Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.
विशिष्ट ligands के साथ जब उत्तेजित घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स की शारीरिक प्रतिक्रियाओं (OSN) का विश्लेषण करना घ्राण संचालित व्यवहार और उनके मॉडुलन के आधार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। ये कोडिंग गुण गंध अणु और घ्राण रिसेप्टर (या) के बीच प्रारंभिक बातचीत पर भारी निर्भर OSNs में व्यक्त की है। व्यक्त या आलोचना कर रहे हैं की पहचान, विशिष्टता और ligand स्पेक्ट्रम। या की लिगेंड खोजने के लिए संभावना उपकला भीतर बेतरतीब ढंग से चुनी एक OSN में बहुत कम है व्यक्त की है। इस चुनौती का पता करने के लिए, इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से परिभाषित अन्य रैंकों के प्रमोटर के नियंत्रण के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP व्यक्त की गईं चूहों का उपयोग करता है। OSNs पड़ोसी कोशिकाओं को अपनी परिपक्वता और समारोह को प्रभावित करने के साथ, नाक गुहा की परत एक तंग और संगठित उपकला में स्थित हैं। यहाँ हम OSNs ई के गुणों को एक अक्षुण्ण घ्राण उपकला अलग करने और पैच दबाना रिकॉर्डिंग के माध्यम से रिकॉर्ड करने के लिए एक विधि का वर्णनपरिभाषित odorant रिसेप्टर्स xpressing। प्रोटोकॉल पड़ोसी ऊतक के प्रभाव रखते हुए एक OSN झिल्ली गुण चिह्नित करने के लिए अनुमति देता है। पैच दबाना परिणामों के विश्लेषण लिगेंड / या बातचीत, पारगमन रास्ते और औषध विज्ञान, OSNs 'कोडिंग के गुण और झिल्ली स्तर पर अपनी मॉडुलन का एक सटीक मात्रा का ठहराव अर्जित करता है।
घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स (OSN) घ्राण धारणा का पहला कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृन्तकों में नाक गुहा अस्तर घ्राण उपकला में स्थित है, वे मस्तिष्क के लिए अपने अक्षतंतु के माध्यम से भेजा कार्रवाई क्षमता में odorants की रासायनिक जानकारी बदलना। बेहतर घ्राण कोडिंग तंत्र को समझने के लिए, यह OSNs के पारगमन और झिल्ली गुण चिह्नित करने के लिए आवश्यक है। अभी हाल तक, स्तनधारी OSNs के गुणों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक का सबसे अलग OSNs 1-4 पर बाहर किए गए। पृथक्करण की प्रक्रिया अपने वातावरण से OSNs मुक्त करने के लिए विभिन्न यांत्रिक और रासायनिक (यानी, एंजाइम) प्रक्रियाओं का उपयोग करता है। इन प्रक्रियाओं रिकॉर्डिंग के लिए उपलब्ध कोशिकाओं की कम संख्या को प्रेरित। यह कम संख्या GFP के लेबल की कोशिकाओं के मामले में और भी अधिक महत्वपूर्ण हो सकता है। हदबंदी भी OSNs और surviv वृद्धि कर सकते हैं कि घ्राण उपकला के अन्य कोशिकाओं के बीच स्थानीय सेल करने वाली सेल बातचीत को हटाअल और OSNs 'गुण के मॉडुलन। हदबंदी प्रक्रिया को बायपास करने के लिए, एक अक्षुण्ण तैयारी 5 विकसित किया गया था।
प्रत्येक OSN एक बड़ी बहुजीनीय परिवार 6 से चयनित (या) एक घ्राण रिसेप्टर व्यक्त करता है। माउस में मुख्य घ्राण उपकला में व्यक्त 1,000 अन्य रैंकों ~ कर रहे हैं। कारण जंगली प्रकार के पशुओं में या की बड़ी संख्या के लिए, संभावना है कि एक ही व्यक्त OSNs रिकॉर्ड या बहुत कम कर रहे हैं करने के लिए। इन सीमाओं को पार करने के लिए, जीन लक्षित चूहों उपलब्ध हैं जिसमें एक की पहचान या एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन 7-9 के साथ लेबल रहे व्यक्त सभी OSNs। ये लेबल वाले OSNs अलग तैयारियाँ पहले उल्लेख किया है कमियों के साथ 7,10,11 में कार्यात्मक विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। आनुवंशिक रूप से लेबल चूहों से एक अक्षुण्ण उपकला तैयारी 5 इसलिए इन मुद्दों पर गतिरोध उत्पन्न। यह छठी में करीब के रूप में एक ऐसे वातावरण में ठीक से परिभाषित अन्य रैंकों व्यक्त OSNs की गतिविधि की निगरानी की अनुमति देता हैसंभव के रूप में VO। इसके अलावा, OSNs का पैच दबाना रिकॉर्डिंग भी झिल्ली गुण, पारगमन मार्ग औषध विज्ञान, लिगेंड / या बातचीत की सटीक विश्लेषण अनुमति देते हैं। इन सभी विषयों को शायद ही कोशिकी रिकॉर्डिंग का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है। हम odorant रिसेप्टर्स SR1 और MOR23 12,13 व्यक्त OSNs की प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया। तकनीक की व्यवहार्यता न्यूरॉन्स 15,16 व्यक्त OSNs 14 व्यक्त MOR23 पर अन्य समूहों के साथ ही पर अन्य अन्य रैंकों द्वारा पुष्टि की गई। OSNs का एक परिभाषित आबादी की निगरानी 17 उम्र बढ़ने, इस तरह के विकास 14 के रूप में कई अलग अलग संदर्भों में उनके गुणों का विश्लेषण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, odorant प्रेरित प्लास्टिसिटी 18, और 15 कोडिंग गंध में odorant रिसेप्टर के अनुक्रम में बदलाव की भूमिका। इस प्रोटोकॉल के इस प्रकार झिल्ली स्तर पर निर्धारित OSNs के कार्यात्मक संपत्तियों की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।
सही ढंग से स्वस्थ OSNs के गुण नजर रखने के लिए इस प्रोटोकॉल की क्षमता तैयारी की गुणवत्ता पर काफी निर्भर करता है। इसलिए, विच्छेदन चरणों महत्वपूर्ण हैं। पहले यह गुणवत्ता (पीएच, परासारिता), oxygenation और तापमान (ठंडा…
The authors have nothing to disclose.
Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil Régional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Université de Bourgogne (BQR program).
heavy equipment | |||
vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
optics | |||
microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM |
magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
recording electrodes /system | |||
amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
electrode puller | sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
glass | sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
recording chamber | warner instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
stimulation | |||
glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
solutions/perfusion/chemicals | |||
vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
Calcium chloride di hydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
MethylSulfoxide | Sigma-Aldrich | 47,135-6 | intracellular solution |
Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |