse über die Vorbereitung, um gesünder zu finden OSNs verbessert werden. Eine drastischere Lösung ist, die Herstellung vollständig durch eine neue zu ersetzen. Sobald die Dichtung erreicht wird, um eine geringe Wahrscheinlichkeit erreichen die "geöffneten" Zustand erfolgen kann. Dies kann auf die Qualität der internen Lösung sein. Die interne Lösung muss kurz vor dem Experiment hergestellt werden. Die Verwendung von Wirbel und Beschallung sind kritisch, da die Löslichkeit von Nystatin ist eher gering. Um die Wahrscheinlichkeit der Öffnung zu verbessern, sollte der Innenlösung nochmals 10 sec gevortext und dann für 30 bis 60 Sekunden mit Ultraschall behandelt. Diese usuAlliierten verbessert die Effizienz der Zellöffnung.

Um die aufgezeichneten OSN mit Geruchsstoffen zu fördern, die vorgestellt Protokoll verwendet eine 7 Barrel anregende Pipette. Diese Art von Pipetten impliziert eine Begrenzung der Anzahl von Geruchsstoffen und / oder Konzentration von Geruchsstoffen getestet auf jeden aufgenommenen Zellen zu sieben. Diese Einschränkung ist relativ nicht im Falle einer Dosis-Wirkungskurve von Bedeutung, da es bis zu 7 log Konzentrationseinheiten abzudecken. Jedoch im Fall von Screening-Experimente, bei denen unterschiedliche Duftstoffe getestet werden, eine Sieben barrel Pipette kann Einschränkungen zeigen. In Screeningexperimente, ist das Ziel, einen Liganden für markierte OSNs ein Waisenkind OR ausdrücken zu finden. Unter Verwendung dieses Protokolls die Verwendung von Riechstoffgemische erforderlich. Jede Mischung eine Antwort auslöst wird dann in einzelne Riechstoffe teilen. Dies wurde getan, um Amin Riechstoffe auf TAAR screenen exprimieren OSNs 16. In diesen Experimenten ausgedrückt die fluoreszierenden Neuronen Taars und der Ligand unknown. Verwendung des Protokolls, Autoren mehrere Dutzend Amin Geruchsstoffe in Mischungen Bildschirm könnte. Die Mischungen Hervorrufen einer Reaktion wurden dann auf einzelne Duftstoffe, um die effizienteste Ligand finden gebrochen.

Der Abstand zwischen der Aufzeichnungsstelle und der Stimulierung Pipette weise um die mechanische Stimulation der Zelle 20 zu minimieren, ausgewählt. Wenn der Druck zu hoch ist (über 30 psi im Aufzeichnungsbedingungen) und / oder der Abstand zu klein ist (unter 20 um) kann die mechanische Reaktion teil OSNs sogar Maske die Riechstoffantwort. Druck und Abstand zwischen den Puffing Pipette und dem Aufzeichnungs Website sind auch entscheidend für die Lösung Austausch während der Stimulation zu steuern. Die Konzentration Erreichen des Neurons wurde zuvor untersucht, wie nah wie möglich in der Pipette der vorliegenden Konzentration in einer Reihe von Tests 13 zu sein. Diese Tests verwendet eine Lösung mit blauer Farbe, um den Ausbruch zu messen gefärbt und Offset von ter Stimulation. Verwenden von 20 psi Druck und 30 & mgr; m Abstand wurde die maximale Intensität des Reizes innerhalb von 300 ms erreicht. Der Offset des Stimulus wurde sorgfältig evaluiert: Da das Präparat unter kontinuierlichem Fluss des perfundierten Lösung wurde der Stimulus innerhalb 0,8 bis 0,9 sec 13 gewaschen.

Die Duftkodierung Eigenschaften OSNs wurden historisch entweder durch extrazelluläre Ableitungen in vivo oder durch Experimente an isolierten Zellen gemessen. Bei Säugetieren extrazellulären Aufnahmen wurden zunächst in vivo bei Ratten 21 durchgeführt. In extrazelluläre Ableitungen äußerte die OR in der aufgezeichneten Zelle ist unbekannt damit die Begrenzung der Erfolgsquote, um eine Zelle als Reaktion auf die Geruchsstoff getestet zu finden. Das Protokoll erlaubt die Erfassung und Charakterisierung von definierten Rezeptoren in Neuronen in der zellulären Umgebung des Epithels. Der Rezeptoren Eigenschaften können daher auf verschiedenen Ebenen analysiert: der spezifische Ligand/ Oder Wechselwirkungen während der ersten Stufe des Übertragungsweges; Folglich wird der Agonist / Antagonist-Wechselwirkungen von unterschiedlichen Liganden getestet; die Eigenschaften von Mischungen Integration definiert OPs und die Rolle des Übertragungsweges für OSNs "Spezifität; der Einfluss auf die olfaktorische Kodierung von Zell-Zell-Wechselwirkungen (wie GAP junction) im Epithel; und schließlich der Modulation des Übertragungsweges mit pharmakologischen Mitteln.

In der dissoziierten Zellaufzeichnungen, wie bereits erwähnt, die Dissoziation entfernt die Schleim und die Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen innerhalb des olfaktorischen Epithels. Dies kann Änderungen in den kodierenden Eigenschaften der OSNs induzieren. Calcium Imaging-Experimenten an isolierten Zellen wurden häufig berichtet. Zum Beispiel wurden Dosis-Wirkungskurven von M71 exprimieren OSNs ansprechend auf Acetophenon berichtet 7. Diese Dosis-Wirkungskurven steiler sind als die Dosisantworten Kurven unter Verwendung des Protokolls erhaltenhier 4 vorgestellt. Diese Abweichungen können aufgrund der Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen in der intakten Herstellung sowie die Entfernung von Schleim in isolierte Zellen sein. Schleim ist bekannt, dass viele Protein und Enzyme in perireceptor Ereignisse grundlegend für die olfaktorische Transduktion 22,23 beteiligten enthalten. In das Protokoll hier berichtet wird, die Erhaltung der Struktur des olfaktorischen Epithels und der vermeintliche Anwesenheit der Schleim dazu beitragen, die nativen Funktionen von Geruchskodierung in OSNs bewahren. Die in dem Protokoll verwendeten Konzentrationen in mol / L angegeben und in der Regel sind in der 10 -7 -10 -3 Bereich. Diese Konzentrationen sind höher als in Luft-Phasen-Aufnahmen (entweder in der lokalen Feldpotentials oder extrazelluläre Ableitungen) verwendeten Konzentrationen. Diese Abweichungen können aufgrund von i sein kann) wird die flüssige Phase der Aufnahmen (und damit der Stimulation) und ii) den langsamen Auswaschen des Schleims durch die Perfusion bei Aufzeichnungen. In der Tat, das Auswaschen der mucuns und dem Abschnitt der OSNs 'Axone bei der Präparation kann unterstützen, dass die Vorbereitung präsentiert potenziell als "pseudo-intakten" und nicht als "vollständig intakt" Vorbereitung qualifiziert werden. Dieses Präparat stellt jedoch die Aufnahme Bedingungen wie in der Nähe von in vivo wie möglich und doch entlocken Patch-Clamp-Aufnahmen. Wie jede in vitro Herstellung aus einem Säugerorganismus, bleibt die Überlebenszeit-begrenzt. Diese Grenze könnte auf die Auswaschung der Schleim, der Abschnitt OSNs 'Axone als auch das Fehlen von Blutkreislauf innerhalb der Vorbereitung.

Die hier vorgestellte Protokoll erlaubt es, Membraneigenschaften von Riechzellen aufzunehmen. Diese Technik kann mehrere Anwendungen, wie beispielsweise Analyse der Membraneigenschaften OSNs pharmakologische Untersuchungen OSNs Modulation von Riechstoff Codiereigenschaften OSNs und deorphanization von OR haben. Die während Calcium Imaging aufgezeichneten Ereignisse werden slow und langlebig. Patch-Clamp-Aufnahmen in diesem Protokoll führen zu Daten über schnelle Ereignisse in olfaktorischen Übertragungsweges an der Membranebene.

Die hier präsentierten Aufnahmen sind in der Patch-Clamp-Konfiguration durchgeführt. In dieser Konfiguration können die Eigenschaften der Membran der aufgezeichneten Zelle analysiert werden, ob es sich um das olfaktorische Übertragungswegs Maschinen oder die beteiligten Spannung gesteuerten Ströme. Experimente unter Verwendung dieses Protokolls können Daten über die Modulation der Riechstoff Codiereigenschaften OSNs bereitzustellen. Pharmakologische Mittel können verwendet werden, um die olfaktorischen Wahrnehmung unter verschiedenen Bedingungen untersucht werden: zum Beispiel kann MDL12330A, ein Blocker der Adenylatcyclase III (ACIII) 24,25 in der Perfusionslösung angelegt, um die Rolle in ACIII Riechstoff Reaktion zu untersuchen. Zusätzlich kann dieses Protokoll verwendet werden, um zu untersuchen, wie Geruchs Codiereigenschaften in unterschiedlichen Bedingungen moduliert wie der Riechumgebung <sup> 18 oder unter dem Einfluss von Hormonen in der Fütterung Verhalten 26 beteiligt. Schließlich kann dieses Protokoll auch Daten über OR / Ligand-Wechselwirkung und Entschlüsselung Agonist / Antagonist-Aktivitäten auf definierten Randlage oder sogar in 27 zufällig ausgewählten Rezeptoren führen.

Schließlich mit den Beschränkungen aufgrund der 7. Lauf anregende Pipette, dieses Protokoll kann auch für deorphanizing OPs verwendet werden. Wie früher in diesem Fall erwähnt, können mehrere Riechstoffgemische getestet werden. Mischungen Hervorrufen einer Reaktion sollte dann in andere Zellen getestet einzelnen Geruchsstoffe unterteilt werden.

Durch die Ausrichtung OSNs ausdrücken definiert OPs bietet dieses Protokoll leistungsfähige Daten über die Regionen in äußerster Rand, Liganden / OPs Wechselwirkungen, Übertragungsweg Eigenschaften und Eigenschaften von definierten Populationen von OSN in verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
vibration table with Faraday cage TMC 63-500 SERIES required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment
optics
microscope Olympus BX51WI upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference
objectives Olympus LUMPLFL40XW at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
magnifier Olympus U-TVCAC ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode
camera Olympus DP72 a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary
filters Olympus/Chroma depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m
amplifier HEKA EPC10 USB monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer
software HEKA Patchmaster controls the amplifier during the experiment
micromanipulator Sutter MP225 precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift
electrode puller Sutter P97 with a FT345-B wide trough filament;  to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution
glass Sutter BF120-69-10 in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets
recording chamber Warner Instruments RC-26G a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.
stimulation
glass WPI TW100F-4 attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes
multibarrel puller MDI PMP-107-Z by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels
precision pressure injector  Toohey Company P/N T25-1-900 Single Channel    this precision pressure injector  controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V  TTLs
micromanipulator Narishige YOU-1 a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site
tubings N/A tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette
solutions/perfusion/chemicals
vacuum pump gardner denver 300 series a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps
perfusion system N/A N/A gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber
nystatin Sigma-Aldrich N3503 mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp
DIMETHYL SULFOXIDE Sigma-Aldrich D5879 used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch 
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 extracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 intracellular/extracellular solution
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 extracellular solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S9638 extracellular solution
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) Sigma-Aldrich 63140 extracellular solution
Glucose Sigma-Aldrich G8270 extracellular solution
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 extracellular solution
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) Sigma-Aldrich E3889 internal solution
Potassium hydroxyde Sigma-Aldrich P1767 internal solution
Methyl Sulfoxide Sigma-Aldrich W387509 intracellular solution
Hepes-Na Sigma-Aldrich H7006 intracellular solution
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 intracellular solution

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References

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Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor
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Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor. J. Vis. Exp. (101), e52652, doi:10.3791/52652 (2015).More

Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor. J. Vis. Exp. (101), e52652, doi:10.3791/52652 (2015).

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