Summary
여기서는 원리 증명 가의 아데노 바이러스 타입 5 (의 Ad5) 벡터를 생성하는 프로토콜을 제시의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-그의 항원 캡시드 혼입 전략을 이용하여. 이 벡터는 성적 체력을 나타내는 것으로 입증되었다, 기능은 통합 항원의 Ad5 양성 시험관 내에서 혈청 및 항원뿐만 아니라 면역 원성을 탈출.
Abstract
아데노 바이러스 혈청 형 5 (의 Ad5)를 광범위하게 백신 개발을위한 기존의 형질 전환 방법으로 수정되었습니다. 임상 시험 전통적으로 이러한 변형 된 Ad5 벡터의 감소 효능은 주로 인구 중 대다수의 Ad5 기존 면역성 (PEI)과 상관 될 수있다. 의 Ad5 PEI의 우려를 해결하여의 Ad5-벡터화 백신 개발을 촉진하기 위해, 혁신적인 항원 캡시드-설립 전략은 사용되어왔다. 이 전략의 장점으로, 우리가 처음 hexon 셔틀 건설의 Ad5가-벡터화 플라스미드 HVR1-KWAS-HVR5 - 그 이전에 건설 셔틀 플라스미드 HVR5-그의 6 / pH5S에 가변 영역 (HVR) hexon의 1 서브 클로닝하여 6 / pH5S, 그의 6 태그 HVR5에 통합했다있다. HIV 에피토프를 함유 ELDKWAS HVR1이 DNA 단편을 합성 하였다. HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 / pH5S 후 선형 및 선형 백본 플라스미드 pAd5 / ΔH5 (GL)와 공동으로 형질 전환상동 재조합합니다. pAd5가 / H5는-HVR1이-KWAS-HVR5이-그의 6 세포로 형질 전환 된이 재조합 플라스미드는 바이러스 벡터의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6을 생성합니다. 이 벡터는 실제 바이러스 역가 (VP / ㎖)로 표시 질적 니스 전염성 역가 (IP / ㎖) 및 대응 VP / IP 비율을 갖도록 검증 하였다. 모두 HIV 에피토프와 그의 6 태그는 표면에 노출 된 Ad5 캡시드에 있었고, 자신의 에피토프 특정 항원을 유지했다. 중화 분석은 시험 관내에서의 Ad5 양성 혈청에 의해 중화를 우회하기 위해이 가의 벡터의 능력을 나타내었다. 마우스 예방 접종은 HIV 에피토프 6 그분에 강력한 체액 성 면역 특정의 생성을 보여 주었다. 이 원리 증명 연구 캡시드 항원 혼입 전략과 연관된 프로토콜을 실행 가능하게 상이한 캡시드 단백질을 수정의 Ad5-벡터화 백신의 생성을 위해 이용 될 수 있다고 제안했다. 이 프로토콜은 심지어 수 f를urther 희토류 혈청 형 아데노 - 벡터화 백신의 생성을위한 개질.
Introduction
인간 아데노 바이러스 (AD)는 이중 가닥 DNA 게놈을 포함하는 뉴 클레오 캡시드 면체와 중형, 비 - 외피 바이러스이다. 광고는 일곱 그룹으로 분류 (G 통해)와, 아데노 바이러스 제품군에 속한다. 각 그룹은 다른 혈청 형의 바이러스가 포함되어 있습니다. 그룹 C에서, 아데노 바이러스, 이는 혈청 형 5의 (의 Ad5)의 가장 광범위하게 연구되어 왔으며 가장 널리 유전자 치료 백신과 같은 벡터화에 대한 적용 방법.
전통적인 유전자 전략 개발 및 유전자의 관심을 가진 바이러스 초기 유전자의 변위 특징으로 된 Ad5 변형, 적용, 및 유전자의 관심 숙주에서의 발현 집중되었다. 예를 들면 유인원 면역 결핍 바이러스 1 회전 유전자 초기 유전자 3 (E3)을 대체하여 pENV9 / Ad5hrΔE3의 건설이다, 인간 면역 결핍의 개그 유전자 초기 유전자 1 (E1)을 대체하여 AdCMVGag의 건설바이러스 (HIV) 2, 락 Z 유전자 3 (E1)를 교체하여 광고 락 Z의 건설. 의 Ad5에 전통적인 유전자 전략의 광범위한 애플리케이션은 다음의 장점에 의존의 Ad5, 바이러스 및 바이러스 증식에 가능한 유전자 공학, 외래 유전자 삽입의 대형 숙박 시설과의 Ad5 4,5의 안전을 위해 호스트 다양한. 그러나,이 전략을 이용하여 벡터화 된 Ad5-임상 치료의 감소는 효능의 Ad5 어린이와 어른의 4,6- 중 대다수 만연해 때문에, 주로의 Ad5 PEI과 연관 매핑 된 주요 병목왔다.
의 Ad5의 주요 병목 현상을 극복하기 위해, 주요 목적은 PEI의 Ad5를 우회 대체 전략을 개발하는 것이다. 이러한 중화 항체 (NABS) 8-10 및 CD8 + T 세포 반응 등의 선천성 면역 7, 적응 면역이의 Ad5에 대하여 (10)는 공동 것으로 나타났다의 Ad5 NABS가의 Ad5 PEI 10, 11에 기여에서 지배적 인 역할을 할 것으로 나타나는으로의 Ad5 PEI에 ntribute. 또한,의 Ad5의 주요 단백질 hexon, 섬유 및 펜톤 기본 포함 캡시드 단백질에있는 대상 에피토프를, NABS. 그중 hexon는의 Ad5 NABS 8,11-13의 주요 대상입니다. 이러한 발견에 기초하여, 혁신적인 캡시드 항원 혼입 전략이 도입되었다. 이 새로운 전략은 NABS하고 효율적인의 Ad5 벡터 행정에 의해 감소 된 인식으로 이어지는, 단백질-의 관심의 Ad5 중화 에피토프를 이동 또는 마스크의 Ad5 캡시드 단백질에의 교체 또는 통합을 강조한다. 그것은 또한 호스트가 직접 면역 시스템 4,14,15 항원에 관심 - 제시하여 강력한 체액 성 면역 및 세포 면역 효능을 유도 할 수 있기 때문에 도움이 전략이 경쟁력 있음을 주목할 만하다. 이러한 전략에 기초하여, 분자 클로닝 및 재조합 바이러스 벡터 광고 구조는 구조적으로 분할 될 수있다네 가지 주요 단계로, (a) 중 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 합성에 의해 유전자의 관심 단편의 제조; (b) 아데노 백본 유전자 단편의 관심과 상 동성 암을 포함하는 셔틀 플라스미드 내로 유전자 단편의 라이 게이션; (c)에 의한 상동 재조합 공동 바뀌는 선형화 된 플라스미드 백본 pAd5 / ΔH5 (GL) 16 유전자의 관심 단편을 포함하는 셔틀 플라스미드; (D) 선형화 재조합 아데노 바이러스 플라스미드의 형질은 항원 - 중 - 관심 통합 재조합 광고 벡터를 구출한다.
우리 그룹과 일부 다른 사람은 다른 감염성 병원균에 대한 광고 벡터화 백신 개발이 대안 광고의 통합 전략을 드리고 있습니다. 우리는 재조합 광고 벡터의 생성을보고 광고 - HVR1-LGS-자신의 Ad5의 hexon (hexon5)의 HVR1 로케일로 그의 태그가 HIV-1 항원 (V3)을 통합하여 6 -V3. 이 생성 된 벡터는 STR 트리거V3 에피토프 4 특정 옹 체액 성 면역 반응. 우리는 또한 hexon5 2의 HVR2 로케일로 HIV-1 막 인접 ectodomain 영역 (MPER)를 통합하여의 Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1의 개발을보고했다. 또한, 닥터 서주의 그룹 애드 혈청 형 3 (AD3) 벡터화 백신, 즉. 개발이 광고 혼입 전략의 장점을 사용한, AD3의 HVR1으로 엔테로 바이러스 71의 중화 에피토프 SP70을 통합하여 바이러스 벡터 R1SP70A3의 세대 hexon (hexon3). R1SP70A3은 엔테로 바이러스 (71) 도전 (15)에 대한 보호의 높은 비율로 이어질 에피토프 SP70에 특정 강한 NABS 및 IFN-γ 생산을 생성.
기술 참조의 목적을 위해, 우리의 연구는 HVR1에 HIV-1 항원을 통합하여 가의의 Ad5 벡터의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6의 생성에 초점을 질적 항원 캡시드-설립 전략을 이용했다다 hexon5의 HVR5에 자신의 태그입니다. 생성 된 바이러스 벡터는 또한 면역 학적으로 평가 하였다. 항원 캡시드-설립 전략은 다른 감염성 질병에 대한의 Ad5-벡터화 예방 접종 방법의 발전으로 활용 될 수있다.
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Protocol
승인 된 프로토콜 번호 101109272에서 본원에 기재된 버밍엄 기관 동물 사용 및 관리위원회에서 알라바마 대학은 마우스의 사용을 승인했다.
1. 유전 건설 수정 된 플라스미드 pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 항원 캡시드-설립 전략
- 셔틀 플라스미드의 건설 HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 / pH5S
- hexon5 유전자의 AccI로 제한 효소 부위 사이 AgeI 합성 DNA 서열 HVR1-KWAS을 함유하는 플라스미드를 주문한다.
- 37 ℃에서 3 시간 동안 효소 AgeI (6 단위)과 AccI (6 단위)으로 합성 된 조각 (HVR1-KWAS)의 6 μg의 다이제스트. 전기 영동에 의한 2 % 아가로 오스 겔에서 분해 단편을 해결 한 제조사의 프로토콜에 따라 DNA 겔 추출 키트 단편을 정제.
- 삽입의 몰 비율을 바탕으로 3에서 벡터에 : 1, T4 DNA 리가 아제와 리가 B를 사용uffer는 이전에 구축 셔틀 플라스미드 100 NG로 조각 (HVR1-KWAS)의 12 NG를 결찰하는 HVR5-그의 6 / pH5S 2 시간 동안 실온에서 10 μL 볼륨 17, AgeI 및 AccI의 사이트를 통해.
- (1800 V에서) electroporator에 electrocompetent DH5α 세포의 50 μL로 결찰 제품의 10 μL 중 1 μl를 변환. 형질 전환 된 DH5α 세포를 SOC 배지 950 μl를 넣고 300rpm으로하여, 37 ° C에서 1 시간 동안 혼합물을 배양한다. 카나마이신을 포함하는 루리아 - 베르 타니 (LB) 한천에 1 ml의 혼합물을 100 ~ 200 μl를 확산하고 37 ℃에서 O / N을 품어.
- ~ 조각 HVR1-KWAS를 대상으로 PCR 10 식민지를 화면으로, 앞으로 프라이머 (TATGTGTGTCATGTATGCGT)를 혼합 (제조사의 프로토콜에 따라) PCR 마스터 믹스 솔루션에 프라이머 (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) 단일 DH5α 식민지 역. PCR 마스터 믹스 솔루션과 함께 제공되는 설명서를 참조하여 열 순환기에 샘플을 실행.
- 섹션 1.1.4.1에서 상영 클론의 조각 HVR1-KWAS을 시퀀싱하는 정방향 프라이머 (TATGTGTGTCATGTATGCGT)를 사용합니다.
- 플라스미드 pAd5 / 건설 H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6
- 다이제스트 6 μg의 HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 / 37 ° C에서 3 시간 동안 효소를 EcoRI (6 단위)과 PmeI (6 대)와 pH5S 및 상동 재조합 무기와 이중 수정 hexon5 유전자를 포함하는 단편을 정제, 로 단계 1.1.2에 명시된. 백본 플라스미드 SwaI와 pAd5 / ΔH5 (GL) 16 선형화.
- 셔틀 플라스미드에서 대상 단편 100 NG와 (1800 V에서) electroporator의 상동 재조합에 대한 electrocompetent BJ5183 세포의 50 μL에 선형화 pAd5 / ΔH5 (GL) 백본의 100 NG를 공동-변환. 형질 전환 된 세포에 SOC 매체의 950 μl를 추가하고 37 ℃, 300 rpm에서 1 시간 동안 혼합물을 품어. 1 ml의 혼합물의 200 μL - (100)를 확산37 ℃에서 O / N 항온 처리 용 카나마이신 (최종를 50㎍ / ㎖)을 함유하는 LB 한천.
- 선택 ~ 3 ㎖에 10 작은 식민지 진탕 (250 rpm으로, 37 ° C)에서 O / N 배양을위한 카나마이신 (최종 50 μg의 / ㎖)를 포함하는 액체 LB. 문화 플라스미드의 압축을 풉니 다. 단계 1.1.4.1에 도시 된 바와 같이, 단편 HVR1-KWAS을 대상으로 10 콜로니를 선별하기 위해 PCR 분석을 사용한다.
- 백본 게놈의 PIX 단편을 대상으로 PCR 분석에 의해 같은 식민지를 화면으로, 앞으로 프라이머 (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT)를 혼합, (제조사의 프로토콜에 따라) PCR 마스터 믹스 솔루션에 프라이머 (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) 단일 BJ5183 식민지 역. PCR 마스터 믹스 솔루션과 함께 제공되는 설명서를 참조하여 열 순환기에 샘플을 실행합니다.
- pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6으로 PCR을 두 번 긍정적 인 식민지를 지정합니다.
- 에 플라스미드 pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 100 NG를 변환단계 1.1.4에 도시 된 바와 같이 세포를 DH5α한다.
- 단계 1.1.4.1에 도시 된 바와 같이, 단편 HVR1-KWAS을 대상으로 10 ~ 콜로니를 선별하기 위해 PCR 분석을 사용한다.
- 단계 1.2.2.2에 도시 한 바와 같이, 백본 PIX 게놈 단편을 표적으로 동일한 콜로니를 선별하기 위해 PCR 분석을 사용한다.
- pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 조각 HVR1-KWAS을 시퀀싱하는 정방향 프라이머 (TATGTGTGTCATGTATGCGT)를 사용합니다.
수정의 Ad5 바이러스 성 벡터의 Ad5 / 2. 준비 H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6
- 고 글루코스 DMEM로 FBS (최종 10 %), 100X 비 필수 아미노산 (최종 0.1 mM)을 200 mM의 L- 글루타민 (최종 2 mM)을하고 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액 (최종 1 %)을 첨가하여 완전한 배지를 구성 . (85 % 습윤 조건하에 37 ℃ 및 5 % CO2) 배양기에서 완전 배지에서 인간 배아 신장 (HEK293) 세포를 유지한다.
- 바이러스는했습니다의 구조ctor에의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6
- 완전 배지 및 배양 O / N 5 mL를 함유 한 T-25 플라스크에 종자 HEK293 세포를 3.0 × 106 80 %와 합류 단층을 달성했다.
- 15 μg의 선형화 pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 3 시간 동안 37 ° C에서 제한 효소 PACI (15 대)와 100 μL 볼륨에서.
- 추출 선형화 pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 페놀 동량 (1 분 동안 10,000 XG) 회 반응을 원심 분리하여 클로로포름 : 내의 흄 후드 이소 아밀 알코올 (: 24 일 25시 비율) 및 혼합 된 용액 (100 % 에탄올 300 μL 및 나트륨 아세테이트 10 μL) 및 70 % 에탄올 700 μL 순차 원심 분리 (10 분 동안 10,000 XG)에 의해. 각각의 원심 분리 단계에서 상층 액을 버린다.
- 정제 된 플라스미드 ~ 증류수 또는 트리스 - EDTA (TE) 버퍼의 40 μl를 재현 탁. 광학 드를 측정함으로써 플라스미드 DNA를 정량nsity 260 nm의 (OD).
- 제조업체의 설명서에 따라, T-25 플라스크 상업 리포좀 형질 전환 시약과 선형화 된 플라스미드의 3 μg의를 형질. 6 시간 배양 인큐베이터에서 후 형질 전환 이후의 배양에 완전한 매체와 형질 매체를 변경합니다. 각각의 바이러스 성 플라크 형성 할 때까지, 모든 2-3일 완전한 매체를 대체하여 형질 전환 된 세포를 유지한다.
- 플라크는 전체 세포 병변 효과 (CPE)를 개발할 경우, 무균 후드 플라스크 오프 나머지 세포를 긁어, 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 매체를 원심 분리하여 수확 된 세포 용 해물. 2 % FBS를 함유하는 배지 ~ 1 ㎖ 중의 세포 펠렛을 일시 중단하고, 동결 - 해동 네 배 세포 파괴. 4 ℃에서 10 분 동안 10,000 XG에 해물을 원심 분리 한 후 구출 바이러스를 포함하는 상층 액을 수집합니다.
- 바이러스 벡터의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6의 대규모 전파
- 일을 전파T-25 플라스크에서 전체 용해질을 1/3로 감염시켜 무균 후드 HEK293 세포를 포함하는 T-75 플라스크에서 E 바이러스. 전체 CPE는 문화 인큐베이터에서 2~3일 내에서 개발을 허용합니다. 단계 2.2.5에 명시된 해물 상층 액을 수확.
- 바이러스 전파 환경에 따라, T-75 플라스크에서 전체 용해질 1/2로 감염시켜 무균 후드 1-3 T-175 플라스크에서 바이러스를 전파. 전체 CPE는 문화 인큐베이터에서 2~3일 내에서 개발을 허용합니다. 단계 2.2.5에 명시된 해물 상층 액을 수확.
- 이전 T-175 플라스크 (들)에서 전체 해물에 1/2 감염에 의해 멸균 후드에 한 12 이상의 T-175 플라스크에 바이러스를 전파. 바이러스 전파 조건 및 필요한 바이러스의 양에 기초하여 플라스크 사용량을 결정한다. 전체 CPE는 문화 인큐베이터에서 2~3일 내에서 발생하는 경우 단계 2.2.5에 명시된 해물 상층 액을 수확.
- 을 정제세슘 클로라이드의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 가스화
- 5 mM의 HEPES에서 협동 학습 솔루션의 두 가지 밀도 준비 : 1.33 ml의 G / 및 1.45 ㎍ / ㎖, CSCL과의 접촉을 피하고있다.
- CSCL의로드 4 ml의 멸균 초 원심 분리기 튜브 (1.33 ㎍ / ㎖), 부드럽게 튜브의 바닥에 대한 CSCL의 4 ㎖ (㎍ / ㎖ 1.45)를로드합니다. 로드 천천히 멸균 후드에 그라디언트의 상단에 해물 상층 액 4 mL를.
- 결함 / 높은 바이러스 밴드에서 성숙 / 낮은 바이러스 밴드를 분리하기 위해 4 ℃에서 3 시간 동안 110,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 33 G 바늘로 무장 한 3 ML의 주사기를 사용하여 낮은 밴드를 수집하고 멸균 후드에 4 ml의 볼륨에 5 mM의 HEPES와 함께 밴드를 희석.
- 단계 2.4.2에 기술 된 바와 같이 두 개의 협동 학습 솔루션의 밀도와 바이러스의 희석 밴드와 다른 튜브를 넣습니다. 4 ℃에서 11 만 XG의 O / N에서 튜브를 원심 분리기. 단계 2.4.3에 설명 된대로 바이러스 밴드를 수집합니다.
- dialys에서 수집 된 바이러스 용액을 주사멸균 후드에 33 G 바늘로 무장 한 3 ML의 주사기에 의해 카세트입니다.
- 1X 투석 완충액 700 ㎖ 중의 카세트를 배치 (1 L의 레시피 10 배 PBS 100 ㎖, 100 % 글리세롤 100 ㎖ 및 증류수 800 ㎖; 0.22 μm의 필터를 통해 버퍼를 필터링) 및 투석 버퍼를 교체 매 3 4 시간에 대한 시간. 니들 주사기를 사용하여 투석 된 바이러스 용액을 대기음.
구출 바이러스 성 벡터의 3. 검증
- 바이러스 성 벡터 적정의
- (10)와 1 : 바이러스 물리적 역가를 들어, 바이러스 및 하나의 투석 완충액 (배경 제어) 모두 희석 바이러스 용해 완충액에서 20 (10 % SDS에서 트리스 EDTA) 작은 튜브, 및 56 ℃에서 모든 튜브 부화 10 분.
- biophotometer 켜고 OD 260 nm에서 흡광도의 모드를 설정합니다. "빈"아래를 클릭하여 배경 신호를 균형 : 희석 투석 버퍼 (10 일)를 사용합니다. biophotometer의 SCR의 유형 "10 + 90"EEN 및 희석 바이러스의 신호 (10 1) 판독.
- 단계 3.1.2의 방법에 따라, 대신 biophotometer 화면에서 "5 + 95"을 입력 : 희석 된 바이러스의 신호 (20 일)을 참조하십시오. 1.1 × 12 개의 바이러스 판독 숫자를 곱하면 두 희석에서 두 개의 개별 역가에 근거 부사장 / ㎖로 단위로 평균 역가를 계산한다.
- 감염성 바이러스 역가 (IP / ㎖)을 위해 10 일 후 감염에 HEK293 세포에 감염 깊이를 결정하기 위해 통계적 KARBER TCID (50)을 사용하여 방법 14 (dpi)로
- 바이러스 벡터에 항원 노출 디스플레이의 평가
- 코트 ELISA 플레이트에 바이러스 벡터 및 표준 ELISA 법 (14)의 나머지 단계를 진행합니다. 통합 항원 (14)에 대응의 검출에 대한 인간의 안티 gp41 (2F5) 단일 클론 항체 (단클론 항체) 및 마우스 항 - 그의 태그 단클론 항체를 사용합니다.
- denatu에 바이러스 벡터를 해결붉은 단백질 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 및 웨스턴 블롯 표준 방법 (14)의 나머지 단계를 진행. 통합 항원 (14)에 대응의 검출에 대한 인간의 안티 gp41 (2F5) 단일 클론 항체 (단클론 항체) 및 마우스 항 - 그의 태그 단클론 항체를 사용합니다.
- 의 Ad5-positve 혈청을 우회 할 수있는 능력에 벡터의 생체 외 평가
- 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2 85 % 미만 가습 조건)에 완전 배지에서 헬라 세포를 유지한다. FBS (최종 10 %), 200 mM의 L- 글루타민 (2 mM의 최종) 및 최소 필수 중간 이글 (MEME)로 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액 (최종 1 %)을 첨가하여 완전한 배지를 구성한다.
- 1 × 6 전지에서 6 웰 플레이트에서 씨앗 헬라 세포 / 웰, 2 시간 동안 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2 85 % 미만 가습 조건)에서 번호판을 품어. (바이러스 벡터의 5 IP / 셀과의 Ad5 양성 혈청 (0.1 μL 0 μL)을 품어AD5 또는의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 1 시간 동안 배양 인큐베이터 6) 세포를 포함하는 6 웰 플레이트에 혼합물을 추가하기 전에.
- 24 시간이 (HPI)를 감염 게시물, 용해 완충액 0.5 ㎖에 한 번 PBS와를 Lyse 세포와 세포를 씻어. 5 분 15,000 XG에 원심 분리기와 뜨는를 수집합니다. 바이러스는 루시페라아제 유전자가 포함되어 있기 때문에, 루시페라아제 신호 판독 용 루시페라아제 기질 100 ㎕와 20 ㎕의 상등액을 섞는다.
구출 바이러스 성 벡터의 4. 면역 학적 평가
- 의 Ad5과의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 : 두 예방 접종 그룹을 준비합니다.
- 이주의 간격으로, 상동 "프라임 - 부스트"면역 요법에, 1 × 10 VP / 마우스에서 바이러스 근육 (N = 8 / 그룹) 마우스를 주입한다.
- 2 주마다 주사를 게시에서, 동물 란셋 (5mm 팁 길이)에 출혈 뺨에 의해 마취없이 마우스를 피1.5 ml의 튜브에 혈액을 수집합니다.
- 상하 반전에 의해 튜브에 혈액을 혼합하고, 실온에서 30 분 동안 배양 한 피. 5 4 ° C에서 분, 새로운 1.5 ml의 튜브로 전송 혈청 (상단 층) 10,000 XG에서 튜브를 스핀.
- 5 4 ° C에서 최소 및 전송 혈청 10,000 XG에서 새로운 튜브를 스핀 새로 -80 ℃에서 저장을위한 1.5 ml의 튜브를 표시합니다.
- 혈청 기반 ELISA에 의한 항원 특이 체액 성 면역의 평가
- 그의 펩타이드 (1 mM의에서 주) 및 HIV-1 펩타이드 (1 mM의에서 주) 별도로 100에 희석.
- mM의 탄산 완충액 (pH 9.5)의 10 μM에서 펩티드 코팅 농도를 달성한다. 코트 별도로 4 ℃에서 판 O / N을 잘 당 100 μL를 추가하고 배양에 의해 희석 된 펩티드와 ELISA 플레이트.
- PBST 5 % BSA에서 1 시간 동안 200 / μL 잘 블록에서 네 번 PBST로 접시를 씻으십시오. 1 판에 마우스 혈청을 적용 : 100 희석을 차단 버피에FER, 100 μL / 웰. 실온에서 2 시간 배양을 위해 품어.
- 사 회 PBST로 접시를 씻으십시오. / 웰 100 μL의 블로킹 완충액에서 실온에서 30 분 동안 배양함으로써 플레이트를 차단.
- 100 μL에서 / 잘 개별적으로 그의 펩타이드 및 HIV-1 펩티드로 코팅 된 플레이트에 모두 : (차단 버퍼에 5000 1) 염소 항 - 마우스 IgG-HRP를 적용합니다. 실온에서 2 시간 동안 품어. PBST로 접시를 씻으십시오.
- 30 분 동안 HRP 기판에 배양 한 후 OD450의 nm에서 번호판을 읽어보십시오.
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Representative Results
캡시드 항원 혼입 전략 (도 1a)은 이가의 Ad5 바이러스 벡터의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 그의-6를 생성하는데 이용되었다. 첫째, 셔틀 플라스미드 HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 / pH5S가 이전 건설 셔틀 플라스미드 HVR5-그의 6 / pH5S 17에 HVR1-KWAS 단편을 서브 클로닝에 의해 건설되었다. 둘째, 플라스미드 pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 (14) "를 EcoRI-HVR1-KWAS-HVR5-을 His6-PmeI"의 조각과 SwaI - 선형화 pAd5 / ΔH5 사이의 상동 재조합에 의해 건설되었다 (GL ) (16) (그림 1B). PACI의 형질 소화 pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 바이러스 벡터의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 (14)의 구조에 T-25 플라스크 리드에 6. 구조 된 바이러스 벡터는 대규모 전파 및 협동 학습 구배 초 원심 분리기의 2 사이클에 의해 정제 하였다.
하기 위해서의 Ad5가 / H5-HVR1-KWAS-HVR5이-그의 6, 물리적 역가가 바이러스 게놈의 물리적 복사본을 측정하여 / ml의 1.3 × 10 (11) 부사장에서 측정 된 구조 바이러스 벡터의 생존 / 체력을 증명하고, 감염 역가이었다 실제 감염성 바이러스 입자를 적정하여 1.4 × 10 9 IP / ㎖에서 결정. VP / IP 비는 이후 92 (14). 일반적으로 계산 된, 1,000 이하의 부사장 / IP 비율이 광고는이 바이러스의 질적 인 체력을 나타냅니다. 이 구조 바이러스 항원, HIV 항원과 바이러스 캡시드 주요 단백질 hexon5의 표면에 각각 자신의 태그를 표시할지 여부를 설명하기 위해, ELISA는 각각 인간의 2F5 단클론 항체와 마우스 항 - 그의 태그 단클론 항체로 수행되었다. 결과가 있었다 반면 두 사람의 2F5 단클론 항체 (그림 2A) (14)와 마우스 항 - 그의 태그 단클론 항체 (그림 2B) (14),의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 결합을 보였다 것으로 나타났다에는 부정적인 contro에 결합하지L 벡터의 Ad5. 웨스턴 블롯 분석은 단지 바이러스의 Ad5 모두 인간 2F5 단클론 항체 (도 2C) (14)와 마우스 항 His 태그를 단클론 항체 (도 2d) (14) 검출 같이 ELISA에 데이터를 확인하는 117 kDa의 주변의 특정 대역을 사용 하였다 / H5- HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 hexon5 단백질의 크기에 대응한다. 의 잠재력을 평가하기 위하여의 Ad5 / 프로토콜 섹션 3.3에 명시된 바와 같이 H5-HVR1-KWAS HVR5-6의 Ad5-그의 양성 혈청에 의해 중화를 우회에서 중화 검정 분석을 수행 하였다. 결과는 상대적인 형광 단위의 Ad5-positve 혈청 0 μL 처리 바이러스 벡터의 Ad5로부터 (RLU) 신호의 Ad5-positve 혈청 0.1 μL (p 값 <0.001로 처리 동일한 벡터에서보다 12 배 더 높은 것으로 나타났다 ). 이것의 Ad5-positvive 혈청에 의한 벡터의 Ad5의 중화를 제안했다. 대조적으로, 바이러스 벡터의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 그의-6에서 거의 차이가 있었다0 μL와의 Ad5-positve 혈청 0.1 μL (그림 3)로 처리. hexon는 중화 항원이 hexon 12, 18, 20, 22의 모든 HVRS에있는 주요 광고 NABS의 목표 및 hexon 별이기 때문에, 데이터는 위의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6의 Ad5-positve 혈청으로 중화 탈출 시연 의 잠재적 인 생체 외 및 제안의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 호스트에서의 Ad5 PEI를 우회합니다.
항원 캡시드-설립 전략 수정 가의의 Ad5 바이러스 벡터가 통합 된 항원 -의 이익과 관련된 강력한 체액 성 면역을 유도 할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, "프라임 - 부스트"면역 요법은 제어 바이러스 벡터의 Ad5과 함께 마우스를 면역에 적용되었다 가의 벡터의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6. HIV-1 펩티드로 코팅 세라 기반 ELISA는의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6의 예방 접종 군에서 혈청 significan 있었다는 것을 보여 주었다대조군 (p 값 <0.001) (도 4a) (14)로부터의 혈청에 비해 t 40와 640 사이의 희석에 HIV-1에 결합하는 펩티드. 그의 펩티드로 코팅 된 ELISA 세라 기반 대조군 혈청과 비교했을 때의 Ad5 /의 면역화 그룹에서 혈청 H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 통계적 p 값으로서, 그의 펩타이드 결합 유의 한 것으로 나타났다 < 320 희석 (도 4b)에서 14 (160) 및 p 값 <0.05의 희석 40, 80, p 값 <0.01의 혈청 희석액에 0.001. 이상의 결과 가의 바이러스 벡터에 혼입 항원에 대한 체액 성 면역 반응의 발생을 나타내었다.
항원 캡시드-설립 전략 플라스미드 pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6의 유전 구조의 그림 1. 도식 그림. (A) 항원 캡시드-설립 전략은 직접 항원의 관심 아데노 바이러스의 캡시드 단백질 (hexon, 펜타베이스, PIX 및 / 또는 섬유)에 표시 특징입니다. 이 그림은 Nemerow에서 적응했다 등. 2009 년 바이러스학 384 (2009) 380-388은, 저작권 엘스 비어. (나) 유전자 단편 (HVR1-KWAS)는 합성 및 회사에 의해는 pUC 벡터에 클로닝 하였다. 이 조각은 HVR5-그의 제한에 의해 6 / pH5S이 AgeI과 AccI이 HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 / pH5S를 생성하는 효소 이전에 건설 셔틀 플라스미드에 서브 클로닝 하였다. 얻어진 셔틀 플라스미드를 재조합 백본 플라스미드 pAd5 / H5-HVR1-KWAS의 생성의 결과로, 효소를 EcoRI 및 PmeI, 공동 형질 SwaI-선형화 백본 플라스미드 pAd5 / ΔH5 (GL)과 상 동성 재조합 용 분해시켰다 -HVR5-그의 6. 이 도면에서, R1은 HVR1을 나타내고 R5가 HVR5이고, GL은 녹색 형광 단백질 (GFP)과 lucife를 나타내고새기다는 별도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
가의 바이러스 벡터의 캡시드의 표면에 결합 항원의 항원 노출 그림 2. 평가의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 통합 항원이 벡터에 노출 된 경우 ELISA를 결정하기 위해 실시 하였다 6. 전체 바이러스 벡터 표면은 자신의 항원 특성을 유지하면서. ELISA 플레이트 가의 벡터로 도포하고, 인간 단클론 항체 2F5 (A) 또는 마우스 단클론 항 - 그의 (B)와 함께 배양 하였다. 데이터가 아닌 제어 된 Ad5 벡터에, 가의 벡터로 항체의 상당한 결합을 나타내었다. R1은-KWAS-R5는 그의-6의 Ad5 / H5를 나타낸다-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6. 웨스턴 블롯 분석은 가의 벡터에 혼입 항원 인간 단클론 항체 2F5 (C) 또는 마우스 단클론 항 - 그의 (D)의 결합 항원을 확인 하였다. 모두 (C)와 (D)에서, 레인 1의 Ad5을 나타내고, 레인 2는 표시의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
의 Ad5-positve 혈청 체외. 중화 분석에 의해 중화을 탈출하는 이가 바이러스 벡터의 능력 그림 3. 평가 가의 벡터 중화 탈출 할 수 있는지 확인하기 위해 수행되었다. 결과는 혈청에서의 Ad5 바이러스의 중화를 지시하지만, ES체외에서 이가 바이러스의 중화 케이프. 이 그림에서, R1-KWAS-R5-그의 6의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6을 의미한다. 별표 (*) *** p 값 <0.001을 나타낸다.
마우스 모델에서 이가 바이러스 벡터에 의해 체액 성 면역의 생체 내 세대에서 그림 4. ELISA 세라 기반 가의 벡터의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6에 포함 된 단백질에 대한 체액 성 면역을 평가하는 데 사용되었다 . HIV-1 펩타이드 (A) 및 그의 펩타이드 (B)는 두 면역화 그룹의 마우스 혈청과 인큐베이션 별도로 ELISA 플레이트에 코팅 하였다 (의 Ad5과의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6) . 데이터는 H에서 HIV-1 항원에 대한 체액 성 면역 반응의 중요한 발생을 표시VR1 (A) 및 그의 HVR5에서 태그 (B). 각각의 데이터 포인트는 수단과 팔 복제에서 SD를 나타냅니다. 별표 *** ** p 값 <0.01를 나타내고, * p 값 <0.05를 나타내고, p 값 <0.001을 나타낸다.
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Discussion
백신의 개발을위한 변형 된 Ad5에 전통적인 유전자 전략의 애플리케이션은 주로 기인 된 Ad5 PEI 4,6-와 연관된 병목 감소되었다. 이 병목 현상은 부분적으로이 전략의 Ad5 NABS에 의해 중화을 회피 할 수 있기 때문에 항원 - 중 - 관심의 Ad5의 중화 에피토프를 대체하여, 다른 항원 캡시드-설립 전략 (그림 1A)의 응용 프로그램에 의해 감소하고, 강력한 면역의 생성을 촉진 할 수있다 통합 된 항원 -의 이익에. 본 연구에서는 수정 된 이가 바이러스 벡터의 생성의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 개념 예 (그림 1B)로 도입되었다. 프로토콜 섹션 1.1.1에 해당하는 주문 플라스미드의 합성 단편 hexon5의 HVR1 로케일에서 HIV-1 gp41 짧은 유전자 치환을 포함한다. 부분 gp41 유전자는 대체 에피토프 ELDKWAS을 인코딩아미노산 hexon5 (14)의 139-144에서 부분 HVR1. ELDKWAS는 HIV-1 gp41 (19)의 강력한 중화 에피토프이다.
복제시에, 두 가지 중요한 단계가 있었다. 프로토콜 섹션 1.1.1에서 유전자 단편의 관심을 합성 할 때 한 두 단계는 제한 효소의 선택이었다. 두 효소의 선택은 조건부 수정할 광고 캡시드의 위치, 즉에 따라 달라집니다. 본 연구에서는 KWAS를 포함하는 유전자 단편은 hexon5 단백질의 HVR1으로 통합 지정되었다. 제한은 AgeI 및 AccI는 N 말단과 C 말단이 HVR1 로케일 영역의 측면에 별도로 존재하고, 따라서 AgeI 및 AccI 개별적 N 말단 및 C-에 넣어되도록 선택 하였다 단편 HVR1-KWAS에 존재하지 않는 효소 합성 조각 HVR1-KWAS의 말단. hexon는 중화 항원이 hexon 12, 18, 20, 22의 모든 HVRS에있는 주요 광고 NABS의 목표 및 hexon 별이기 때문에 가능하다 일이항원 캡시드-설립 전략 전자 hexon 수정의 Ad5 벡터는 시험 관내에서의 Ad5 양성 혈청에 의해 중화을 우회 할 수있는 능력을 확보하고, 호스트 심지어의 Ad5 PEI 수 있습니다. 본 연구에서는 가의 바이러스 벡터에 모두 HVR1과 HVR5은의 Ad5 양성 혈청으로 중화의 탈출에 기여할 수있다. 다른 중요한 단계는 프로토콜의 1.2.2 절에 있었다. LB 한천에 공동 형질 전환 혼합물의 O / N 항온 처리 한 후, 성장 BJ5183 콜로니 O / N에 대한 액체 LB에서 즉시 배양 될 필요 플라스미드 즉시뿐만 BJ5183 세포로부터 추출 될 필요가있다. BJ5183 세포에서 재조합 플라스미드가 안정되지 않기 때문에 절차를 지연 시키면 가능성, 잠재적 인 재조합 및 돌연변이로 이어질 것입니다. 상동 재조합에서 올바른 플라스미드를 안정하고 정확한 게놈 종을 유지하기 위해 DH5α로 변환 될 필요가있다.
복제 후, 두 개 더 중요한 단계가 있었다.프로토콜 섹션의 첫 번째 단계는 형질 전환에 관한 것입니다. 이는 백본 플라스미드 E1 유전자를 삭제하면의 Ad5 E1 (HEK293)를 발현하는 세포 내로 재조합 광고 백본 플라스미드를 형질 감염시킬 필요가있다. 프로토콜 2.3의 다른 단계는 바이러스 업 스케일링에 관한 것입니다. 바이러스 업 스케일링의 기본 절차는 T-75 플라스크에와 T-175 플라스크에 T-25 플라스크에서 표준 바이러스 업 스케일링의 원리를 따른다. 그러나 사용 플라스크 (T-75 및 / 또는 T-175)의 수는 바이러스, 바이러스 감염에 의한 CPE 개발, 필요한 바이러스의 양의 성장 속도에 의존한다.
항원 캡시드-설립 전략은 광고 수정에 폭 넓은 응용이 가능합니다. 이 전략으로, 그것은 수정 또는 hexon 2,4,20, 펜톤 기지 (21) 섬유 (22) 등 다른 주요 캡시드 단백질에 이종 항원을 포함하는 것이 가능하다. 캡시드 작은 단백질 PIX의 C 말단은 heterol에 대한 약속을 보여 주었다ogous 항원 / 펩타이드 결합 21,23. 단일 수정 외에,이 전략과 광고에 여러 수정은 성공을 달성했다. 예를 들면 이가의 세대의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 HVR1과 hexon5의 HVR5 및 HVR1 및 HVR2 또는 HVR1 및 하나에 장 바이러스의 종류 (71)의 두 중화 항원의 결합 모두 포함 과정으로이 연구에서 HVR4, 또는 HVR1 및 hexon3 24 HVR5. 이러한 예는 유전자 치료 또는 예방 접종 접근법의 목적으로 광고의 다른 혈청 형에 hexon 수정의 가능성을 의미한다. 우리의 데이터는 hexon와 PIX (게시되지 않은 데이터)에 두 트리파노소마 (Trypanosoma) cruzi 항원 결정기의 포함 과정을 보여 주었다. 이 전략은 또한 예방 접종 또는 유전자 치료 방법 중 하나에 대한 키메라 광고 벡터를 만들기 위해 확장되었습니다. 예 hexon3 16 hexon5 전환하여 키메라 Ad5H3의 세대, 키메라 Ad3H7의 생성 hexon3 위스콘신을 전환하여제 25을 hexon7, AD4 및 섬유 (26)의 Ad5 섬유로 대체함으로써 키메라 Ad5F4의 생성.
본 연구에서는 가의의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5은 - 그의 6은 통합 항원 -의 이익에 특정 체액 성 면역 반응을 던져 선수를 보여 주었다. 우리의 현재 프로젝트 ASP2 특정 CD8 T 세포 반응이 크게 항원 캡시드 혼입 전략, 단백질 IX의 Ad5의 (PIX)로 ASP2 펩티드를 혼입시킴으로써 생성 된 벡터의 Ad5-PIX-ASP2로 면역화하여 프라이밍 것을 보여 (데이터는 보이지 않음). ASP2이, 또한 amastigote 표면 단백질 2라는 이름의, digenetic 세포 내 원생 동물 기생충 트리파노소마 (Trypanosoma)의 cruzi (T. cruzi) (27)의 면역 항원이다. 이 새로운 실험 결과는 광고 벡터화 백신에 항원 캡시드-설립 전략의 응용 프로그램이 휴대 immun 또한뿐만 아니라 체액 성 면역 반응을 유도 할 수 있지만, 우리의 지식을 확장항원 -의 이익에 특정 전자 응답.
기존의 유전자 전략에 비교적 유리하지만, 항원 캡시드-설립 전략은 세 가지 단점이있다. 첫째, 한 기존의 전략처럼 유전자의 관심의 결합을 허용 할 수 없습니다. 그것은 hexon5에 항원 캡시드-설립 전략이 최대 80 아미노산 HVR1에서 (AA), HVR5 77 AA와 HVR2이 57 AA의 삽입을 허용 것으로보고되었다. 그중 HVR1는 통합에 가장 관대 한 로켈입니다. 그러나, 작은 캡시드 단백질 PIX 1000 아미노산 (28)의 삽입을 수용 할 수있다. 둘째, 일부 항원 - 중 - 관심 성격으로 인해 광고 바이러스의 구조적 배열을 방해하는 것 같은 요금 및 아미노산의 힘과 요인, 광고 캡시드 단백질로 통합에 실패합니다. 이 경우, 해당 스페이서의 도입 일을 도울 수있다 항원 관심 - 연결된전자 성공적인 통합 4. 셋째, 일부 HVR 로케일에 포함 과정은, 예., HVR6 또는 HVR7이 가능한 바이러스 벡터 (12)의 실패 발생의 원인이됩니다. 장점과 단점을 모두 전략 주어 두 전략의 두 가지 전략에서 현명한 선택 또는 조합을 특정 조건 / 요구에 의존 할 것이다. 전략을 모두 빗질의 예는,의 Ad5 / HVR2-MPER-L15 (개그)의 생성해진다 막 인접 외부 지역 항원 캡시드-설립 전략 hexon5의 HVR2에 통합 HIV-1 gp41was의 (MPER) 과 HIV-1 개그 유전자는 기존의 유전자 전략 2의 Ad5의 E1 유전자 로케일을 대체하기 위해 삽입되었다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
건강 5T32AI7493-20과 5R01AI089337-03 부여의이 작품은 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원되었다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
| 10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
| glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
| SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
| 100x Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
| 200 mM L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
| penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
| DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
| Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
| cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
| HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
| HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
| T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
| T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
| T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
| Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
| Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
| dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
| ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
| human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
| mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
| SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
| PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
| Animal lancet (point length at 5 mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
| Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |
References
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