Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Перфорированные патч-зажим записи из мышей Обонятельные сенсорные нейроны в неповрежденном нейроэпителии: Функциональный анализ нейронов выражая идентифицированного одоранта рецептор

doi: 10.3791/52652 Published: July 13, 2015

Abstract

Анализируя физиологические реакции обонятельных сенсорных нейронов (ОСН) при стимуляции специфических лигандов важно понять основы обонятельных приводом поведения и их модуляции. Эти свойства кодирования в значительной степени зависят от начального взаимодействия между молекулами запаха и обонятельной рецептора (или) выражается в OSNs. Идентичность, специфика и лиганд спектр выраженных или являются критическими. Вероятность найти лиганд или выражены в OSN выбранной случайным образом в пределах эпителия является очень низким. Для решения этой проблемы, этот протокол использует генетически мышей отмеченных выражающие флуоресцентного белка GFP под контролем промотора, определенных ОР. OSNs находятся в тесной и организованной эпителия, выстилающих носовую полость, с соседние клетки, влияющие на их созревание и функции. Здесь мы опишем метод, чтобы изолировать нетронутыми обонятельного эпителия и записывать через патч-зажим записи свойства OSNs еxpressing определенные одоранта рецепторы. Протокол позволяет характеризовать свойства ОСН мембранные, сохраняя при этом влияние соседней ткани. Анализ результатов патч-зажим дает точную количественную оценку лиганд / или взаимодействий, трансдукции и фармакологии, свойства кодирования OSNs "и их модуляции на уровне мембраны.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Обонятельные сенсорные нейроны (OSN) представляют собой первый шаг обонятельной восприятия. Расположенный в обонятельный эпителий, выстилающей полость носа у грызунов, они преобразуют химическую информацию пахучих веществ в потенциалы действия, отправленных через их аксонов в мозг. Чтобы лучше понять, обонятельные механизмы кодирования, необходимо охарактеризовать трансдукции и мембранные свойства OSNs. До недавнего времени большинство из методов, используемых для характеристики свойств OSNs млекопитающих не проводили на диссоциации OSNs 1-4. Процесс диссоциации использует различные механические и химические (т.е., ферменты) процессы, чтобы освободить OSNs из их среды. Эти процессы вызывают низкое число доступных ячеек для записей. Это низкое количество может быть еще более важным в случае GFP меченых клеток. Диссоциация также удаляет местной ячейки к клетке взаимодействия между OSNs и других клеток обонятельного эпителия, что может усилить survivаль и модуляции свойств OSNs. Для того, чтобы обойти процедуру диссоциации, нетронутыми препарат разработан 5.

Каждый ОСН выражает один обонятельный рецептор (OR) выбран из большого семейством генов 6. Есть ~ 1000 ОШ, выраженные в основном обонятельного эпителия у мышей. Из-за большого числа или в животных дикого типа, шансы записать OSNs экспрессирующих тот же или очень низкой. Чтобы преодолеть эти ограничения, генные целевой мышей доступны в которой все OSNs экспрессирующие идентифицированных или помечены флуоресцентного белка 7-9. Эти меченые OSNs были использованы, чтобы сделать функциональный анализ в диссоциированных препаратов 7,10,11 с недостатками, упомянутых ранее. Без изменений подготовка эпителий 5 из генетически маркированных мышей поэтому обходит эти вопросы. Это позволяет осуществлять мониторинг деятельности OSNs выражающих именно определенные ОШ в среде, максимально приближенных в VIVO, насколько это возможно. Кроме того, патч-зажим записи OSNs также позволит точный анализ мембранных свойств, трансдукции фармакологии, лиганд / или взаимодействия. Все эти темы вряд ли могут быть проанализированы с помощью внеклеточных записи. Мы использовали этот метод для контроля ответы OSNs выражающие одоранта рецепторы SR1 и MOR23 12,13. Технико-экономическое техники было подтверждено другими группами на MOR23 выражающих OSNs 14, а также на других ОШ, выражающих нейроны 15,16. Мониторинг определенного населения OSNs может привести к анализу их свойств в различных контекстах, таких как развитие 14, старение 17, отдушка индуцированной пластичность 18 и роль вариаций в последовательности одоранта рецептора запаха кодирования 15. Этот протокол, таким образом, представляет собой мощный инструмент для мониторинга функциональных свойств, определенных OSNs на уровне мембраны.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол следует рекомендациям по уходу животное на Университета Бургундии и был одобрен Комитетом по этике Университет де Бургундия.

1. Животные

  1. Используйте генетически мышей ИЛИ IRES-tauGFP доступные в Jackson Laboratory. Эти мыши были разработаны в лаборатории доктора Питера Mombaerts 'для того, чтобы проанализировать аксонов адресности и развитие обонятельной системы 19. Например, MOR23-IRES-tauGFP линия, инвентарный номер 006643, несет официальное название штамма B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; Аналогично, линия SR1-IRES-tauGFP, инвентарный номер 6717 носит официальное название В6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
  2. Что касается возраста животных: на лучший исход протокола, использовать животных между 2 и 4-недельного возраста. В этой возрастной группе, рассечение легче (мягкие кости, прочнее обонятельный эпителий) и дендритные ручки биgger сравнить старых животных.

2. Подготовка электродов и решения

  1. Для стимулирующих пипеток: покупка prepulled стимулирования пипетки. В противном случае, подготовить их вручную.
    1. С использованием пламени, согнуть шесть 1 мм стеклянные пипетки на 1 см от кончика. Вставьте эти шесть пипеток плюс прямые 7-е место в 1,5 см термоусадочной трубки укрепить с помощью глазка.
    2. Термоусадочная трубки для поддержания баррелей прикрепленные вместе. Присоединение дополнительного трубки термоусадочные другой оконечности баррелей. Потяните стимулирующее пипетки с съемника нескольких баррель.
    3. Добавить немного белого жидкого клея вокруг глазка для укрепления изогнутой советы. Дайте высохнуть O / N.
  2. Подготовка 1 или 2 л внеклеточной решение нормальный Рингера (в мм: 124 NaCl, KCl, 3, MgSO 4 1,3, CaCl 2 2, NaHCO 3 26, NaH 2 PO 4 1,25, глюкоза 15; рН 7,6 и 305 мОсм). Хранить при температуре 4 ° Cдо использования.
  3. Подготовка исходного раствора внутриклеточного (в мм): KCl 70, KOH 53, метансульфоновая кислота, EGTA 30, 5 HEPES 10, сахароза 70; рН 7,2 (КОН) и 310 мОсм. Хранить при 4 ° С до использования. Хорошо в течение нескольких недель.
  4. Подготовка внутриклеточного решение для записи с нистатин экспромтом (в последнюю минуту) до эксперимента.
    1. Взвешивание 3 мг нистатин, добавить 50 мкл ДМСО; вихрь 20 сек, то разрушать ультразвуком 2-3 мин, пока полностью не разбавляют.
    2. Добавьте 20 мкл ДМСО-нистатин раствора в 5 мл раствора внутриклеточного. Вихревой 20 сек, а затем разрушать ультразвуком 3 минуты. Держите это решение при 4 ° С и защищают от прямого света, нистатин светочувствительный. Это решение может быть использовано в течение нескольких часов. Заменить каждый день.
    3. После обонятельный эпителий препарат под микроскопом, принять некоторые из этого раствора в 1 мл шприц с пламенем удлиненные желтого наконечника для заполнения электрода; защиты от прямого света. После того, как в РТ, нистатин решенияне является стабильным; заменить решение в 1 мл шприц каждый час или держать его на льду.
  5. Потяните записи электроды с съемника, чтобы получить длинную шею и небольшие чаевые (~ 2 мкм) с сопротивлением 15-20 МОм с внутренним решением нистатина.
  6. Подготовка одоранта раствор при 0,5 М в ДМСО под вытяжным шкафом; Аликвоту и держать при температуре от -20 ° С до использования. Развести не одоранта в растворе Рингера до желаемой концентрации. Заполните стимулирующее пипетки.

3. Подготовка обонятельного эпителия

Примечание: мышей ИЛИ-IRES-tauGFP выразить tauGFP под контролем промотора ИЛИ. В этих мышей, все нейроны, выражающие или интерес помечены GFP. Этот протокол адаптирован для ОШ, выраженных во всех зонах. Тем не менее, вскрытия и записи легче для ОШ, выраженных в зоне спинного.

  1. Обезболить животное путем инъекции смеси кетамина и ксилазина (150 мг / кг и 10 мг / кг БПКу веса, соответственно). Обезглавливание может быть выполнена с острыми ножницами для молодых мышей или с надлежащим образом грызунов гильотины для старых мышей.
    1. Использование кольцевых рассечения ножницами сделать продольный разрез медиальной через кожу спины. Снимите кожу, потянув ее на части. Используя ножницы, вырезать нижние челюсти на нижнечелюстного сустава. Снимите верхние передние зубы корональной вырезанной параллельно к зубам.
    2. Сделайте разрез корональной головы позади глаз и держать только переднюю часть головы. Опустите его в ледяной Рингера раствор для вскрытия под сферу.
  2. Проанализируйте под действие: в брюшной стороне, сделать продольный разрез вдоль верхней челюсти / зубов. Отрежьте спинной кости в продольном направлении, после спинно-боковой части носовой полости. Удалить большинство костей и вкус; перевести перегородку и эпителий, прикрепленный к ней в окисленной Ringer при комнатной температуре.
  3. Для окончательного вскрытия: Прямо перед началом записисессия, удаляйте эпителий от подлежащей перегородки щипцами. Снять эпителий с пинцетом и с двумя 4-5 мм разрезами ножницами (использование microvannas ножницы) на передней части перегородки, где адгезия сильнее.
    1. Осторожно снимите вомероназальный орган путем разрезания его вдоль спинного подключения к перегородки эпителия. Перевести эпителия к записи камеры со слоем слизи вверх; держать его квартиру в камере с арфой.
  4. Установите камеру под прямой микроскоп, снабженный флуоресцентной оптики и чувствительного камеры. Представьте себе препарат на экране компьютера в высоком увеличении через 40X воды погружения объективной числовой апертурой (0.8) и дополнительную 2X 4X или увеличении достигнутого лупой. Заливать непрерывно с кислородом Рингера при комнатной температуре (1-2 мл / мин).

4. Запись сессии

  1. Поиск для люминесцентных ячейки: возбуждают подготовку на 480нм для EGFP, который излучает свет в диапазоне 530-550 нм; цель одна дендритных ручки, которая надежно видно флуоресценции и при ярком поле.
  2. Заполните электрод с внутриклеточной раствора с нистатин; удалить пузырьки, осторожно постукивая по электрода.
  3. Вставьте электрод на держатель электрода, применять положительное давление в пипетку; Сопротивление должно быть 15-20 МОм.
  4. Доведите электрод близко к камере; когда сопротивление достигает ~ 40 МОм, отпустите положительное давление и применять небольшое отрицательное давление для достижения gigaseal.
  5. После того, как печать будет достигнута, устанавливается мембранный потенциал на -75 мВ;
  6. После того, как клетка открыта, перейдите протоколов стимуляции, фармакологического лечения. Для измерения ответа на один одоранта стимуляции, запись 200-500 мс спонтанной активности, стимулировать за 500 мс и измерить реакцию клетки на срок до 10 сек 13. Для фармакологического лечения, заливать фармакологические агенты нажелаемая концентрация 20.

5. Анализ данных

  1. Анализ течения, вызываемые одоранта стимуляции, как следует: максимальную амплитуду, рост времени (время, необходимое для достижения 90% от максимальной амплитуды, в мс), суммарный ток (площадь под кривой в PAS), время на 50% (время между началом и смещение ответ на 50% от максимальной амплитуды, в мс).
    1. Использование пик трансдукции токов (максимальная амплитуда достигается) в различных концентрациях, рисовать и соответствовать кривую, используя уравнение Хилла: Я = Imax / (1 ​​+ (К 1/2 / С) п), где я представляет пиковый ток , Imax максимальный отклик у насыщающих концентрациях К1 / 2 концентрации, при которой была достигнута половина максимального ответа, C концентрации одоранта и п коэффициент Хилл.
  2. Анализ записей мембранного потенциала в текущей зажим для максимальной деполяризации, по Тотал вызывало потенциал (площадь под кривой) в mVsec; запись спонтанной пики активности в течение 30 сек до 1 мин записей; запись возбудимость через шипы вызываемых инъекции токов (5-10 Па).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Результатом этого протокола зависит от качества вскрытия. Это рассечение шаги должны быть короткими (менее от 10 до 15 мин) и точным (т.е., чтобы избежать повреждения эпителия). Рисунок 1 иллюстрирует, как идеальная подготовка похоже на разных уровнях увеличения. На малом увеличении при ярком поле различные типы клеток (например, ручек, поддерживающих OSNs клетки) различимы (1А). На самом высоком уровне увеличения, как правило, 80X, чтобы 160X, в светлом поле, дендритные ручки этих OSNs должны быть четко отличимы от поддерживающих клеток (рис 1B). Под флуоресцентным светом, только дендритных ручки и реснички GFP меченых клеток видны (рис 1С). Сравнивая 2 изображения, меченые клетки могут подходить с записи пипетки (рис 1D).

Температура вскрытия таклюция и сроки вскрытия имеют решающее значение. Первая часть вскрытия, подготовка перегородки (раздел 3.1.1) 3.2 должен состояться в течение 5 до 10 мин в ледяной раствора. Конечный рассечение (3.3) должно продолжаться менее 5 мин при комнатной температуре. В случае, если вскрытие длилось слишком долго, или была выполнена в рассечение раствора слишком тепло, препарат всегда смотрит быстро повреждены: дендритные Ручки плавают над поверхностью эпителия, и напоминают мертвые клетки.

После того, как печать будет достигнуто и клеток открывает под воздействием нистатин, типичные напряжения закрытого токи можно наблюдать (рис 2а). Форма и характеристики этих токов может быть использован для мониторинга здоровья клетки: в умирающем клетки или если качество каспийского тюленя снижается, амплитуда этих токов »будет уменьшаться. В текущей конфигурации зажима, потенциалы действия могут быть записаны либо спонтанно (Рис 2Б) либо путем инжекции тока деполяризационного (фиг.2с). Огневые свойства, вызванные текущей инъекции характеризуют возбудимость записанного нейрона. Возбудимость населения различных OSNs "можно сравнить (используя классическую частоту и расчеты ISI).

Multibarrel пипетки загружен различных одорантов и / или различных концентраций одорантов могут быть использованы, чтобы стимулировать клетки выбросом давления. Это позволяет измерять одоранта индуцированной реакции. В отдушки и концентрации должны быть выбраны в зависимости от или выражается в ячейке интерес, например Lyral является лигандом для MOR23, ацетофенон для M71, эвгенол для mOREG. В эксперименте, показанном на фиг.3, записанные нейроны MOR23-IRES-tauEGFP ответил на различных концентраций Lyral, лиганда MOR23, при текущем режиме зажим (фиг.3А) или в режиме зажима напряжения (рисЮр 3B). В записи в режиме зажим напряжения, различные характеристики могут быть проверены количественно ответ (максимальная амплитуда, время нарастания, общий ток вызывал, и др.), Как выполняется в классическом в электрофизиологии. Использование максимальную амплитуду ответа одоранта-индуцированной доза-реакция может быть построена и оборудована, используя уравнение Хилла. Эти результаты дают информацию о свойствах кодирования каждого OSN: порог обнаружения, временная динамических, динамический диапазон и уровень насыщения. Примеры кривых доза-ответ, показаны на фиг.3С. Все эти детали могут быть сопоставлены между отдельными OSNs для измерения потенциального неоднородность в популяции; они также могут быть сопоставлены между OSNs с или без применения лечения, чтобы измерить потенциал модуляции и пластичности.

Фигура 1


Рисунок 1: Типичные изображения здорового подготовки (А) в неповрежденном обонятельный эпителий извлечены из носовой полости в SR1-IRES-tauGFP трансгенной мыши, наблюдаемой при ярком полевых условиях на увеличении 40Х.. OSN дендритные ручки (черный стрел) заключены в сетки опорных клеток (СК) и Bowman желез (BG). (B), дендритных ручки из SR1 выражения OSNs наблюдаемые при ярком состоянии поля (белый и красный стрел). (С) то же поле, как и в (B) под флуоресцентным светом, показывая дендритных ручки из SR1, выражающих OSNs. (D) Запись пипетки приближается к SR1-выражения OSN при ярком поле. Красный наконечник представляет тот же SR1 OSN в - D). Масштабная линейка: 5 мкм.


Рисунок 2: Типичные свойства мембраны результаты, полученные с помощью протокола:. Патч-зажим записи на дендритных ручкой в SR1-IRES-tauGFP OSN (A) напряжения закрытого токи, индуцированные повышения деполяризующие шагах от мембранного потенциала -67 мВ до +40 мВ. (Б) Спонтанная активность записывается в текущей конфигурации зажима; потенциалы действия могут наблюдаться в течение 15 сек записи эпохи. (C) Потенциалы действия вызываемые +7 пА раздражающего тока; этот протокол обеспечивает информацию о возбудимости клетки.

3А

3В


Фигура 3:. Характерные примеры индуцированного одоранта ответов в нейроне MOR23-IRES-tauEGFP Повышение концентрации Lyral, лиганд рецептора MOR23, вызывают увеличение реакции, как в текущем зажим (А) и в зажиме напряжения (В). Мембранный потенциал был зажат в -67 мВ. (С) Примеры индивидуальных кривых доза-ответ, полученных по трем M71 нейронов в ответ на увеличение концентрации ацетофенона и снабженных уравнения Хилла.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Способность этого протокола правильно контролировать свойства здоровых OSNs в значительной степени зависит от качества препарата. Таким образом, шаги рассечение являются критическими. Во-первых важно обратить внимание на качество (рН, осмолярность), оксигенации и температуры (льдом холодной, но не замороженной) в рассечение среды. Во-вторых, манипуляция эпителия с рассекающих инструментов должны быть как можно более ограниченным, чтобы избежать убытков. Наконец, важно, чтобы получить препарат, как плоский, как это возможно, чтобы получить доступ к большой популяции OSN, как это возможно.

Качество вскрытия является фундаментальным для получения здорового подготовку. Тем не менее, различные подходы могут быть использованы для вскрытия: здесь мы приводим брюшной рассечение спинного но некоторые пользователи могут предпочесть, чтобы начать рассечение дорсально, чтобы открыть носовой полости быстро и иметь быстрый доступ к перегородки выемку обонятельный эпителий. Каждый пользователь может, следовательно, адаптировать прotocol для наиболее эффективной стратегии, чтобы достичь здорового подготовку интересующей области.

После того, как препарат под микроскопом, постоянный мониторинг здоровья препарата в требуется. В самом деле, нездоровый подготовка приводит к низкой вероятности достижения gigaseal. Низкая эффективность в получении gigaseals можно улучшить, изменив область интереса по подготовке для того, чтобы найти здоровые OSNs. Более резкое решение полностью заменить препарат на новый. После того, как печать будет достигнута, низкая вероятность достичь "открыл" государство может иметь место. Это может быть связано с качеством внутреннего решения в. Внутренний раствор должен быть подготовлен непосредственно перед экспериментом. Использование вихря и ультразвуком имеют решающее значение, так как растворимость нистатин является довольно низкой. Для повышения вероятности открытия, внутренний раствор должен быть снова перемешивали в течение 10 сек, а затем обрабатывали ультразвуком в течение 30 до 60 сек. Это УрГУсоюзник повышает эффективность открытия клеток.

Чтобы стимулировать записанный OSN с пахучими веществами, протокол, представленные использует 7 баррель стимулирующее пипетки. Этот тип пипетки подразумевает ограничение числа одорантов и / или концентрации одорантов испытывали на каждом записанных клеток до семи. Это ограничение не является относительно важным в случае кривой доза-ответ, так как он может покрывать до 7 логарифмических единиц концентрации. Тем не менее, в случае скрининга экспериментов, в которых различные отдушки тестируемого, пипетки семь ствола может показать ограничений. В скрининг экспериментов, цель найти лиганд для меченых OSNs выражающих сиротой ИЛИ. Используя этот протокол будет требовать использования пахучих смесей. Каждую смесь вызывать реакцию будет затем делится на отдельные пахучих веществ. Это было сделано, чтобы экранировать аминов отдушки на Taar выражения OSNs 16. В этих экспериментах, флуоресцентные нейроны выражена TAARs и лиганда УНКNown. Использование протокола, авторы могли экран несколько десятков аминов пахучих веществ в смесях. Смеси, вызывающие реакцию затем разбивается на одного пахучих веществ для того, чтобы найти наиболее эффективный лиганд.

Расстояние между сайтом записи и стимулирующего пипетки должны быть выбраны разумно, чтобы свести к минимуму механическую стимуляцию клетки 20. Если давление слишком высокое (выше 30 фунтов на квадратный дюйм в наших условиях записи) и / или расстояния слишком маленькой (ниже 20 мкм), механический отклик в некоторых OSNs даже замаскировать одоранта ответ. Давление и расстояние между вспучивания пипетки и сайте записи также имеют важное значение для управления обмен решение во время стимуляции. Концентрация достижении нейрон был ранее оценивали быть как можно ближе к концентрации присутствующего в пипетку через серию испытаний 13. Эти тесты используются решение окрашены синим красителем для измерения начала и смещение тон стимуляции. Использование 20 фунтов на квадратный дюйм давления и 30 мкм расстояние, максимальная интенсивность раздражителя в пределах 300 мс. Смещение стимула также тщательно оценивать: так как препарат находится под непрерывным потоком раствора перфузировались, стимул промывают в течение 0,8 до 0,9 сек 13.

Запах свойства OSNs кодирования исторически измеряется либо через внеклеточного записей в естественных условиях или в результате экспериментов на изолированных клетках. У млекопитающих, внеклеточные записи были выполнены сначала в естественных условиях на крысах 21. В внеклеточного записей, или выражается в записанном клетки неизвестно, таким образом, ограничивая соотношение успеха, чтобы найти ячейку в ответ на одоранта испытания. Протокол позволяет записывать и характеристику определенных рецепторов в нейронах в клеточной среде эпителия. Поэтому свойства рецепторов "могут быть проанализированы на разных уровнях: специфический лиганд/ или взаимодействий в первом этапе трансдукции; Следовательно, агонисты / антагонисты взаимодействия различных лигандов тестируемых; свойства смесей интеграции определенных ОШ и роли трансдукции специфичности OSNs; влияние на обонятельную кодирования клеток в клетки-взаимодействий (например, GAP перехода) в пределах эпителия; и, наконец, модуляция трансдукции с помощью фармакологических агентов.

В диссоциированных клеток записей, как уже упоминалось ранее, процесс диссоциации удаляет слизь и взаимодействия клеток в клетке внутри обонятельного эпителия. Это может вызвать изменения в свойствах кодирования OSNs. Кальций изображений экспериментах на изолированных клетках часто сообщалось. Например, сообщалось кривые доза-ответ на M71 выражая OSNs в ответ на ацетофенон 7. Эти кривые доза-ответ круче кривых доза-ответами, полученными с использованием протоколаЗдесь представлены 4. Эти расхождения могут быть из-за клетка-клетки взаимодействий в неповрежденной подготовки, а также к удалению слизи в изолированных клетках. Слизь, как известно, содержат много белка и ферментов, участвующих в мероприятиях perireceptor основных для обонятельной трансдукции 22,23. В протоколе сообщалось здесь, сохранение структуры обонятельный эпителий и предполагаемый присутствие слизи способствуют сохранению встроенные функции одоранта кодирования в OSNs. Концентрации, используемые в протоколе указаны в моль / л и обычно в диапазоне от -3 10 -7 -10. Эти концентрации выше, чем концентрации, используемые в воздушных поэтапное записей (либо в локальном потенциале поля или внеклеточного записей). Эти различия могут быть обусловлены I) жидкую фазу из записей (и, следовательно, стимуляции) и б) медленное вымывание слизи в течение перфузии записи. На самом деле, смыв из Мюнхеннам и раздел аксонов OSNs "во время вскрытия может поддерживать, что подготовка представлены потенциально квалифицировать как" псевдо-нетронутыми ", а не" полностью нетронутыми "подготовки. Этот препарат представляет собой, однако, запись условиях, максимально приближенных в естественных условиях, как это возможно, и еще, вызывающие патч-зажим записи. Как и любой препарат в пробирке из организма млекопитающих, выживание остается времени ограничен. Это ограничение может быть связано с вымыванием из слизи, часть аксонов OSNs ", а также отсутствие циркуляции крови в рамках подготовки.

Протокол, представленные здесь позволяет записывать мембранные свойства обонятельных сенсорных нейронов. Этот метод может иметь несколько приложений, таких как анализ мембранных свойств OSNs, фармакологических исследований OSNs, модуляции пахучих кодирования свойств OSNs и deorphanization ПРС. События, записанные во время съемки кальция непотребнош и долговечны. Патч-зажим записи в настоящем Протоколе приводят к данным о быстрых событий в обонятельной трансдукции на уровне мембраны.

Записи, представленные здесь, выполнены в конфигурации патч-зажим. В этой конфигурации, мембрана свойства записанного клетки могут быть проанализированы, будь то обонятельный путь трансдукции техника или напряжение закрытого токи, участвующие. Эксперименты, использующие этот протокол может предоставить данные о модуляции одоранта свойства OSNs кодирования. Фармакологические агенты могут быть использованы для исследования обонятельной трансдукции в различных условиях: например, MDL12330A, блокатор аденилатциклазы III (ACIII) 24,25 могут быть применены в перфузии раствором, чтобы исследовать роль ACIII в одоранта ответ. Кроме того, этот протокол может быть использован, чтобы исследовать, как обонятельная свойства кодирования модулируются в различных условиях, таких как обонятельной среды <SUP> 18 или под влиянием гормонов, участвующих в кормления поведения 26. Наконец, этот протокол может также привести к данным о ИЛИ / взаимодействия лиганда и расшифровки агонистов / антагонистов деятельность на определенных ОШ или даже в случайно выбранных рецепторов 27.

Наконец, с ограничениями в связи с 7 баррель стимулирующего пипетки, этот протокол может быть также использован для deorphanizing ОШ. Как упоминалось ранее, в этом случае, несколько одоранта смеси могут быть проверены. Смеси, вызывающие реакцию должны быть разделены на отдельные одорантов испытывали на других клетках.

По ориентации OSNs выражая определенные ОШ, этот протокол обеспечивает мощные данные о ОШ, лигандов / ОШ взаимодействий, трансдукции свойств пути и сравнить свойства заданных населения OSNs в различных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
vibration table with Faraday cage TMC 63-500 SERIES required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment
optics
microscope Olympus BX51WI upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference
objectives Olympus LUMPLFL40XW at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
magnifier Olympus U-TVCAC ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode
camera Olympus DP72 a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary
filters Olympus/Chroma depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m
amplifier HEKA EPC10 USB monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer
software HEKA Patchmaster controls the amplifier during the experiment
micromanipulator Sutter MP225 precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift
electrode puller Sutter P97 with a FT345-B wide trough filament;  to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution
glass Sutter BF120-69-10 in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets
recording chamber Warner Instruments RC-26G a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.
stimulation
glass WPI TW100F-4 attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes
multibarrel puller MDI PMP-107-Z by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels
precision pressure injector  Toohey Company P/N T25-1-900 Single Channel    this precision pressure injector  controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V  TTLs
micromanipulator Narishige YOU-1 a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site
tubings N/A tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette
solutions/perfusion/chemicals
vacuum pump gardner denver 300 series a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps
perfusion system N/A N/A gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber
nystatin Sigma-Aldrich N3503 mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp
DIMETHYL SULFOXIDE Sigma-Aldrich D5879 used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch 
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 extracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 intracellular/extracellular solution
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 extracellular solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S9638 extracellular solution
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) Sigma-Aldrich 63140 extracellular solution
Glucose Sigma-Aldrich G8270 extracellular solution
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 extracellular solution
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) Sigma-Aldrich E3889 internal solution
Potassium hydroxyde Sigma-Aldrich P1767 internal solution
Methyl Sulfoxide Sigma-Aldrich W387509 intracellular solution
Hepes-Na Sigma-Aldrich H7006 intracellular solution
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 intracellular solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366, (6452), 283-286 (1993).
  2. Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
  3. Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23, (4), 483-489 (1998).
  4. Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
  5. Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92, (1-2), 31-40 (1999).
  6. Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, (1), 175-187 (1991).
  7. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22, (8), 3033-3043 (2002).
  8. Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61, (2), 220-233 (2009).
  9. Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35, (4), 681-696 (2002).
  10. Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117, (6), 833-846 (2004).
  11. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5, (4), 263-278 (2004).
  12. Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29, (46), 14545-14552 (2009).
  13. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (6), 1970-1975 (2006).
  14. Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38, (2), 2210-2217 (2013).
  15. Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51, (3-4), 79-88 (2012).
  16. Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33, (7), 3228-3239 (2013).
  17. Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34, (8), 695-703 (2009).
  18. Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34, (14), 4857-4870 (2014).
  19. Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
  20. Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10, (3), 348-354 (2007).
  21. Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284, (5423), 2171-2174 (1999).
  22. Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296, (9), 1333-1345 (2013).
  23. Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30, (1), 3-19 (1996).
  24. Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
  25. Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84, (1), 575-580 (2000).
  26. Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101, (6), 2898-2906 (2009).
  27. Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31, (1), 273-280 (2011).
Перфорированные патч-зажим записи из мышей Обонятельные сенсорные нейроны в неповрежденном нейроэпителии: Функциональный анализ нейронов выражая идентифицированного одоранта рецептор
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor. J. Vis. Exp. (101), e52652, doi:10.3791/52652 (2015).More

Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor. J. Vis. Exp. (101), e52652, doi:10.3791/52652 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter