Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utnytte Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi for utvikling av Adenovirus Serotype 5-vectored Vaksine tilnærminger

Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52655
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å generere en proof-of-prinsippet toverdig adenovirus type 5 (Ad5) vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 ved å utnytte Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi. Denne vektor ble vist å oppvise kvalitativt kondisjon, evnen til å unnslippe Ad5-positive sera in vitro, og antigenisiteten og immunogenisiteten til de inkorporerte antigener.

Abstract

Adenovirus serotype 5 (Ad5) har blitt grundig modifisert med tradisjonelle transgene metoder for vaksineutvikling. De reduserte efficacies av disse tradisjonelt modifiserte Ad5 vektorer i kliniske studier kan være primært korrelert med Ad5 pre-eksisterende immunitet (PEI) blant majoriteten av befolkningen. Å fremme Ad5-vectored vaksineutvikling ved å løse bekymring for Ad5 PEI, har den nyskapende Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi vært ansatt. Ved fortjeneste av denne strategien, Ad5-vectored vi først konstruerte hekson shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-Hans 6 / pH5S av subkloning den hypervariable region (HVR) 1 av hekson i et tidligere konstruert shuttle plasmid HVR5-Hans 6 / pH5S, som hadde Hans 6 tag innlemmet i HVR5. Dette HVR1 DNA fragment som inneholder en HIV epitope ELDKWAS ble syntetisert. HVR1-KWAS-HVR5-Hans 6 / pH5S var da linearisert og co-transformert med linearized ryggrad plasmid pAd5 / ΔH5 (GL),for homolog rekombinasjon. Dette saman plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 ble transfektert inn i cellene til å generere virusvektoren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. Denne vektor ble validert for å ha kvalitativt trim indikert ved viral titer fysisk (VP / ml), infeksiøs titer (IP / ml) og tilsvarende VP / IP-forhold. Både HIV epitope og hans 6 tag var overflate eksponert på Ad5 capsid, og beholdt epitope spesifikke antigenevne av sine egne. En nøytralisering analyse indikerte muligheten for denne toverdig vektoren å omgå nøytralisering av Ad5-positive sera in vitro. Mus immunisering demonstrerte generasjon av robust humoral immunitet spesifikke for HIV epitope og hans seks. Dette proof-of-prinsippet studie antydet at protokollen i forbindelse med antigenet kapsid-inkorporering strategi kan være praktisk mulig anvendes for generering av Ad5-radarledet vaksiner ved å modifisere forskjellige kapsidproteiner. Denne protokollen kan til og med være further modifisert for generering av sjeldne adenovirus serotype-radarledet vaksiner.

Introduction

Menneskelige adenovirus (Ad) er en mellomstor, ikke-kappekledde virus med en icosahedral nucleocapsid inneholder en dobbelt DNA-genom. Ad tilhører adenovirus familie, med en inndeling i sju grupper (A til G). Hver gruppe inneholder virus av forskjellige serotyper. Herav, adenovirus serotype 5 (Ad5) fra gruppe C har vært den mest grundig studert og mest brukt for vectored tilnærminger som genterapi og vaksinasjoner.

Den tradisjonelle transgenet strategien har blitt utviklet og søkt om Ad5 modifikasjoner, som er preget av forskyvning av virus tidlige gener med et gen-of-interesse, og fokusert uttrykk av genet-of-interesse i en vert. Eksempler er konstruksjonen av pENV9 / Ad5hrΔE3 ved å erstatte tidlige gen 3 (E3) med rev gen av Simian Immunodeficiency Virus 1, bygging av AdCMVGag ved å erstatte en tidlig gen (E1) med gag-genet av humant immunsviktVirus (HIV) 2, og konstruksjonen av Ad-lacZ ved å erstatte E1 med lacZ-genet tre. Den brede anvendelsen av den tradisjonelle transgenet strategi på Ad5 avhenger av følgende fordeler: det brede spekter av verter for Ad5, mulighets genet ingeniør på virus og virus forplantning, den store innkvartering av utenlandske geninnskudd og sikkerhet Ad5 4,5. Imidlertid har de reduserte efficacies av Ad5-radar kliniske behandlinger ved bruk av denne strategien vært en stor flaskehals, som er kartlagt til å være primært knyttet Ad5 PEI, siden Ad5 er så utbredt blant de fleste barn og voksne 4,6.

For å overvinne den store flaskehalsen Ad5, er det primære målet å utvikle en alternativ strategi omgå Ad5 PEI. Medfødt immunitet 7, adaptiv immunitet slik som nøytraliserende antistoffer (Nabs) 8-10 og CD8 + T-celleresponser mot Ad5 10 har vist seg å contribute å Ad5 PEI, med Ad5 Nabs vises til å spille den dominerende rolle i bidragene til Ad5 PEI 10,11. Videre Nabs Ad5 target epitoper lokalisert i kapsidproteiner, herunder hovedprotein hekson, fiber og Penton basen. Herav er hekson den store målet for Ad5 Nabs 8,11-13. Basert på disse funnene, har en innovativ Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi er innført. Denne romanen strategi streker erstatning eller inkorporering av proteiner-of-interesse på Ad5 kapsidproteiner, som skifter eller masker Ad5 nøytraliserende epitoper, som fører til redusert anerkjennelse av Nabs og effektive Ad5 vektor administrasjoner. Det er bemerkelsesverdig at denne strategien er konkurransedyktig fordi det kan også hjelpe vertene framprovosere robust humoral immunitet og potent cellulær immunitet ved direkte å presentere antigener-of-interesse for immunforsvaret 4,14,15. Basert på denne strategien, kan molekylær kloning og rekombinant Ad virusvektoren rednings være strukturelt deltinn i fire hovedtrinn: (a) fremstilling av gen-fragmentet av interesse ved enten polymerase kjedereaksjon (PCR) eller syntese; (B) ligering av gen-fragment inn i en shuttle plasmid som inneholder genet interesse fragment og homologe armer til et adenovirus ryggraden; (C) den homologe rekombinasjon ved ko-transformere en shuttle-plasmidet som inneholder genet interesse fragment med det lineariserte plasmid ryggrad pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) transfeksjon av lineariseres rekombinant adenovirus plasmid å redde rekombinant Ad vektor innarbeidet med antigener-of-interesse.

Vår gruppe og noen andre har utvidet dette alternativet Ad innlemmelse strategi for Ad vectored vaksineutvikling mot ulike smittsomme patogener. Vi rapportert dannelse av en rekombinant vektor Ad Ad-HVR1-LGS-His 6 -V3 ved inkorporering av en His-merket HIV-1 antigen V3 inn i HVR1 nasjonale av Ad5 hekson (hexon5). Dette genererte vektor utløst strong humoral immunrespons spesifikk for epitopen 4 V3. Vi har også rapportert utvikling av Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 ved å inkludere HIV-1 membran proksimale ectodomain region (MPER) i HVR2 locale av hexon5 to. I tillegg har Dr. Zhou gruppe brukt fordelene med denne annonsen innlemmelse strategi for å utvikle Ad serotype 3 (AD3) radar vaksiner, altså., Generering av viral vektor R1SP70A3 ved å innlemme en nøytraliserende epitop SP70 av Enterovirus 71 inn i HVR1 av AD3 hekson (hexon3). R1SP70A3 generert sterke Nabs og IFN-γ produksjonen spesifikke for epitope SP70, noe som fører til høy grad av beskyttelse mot Enterovirus 71 utfordring 15.

For hensikten med teknisk referanse, vår studie tok fordel av den kvalitative Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi om å fokusere på generering av en toverdig Ad5 vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 ved å inkludere en HIV-1 antigen i HVR1 enda Hans tag inn HVR5 av hexon5. Den genererte viral vektor ble også immunologisk evaluert. Den Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi kan brukes til utvikling av Ad5-radarvaksinasjons tilnærminger mot ulike smittsomme sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

The University of Alabama i Birmingham Institutional Animal bruk og vedlikehold Komiteen godkjente bruken av mus som beskrevet her under godkjent protokoll nummer 101.109.272.

1. Genetisk Bygging av en modifisert Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 med Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi

  1. Byggingen av shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-Hans 6 / pH5S
    1. Bestill et plasmid som inneholder det syntetiserte DNA sekvensen HVR1-KWAS mellom restriksjonsenzymseter AgeI å AccI av hexon5 genet.
    2. Fordøye 6 pg av det syntetiske fragment (HVR1-KWAS) med enzymene AgeI (6 enheter) og AccI (6 enheter) i 3 timer ved 37 ° C. Løse spaltet fragment i en 2% agarosegel ved elektroforese, og rense et DNA-fragment med gel ekstraksjonssett i henhold til produsentens protokoll.
    3. På bakgrunn av det molare forholdet mellom innsatsen til vektor på 3: 1, bruke T4 DNA-ligase og ligase bUffer for å ligere 12 ng av fragmentet (HVR1-KWAS) til 100 ng av et tidligere konstruert shuttle plasmid HVR5-His 6 / pH5S 17 i et 10 ul volum ved romtemperatur i 2 timer, via områder av AgeI og AccI.
    4. Transformere en ul av 10 ul av ligerings produktet i 50 mL av elektrokompetente DH5a-celler i en electroporator (ved 1800 V). Legg 950 mL av SOC medium til de transform DH5a cellene og inkuberes blandingen i 1 time ved 37 ° C med 300 rpm. Spre 100-200 ul av 1 ml blanding på Luria-Bertani (LB) agar som inneholder kanamycin og inkuberes O / N ved 37 ° C.
      1. Å skjerme ~ 10 kolonier av PCR rettet fragmentet HVR1-KWAS, bland fremover primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT), omvendt primer (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) og et enkelt DH5a koloni i en PCR mester mix-løsning (i henhold til produsentens protokoll). Kjør prøver på en termo ved å henvise til manualen som følger med PCR mester mix løsning.
      2. Bruk forward primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) å sekvensere fragment HVR1-KWAS i kloner vist i avsnittet 1.1.4.1.
  2. Byggingen av plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6
    1. Digest 6 ug HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S med enzymene EcoRI (6 enheter) og PmeI (6 enheter) i 3 timer ved 37 ° C, og rense fragmentet inneholdende homolog rekombinasjon armer og to modifiserte hexon5 genet, som nevnt i punkt 1.1.2. Linear ryggrad plasmid pAd5 / ΔH5 (GL) 16 med Swai.
    2. Co-trans 100 ng av mål-fragment fra plasmid shuttle og 100 ng av det lineariserte pAd5 / ΔH5 (GL) ryggrad i 50 pl av elektrokompetente celler BJ5183 for homolog rekombinasjon i en electroporator (ved 1800 V). Legg 950 mL av SOC medium til de transformerte cellene og inkuberes blandingen i 1 time ved 37 ° C, 300 rpm. Spre 100-200 mL av 1 ml blandingpå LB-agar inneholdende kanamycin (slutt 50 ug / ml) i O / N inkubering ved 37 ° C.
      1. Pick ~ 10 små kolonier i 3 ml flytende LB inneholdende kanamycin (slutt 50 ug / ml) i O / N inkubasjon ved en rister (250 rpm, 37 ° C). Pakk plasmider fra kulturen. Bruke PCR-analyser for å screene de 10 kolonier ved å målrette den fragmentet HVR1-KWAS, som vist i trinn 1.1.4.1.
      2. Å skjerme de samme kolonier av PCR-analyse rettet mot pix fragment av ryggraden genomet, bland fremover primer (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), omvendt primer (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) og et enkelt BJ5183 koloni i en PCR mester mix-løsning (i henhold til produsentens protokoll). Kjør prøver på en termo ved å henvise til manualen som følger med PCR mester mix løsning.
      3. Utpeke PCR dobbel-positive kolonier som pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6.
    3. Transform 100 ng av plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 ii DH5a-celler som vist i trinn 1.1.4.
      1. Bruke PCR-analyser for å screene ~ 10 kolonier ved å målrette den fragmentet HVR1-KWAS, som vist i trinn 1.1.4.1.
      2. Bruke PCR-analyser for å screene de samme koloniene ved å målrette PIX fragment av genomet ryggraden, som vist i trinn 1.2.2.2.
      3. Bruk forward primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) å sekvensere fragment HVR1-KWAS i pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6.

2. Utarbeidelse av Modifisert Ad5 Viral Vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6

  1. Utgjør den komplette mediet ved tilsetning av FBS (endelig 10%), 100X ikke-essensielle aminosyrer (0,1 mM endelig), 200 mM L-glutamin (2 mM endelig) og penicillin / streptomycin-løsning (1% endelig) i DMEM med høyt glukose . Opprettholde humane embryonale nyre (HEK293 celler) i komplett medium i en kultur inkubator (37 ° C og 5% CO2 i henhold til 85% fuktede betingelser).
  2. Redning av viral vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6
    1. Seed 3,0 x 10 6 i HEK293-celler i en T-25-kolbe inneholdende 5 ml komplett medium og kulturen O / N for å oppnå et monosjikt med 80% konfluens.
    2. Linear 15 ug pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 i et 100 ul volum med restriksjonsenzym paci (15 enheter) ved 37 ° C i 3 timer.
      1. Ekstraher linearisert pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 ved sentrifugering av reaksjons to ganger (10.000 xg i 1 min) med et likt volum av fenol: kloroform: isoamylalkohol (forhold på 25: 24: 1) i en avtrekkshette og ved sekvensiell sentrifugering (10 000 xg i 10 min) med en blandet løsning (300 pl 100% etanol og 10 pl natriumacetat) og 700 ul 70% etanol. Kast supernatant ved hver sentrifugeringstrinn.
    3. Resuspender rensede plasmid i ~ 40 mL destillert vann eller Tris-EDTA (TE) buffer. Kvantifisere plasmid-DNA ved å måle den optiske density (OD) ved 260 nm.
    4. Transfisere 3 mikrogram av det lineariserte plasmid med kommersiell liposomal- transfeksjon reagens i T-25 kolbe, i henhold til produsentens manual. Endre transfeksjon medium med komplett medium ved 6 timer etter transfeksjon og påfølgende inkubering i kulturen inkubator. Oppretthold transfekterte celler ved å erstatte komplett medium hver to til tre dager, inntil den individuelle virus plakk skjemaet.
    5. Når plakk utvikler full cytopatisk effekt (CPE), skrape de gjenværende cellene utenfor kolben i en steril hette, og høsting ved sentrifugering Cellelysatet medium ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Suspen cellepelleten i ~ 1 ml medium inneholdende 2% FBS, og bryte cellene ved fryse-tining fire ganger. Samle supernatanten inneholdende reddet virus etter sentrifugering ved 10.000 xg lysat i 10 min ved 4 ° C.
  3. Storskala utbredelse av virusvektoren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6
    1. Forplante the virus i en T-75-kolbe inneholdende HEK293 celler i steril hette ved infisering med 1/3 til full lysat fra T-25-kolbe. Tillate full CPE å utvikle i løpet av to til tre dager i kulturinkubatoren. Høste lysatet supernatanten som nevnt i punkt 2.2.5.
    2. Forplante viruset i 1-3 T-175 kolber i steril hette ved infisering med 1/2 til full lysat fra T-75 kolbe, avhengig av viruset forplantningsforhold. Tillate full CPE å utvikle i løpet av to til tre dager i kulturinkubatoren. Høste lysatet supernatanten som nevnt i punkt 2.2.5.
    3. Forplante viruset i ett dusin eller flere T-175 kolber i steril hette ved infisering med 1/2 til full lysat fra det foregående T-kolbe 175 (s). Bestemme mengden av kolben bruk basert på virusforplantningsforhold og mengden av virus i nød. Høste lysatet supernatanten som nevnt i punkt 2.2.5 når full CPE oppstår i løpet av to til tre dager i kulturinkubatoren.
  4. Purification av Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 av cesiumklorid
    1. Forbered to tettheter av CsCI-oppløsninger i 5 mM HEPES: 1,33 g / ml og 1,45 g / ml, og samtidig unngå kontakt med CsCl.
    2. Belastnings 4 ml CsCl (1,33 g / ml) i et sterilt ultrasentrifugerør, og forsiktig laste 4 ml CsCl (1,45 g / ml) mot bunnen av røret. Last 4 ml lysat supernatant langsomt på toppen av gradienter i den sterile hetten.
    3. Sentrifuger røret ved 110 000 x g i 3 timer ved 4 ° C for å separere den modne / nedre virus båndet fra den defekte / høyere virus band. Samle den nedre bandet med en 3 ml sprøyte bevæpnet med en 33 G nål og fortynne band med 5 mM HEPES til en 4 ml volum i sterile panseret.
    4. Legge i et annet rør med to tettheter av CsCI-løsninger og den fortynnede bånd av virus som beskrevet i trinn 2.4.2. Sentrifuger røret på 110 000 xg O / N ved 4 ° C. Samle viral bandet som beskrevet i trinn 2.4.3.
    5. Injisere samlet virus løsning i en dialyser kassett av en 3 ml sprøyte bevæpnet med en 33 G nål i sterile panseret.
    6. Legg kassetten i 700 ml 1x dialysebuffer (1 L oppskrift: 100 ml 10 x PBS, 100 ml 100% glyserol og 800 ml destillert vann, filtrering av bufferen gjennom et 0,22 mikrometer filter) og erstatte dialysebuffer hver tre timer for 4 ganger. Aspirer ut dialyserte virus løsning ved hjelp needled sprøyten.

3. Validering av Reddet Viral Vector

  1. Viral Vector Titreringene
    1. For viruset fysiske titer, fortynne både virus og dialysebuffer (bakgrunnskontroll) ved 1: 10 og 1: 20 i virus lyseringsbuffer (10% SDS i Tris-EDTA) i små rør, og inkuber alle rør ved 56 ° C i 10 min.
    2. Slå på en biophotometer og angi modus for absorbans ved OD 260 nm. Bruk utvannet dialyse buffer (1: 10) for å balansere bakgrunnssignalet ved å klikke på "blank" nederst. Type "10 + 90" i biophotometer screen, og lese signalet fra fortynnet virus (1: 10).
    3. Les signalet fra fortynnet virus (1: 20) ved å følge fremgangsmåten i trinn 3.1.2, men isteden skrive "5 + 95" i biophotometer skjermen. Multipliser de to virus avlesnings tall ved 1.1x10 12 og beregne gjennomsnittlig titer med en enhet som VP / ml, basert på de to individuelle titerene fra de to fortynninger.
    4. For viruset smittsom titer (IP / ml), bruker Karber statistisk TCID 50 metoden 14 for å fastslå infeksjon dybde på HEK293 celler på 10 dager etter infeksjon (dpi)
  2. Evaluering av antigen eksponeringsvisningen på virusvektoren
    1. Coat den virale vektor i en ELISA-plate og fortsette med resten av trinnene i et standard ELISA-metode 14. Bruk humant anti-gp41 (2F5) monoklonalt antistoff (mAb) og muse anti-His tag mAb for påvisning av tilsvarende inkorporerte antigener 14.
    2. Løse virusvektoren i en denatured protein gelelektroforese (SDS-PAGE) og fortsett med resten av trinnene i en standard western-blot metode 14. Bruk humant anti-gp41 (2F5) monoklonalt antistoff (mAb) og muse anti-His tag mAb for påvisning av tilsvarende inkorporerte antigener 14.
  3. In vitro-evalueringen av vektoren på evnen til å omgå Ad5-positve sera
    1. Oppretthold HeLa-celler i fullstendig medium i kulturen inkubator (37 ° C og 5% CO 2 under 85% fuktede betingelser). Utgjør den komplette mediet ved tilsetning av FBS (endelig 10%), 200 mM L-glutamin (2 mM endelig) og penicillin / streptomycin-løsning (1% endelig) i Minimum Essential Medium Eagle (MEME).
    2. Seed HeLa-celler i 6-brønners plater på 1x10 6 celler / brønn, og platene inkuberes i kultur inkubator (37 ° C og 5% CO 2 under 85% fuktede betingelser) i 2 timer. Inkuber Ad5-positive sera (0,1 pl eller 0 mL) med fem IP / celle av viral vektor (Ad5 eller Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6) i kultur inkubator i 1 time før tilsetning av blandingene bort på 6-brønners plater inneholdende celler.
    3. Ved 24 timer etter infeksjon (HPI), skylles cellene en gang med PBS og Lyse-celler i 0,5 ml lysisbuffer. Sentrifuger ved 15.000 xg i 5 minutter og samle supernatanten. Bland 20 ul av supernatanten med 100 ul av luciferase substrat for luciferase signal lesing, ettersom virus inneholder luciferasegenet.

4. Immunologiske Evaluering av Reddet Viral Vector

  1. Forbered to vaksinasjons grupper: Ad5 og Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6.
    1. Injisere mus (n = 8 / gruppe) intramuskulært med virus på 1x10 10 VP / mus, i en homolog "prime-boost" immunisering regime, med et intervall på to uker.
    2. På to uker etter hver injeksjon, blø mus uten bedøvelse av kinnet blødning med dyre lansetter (5 mm tips lengde) tilsamle blod i 1,5 ml rør.
  2. Bland blodet i rørene ved å snu opp og ned, og inkuber blodet ved RT i 30 min. Spinne rørene ved 10.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C og sera overføring (øverste lag) til nye 1,5 ml rør.
    1. Spinn nye rørene ved 10.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C og sera overføring til nylig merkede 1,5 ml rør for lagring ved -80 ° C.
  3. Evaluering av antigen-spesifikk humoral immunitet ved sera-baserte ELISA
    1. Fortynne Hans peptid (lager ved 1 mm) og HIV-1 peptid (lager ved 1 mm) separat i 100.
    2. mM karbonatbuffer (pH 9,5) for å oppnå peptidet belegget konsentrasjon på 10 uM. Belegge ELISA-platene med de fortynnede peptider separat ved tilsetning av 100 ul per brønn og inkubere platene O / N ved 4 ° C.
    3. Vask platene med PBST for fire ganger med 200 ul / brønn og blokk i 1 time i 5% BSA i PBST. Anvende musesera til platene ved 1: 100 fortynning i blokkerings buffer, 100 ul / brønn. Inkuber i 2 timer inkubasjon ved RT.
    4. Vask platene med PBST til fire ganger. Blokker platene ved inkubasjon ved romtemperatur i 30 minutter i blokkeringsbuffer ved 100 ul / brønn.
    5. Anvende geite anti-muse-IgG-HRP (1: 5000 i blokkerende buffer) ved 100 pl / brønn for begge plater belagt med sin peptid og HIV-1-peptid individuelt. Inkuber i 2 timer ved RT. Vask platene med PBST.
    6. Les platene ved OD450 nm etter inkubasjon med HRP-substrat i 30 minutter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Antigen kapsid-inkorporering strategi (figur 1A) ble benyttet for å generere det toverdige Ad5 virusvektoren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. For det første shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S ble konstruert ved subkloning HVR1-KWAS fragment i forrige konstruert shuttle plasmid HVR5-His 6 / pH5S 17. Dernest plasmidet pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 14 ble bygget av en homolog rekombinasjon mellom fragment av "EcoRI-HVR1-KWAS-HVR5-His6-PmeI" og Swai-linearisert pAd5 / ΔH5 (GL ) 16 (figur 1B). Transfeksjon av Paci fordøyd pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 i en T-25 kolbe føre til redning av virusvektoren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 14. Den reddet viral vektor ble så dyrket i stor skala og renset ved to sykluser av CsCl-gradient-ultrasentrifuge.

For ådemonstrere levedyktighet / fitness av reddet virusvektoren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6, den fysiske titer ble bestemt til 1,3 x 10 11 VP / ml ved å måle de fysiske kopier av viral genom, og den smittsomme titer var bestemt til 1,4 x 10 9 IP / ml ved titrering av den faktiske infeksiøse viruspartikler. VP / IP-forholdet ble senere beregnet til 92 14. Normalt en annonse med en VP / IP-forhold under 1000 indikerer en kvalitativ trenings av dette viruset. For å demonstrere hvorvidt denne reddet viruset viser antigene HIV-antigen og Hans tag henholdsvis på overflaten av det virale kapsid hovedproteinet hexon5, ble ELISA gjennomført med humant mAb 2F5 og mus anti-His tag mAb, respektivt. Resultatene indikerte at begge humant mAb 2F5 (figur 2A) 14 og mus anti-His tag mAb (figur 2B) 14 viste binding til Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6, mens det ikke var noen binding til den negative control vektor Ad5. Western-blot-analyse ble benyttet for å bekrefte dataene i ELISA, som både humant mAb 2F5 (figur 2C) 14 og mus anti-His tag mAb (figur 2D) 14 detekteres spesifikke bånd rundt 117 kDa bare i viruset Ad5 / H5- HVR1-KWAS-HVR5-His 6, som svarer til størrelsen av hexon5 protein. For å vurdere potensialet i Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 i omgå nøytralisering av Ad5-positive sera, nøytralisasjonsanalyse Analysen ble utført som angitt i protokollen kapittel 3.3. Resultatene viste at den relative luminescerende enheten (RLU) signal fra den virale vektoren Ad5 behandlet med 0 ul av Ad5-positve sera er 12 ganger høyere enn fra den samme vektoren behandlet med 0,1 mL av Ad5-positve sera (p-verdi <0,001 ). Dette antydet at nøytraliseringen av vektoren Ad5 av Ad5-positvive sera. I motsetning til dette, var det liten forskjell fra den virale vektoren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6behandlet med 0 mL og 0,1 mL av Ad5-positve sera (figur 3). Siden hekson er den viktigste målet for Ad Nabs, og hekson spesifikke nøytraliserende epitoper ligge i alle HVRs av hekson 12,18, dataene ovenfor vist at Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 rømt nøytralisering av Ad5-positve sera in vitro og antydet muligheten av Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 på omgå Ad5 PEI i verten.

For å undersøke om det endrede toverdig Ad5 viral vektor med Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi kan framprovosere robust humoral immunitet spesifikke for de inkorporerte antigener-of-interesse, ble den "prime-boost" immunisering diett brukes til å immunisere mus med kontroll viral vektor Ad5 og toverdig vektor Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. Sera-baserte ELISA belagt med HIV-1-peptid viste at sera fra immunisering gruppe av Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 hadde significant binding til HIV-1-peptid ved fortynninger på mellom 40 og 640, sammenlignet med sera fra kontrollgruppen (p-verdi <0,001) (figur 4A) 14. Sera-baserte ELISA belagt med sin peptid viste at sera fra immunisering gruppen av Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 hadde signifikant binding til sin peptidet sammenlignet med sera fra kontrollgruppen, som statistisk p-verdi < 0.001 på sera fortynninger av 40 og 80, p-verdi <0,01 ved fortynning av 160 og p-verdi <0,05 på en 320 fortynning (4B) 14. De ovennevnte resultater indikerte dannelse av humoral immunrespons mot de inkorporerte antigener på det toverdige virusvektor.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk illustrasjon av den genetiske konstruksjonen av plasmidet pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 med antigenet kapsid-innlemmelse strategi. (A) Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi er preget av direkte vise antigen-of-interesse på kapsidproteiner (hekson, penta base, PIX og / eller fiber) av adenovirus. Dette tallet ble tilpasset fra Nemerow et al., 2009. Virology 384 (2009) 380-388, copyright Elsevier. (B) Gene fragment (HVR1-KWAS) ble syntetisert og klonet inn i en pUC vektor av et selskap. Dette fragmentet ble subklonet i det tidligere bygget shuttle plasmid HVR5-Hans 6 / pH5S av restriksjonsenzymene AgeI og AccI å generere HVR1-KWAS-HVR5-Hans 6 / pH5S. Det resulterende plasmid shuttle ble spaltet med enzymene EcoRI og PmeI, og ko-transformert med Swai-linearisert plasmid ryggrad pAd5 / ΔH5 (GL) for den homologe rekombinasjon, noe som resulterer i genereringen av den rekombinerte ryggrad plasmidet pAd5 / H5-HVR1-KWAS -HVR5-Hans seks. I denne figur betegner R1 HVR1 og R5 betegner HVR5, og GL betegner grønn fluorescens protein (GFP) og luciferase, separat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Evaluering av antigene eksponering av inkorporerte antigener på kapsid overflaten av det toverdige virusvektoren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. Antall viral vektor ELISA ble utført for å bestemme om de inkorporerte antigener ble eksponert på vektoren overflaten samtidig opprettholde antigene egenskapene til sine egne. ELISA-plater ble belagt med det divalente vektor, og inkubert med humant mAb 2F5 (A) og muse anti-His-mAb (B). Dataene indikerte at særlig binding av antistoffene til det divalente vektoren, men ikke til styrevektor Ad5. R1-KWAS-R5-His 6 betegner Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. Western-blot analyse ble utført for å bekrefte den antigene bindingen av humant mAb 2F5 (C) eller muse-anti-His-mAb (D) til de inkorporerte antigener på det toverdige vektoren. I begge (C) og (D), lane 1 indikerer Ad5, og spor 2 indikerer Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Evaluering av det toverdige virusvektoren evne til å unnslippe nøytralisering av Ad5-positve sera in vitro. Nøytralisering Analysen ble utført for å bestemme om det toverdige vektoren kunne unnslippe nøytralisering. Resultatene viste nøytralisering av Ad5 virus av sera, men eskappe av nøytraliseringen av det divalente virus in vitro. I dette tallet, R1-KWAS-R5-His 6 betegner Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. Stjernene *** betegner p-verdi <0,001.

Figur 4
Figur 4. In vivo generering av humoral immunitet ved den toverdige viral vektor i mus modellen. Sera-baserte ELISA ble anvendt for å evaluere humoral immunitet mot de inkorporerte proteinene på det toverdige vektoren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 . HIV-1-peptid (A) og His-peptid (B) ble belagt på ELISA-platene hver for seg, etterfulgt av inkubasjon med musesera fra de to immuniseringsgrupper (Ad5 og Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6) . Dataene indikerte betydelig generering av humorale immunresponser mot HIV-1 antigen i HVR1 (A) og Hans tag i HVR5 (B). Hvert datapunkt representerer midler og SD fra åtte gjentak. Stjernene *** betegner p-verdi <0,001, ** betegner p-verdi <0,01, og * betegner den p-verdi <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anvendelsen av den tradisjonelle transgenet strategien på Ad5 modifikasjon for utvikling av vaksiner er blitt redusert hovedsakelig på grunn av flaskehalsen forbundet med den Ad5 PEI 4,6. Denne flaskehalsen kan delvis redusert ved bruk av alternative Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi (figur 1A), siden denne strategien kan unndra nøytralisering av Ad5 Nabs ved å erstatte nøytraliserende epitoper av Ad5 med antigener-of-interesse, og legge til rette for generering av robust immunitet til de inkorporerte antigener-of-interesse. I denne studien, generering av den modifiserte toverdig virusvektoren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 ble innført som en konseptuell eksempel (figur 1B). Tilsvarer protokollen seksjon 1.1.1, inneholder den syntetiserte fragment i beordret plasmidet en HIV-1 gp41 kort genet substitusjon i HVR1 locale av hexon5. Den delvise gp41-genet koder for en epitop ELDKWAS, som erstatterpartiell HVR1 fra aminosyrene 139-144 av hexon5 14. ELDKWAS er en potent nøytraliserende epitop i HIV-1 gp41 19.

I løpet av kloning, var det to kritiske trinn. Ett skritt var valget av to restriksjonsenzymer når syntetisere genfragmentet interesse i protokollen seksjon 1.1.1. Valget av de to enzymene betinget avhenger av plasseringen av Ad kapsid som skal modifiseres, det vil si., I denne studien, ble fragmentet inneholdende genet KWAS utpekt til å innlemme i HVR1 av hexon5 protein. Restriksjonsenzymene AgeI og AccI eksisterer separat på-N-terminal og C-terminal flankerer områder av HVR1 locale, og finnes ikke i fragment HVR1-KWAS, og dermed AgeI og AccI ble valgt til å være individuelt satt i N-terminalen og C- stasjon for den syntetiserte fragment HVR1-KWAS. Siden hekson er den viktigste målet for Ad Nabs, og hekson spesifikke nøytraliserende epitoper ligge i alle HVRs av hekson 12,18, er det mulig at the hekson modifisert Ad5 vektorer med Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi kunne få muligheten til å omgå nøytralisering av Ad5-positive sera in vitro, og selv Ad5 PEI i vert. I denne studien, kan både HVR1 og HVR5 på det toverdige virusvektoren bidra til frigjøring av nøytralisering av Ad5-positive sera. Den andre kritiske trinnet var i protokollen seksjon 1.2.2. Etter at O ​​/ N inkubering av ko-transformerte blandingen på LB agar, de voksne kolonier BJ5183 må være umiddelbart dyrket i flytende LB for O / N, og plasmider må straks ekstrahert fra cellene BJ5183 også. Forsinke prosedyrer vil sannsynligvis føre til potensielle rekombinasjon og mutasjoner, siden det rekombinerte plasmidet i BJ5183 cellene ikke er stabil. Det riktige plasmid fra homolog rekombinasjon behov for å bli forvandlet til DH5a for å opprettholde en stabil og korrekt genom arter.

Etter kloning, var det to mer kritiske trinn. DenFørste trinn i protokollen delen handler om transfeksjon. Det er nødvendig å transfektere det rekombinerte plasmid Ad ryggraden inn i celler som uttrykker Ad5 E1 (HEK293), hvis ryggraden plasmidet er E1-genet slettet. Det andre trinnet i protokollen punkt 2.3 handler om virus oppskalering. Den grunnleggende prosedyren for virus oppskalering følger prinsippet om standard virus oppskalering fra en T-25 kolbe til T-75 kolber og til T-175 kolber. Imidlertid er antallet av kolbene (T-75 og / eller T-175) som kan brukes, avhenger av veksthastigheten av viruset, CPE utviklingen forårsaket av virusinfeksjon, og mengden virus som trengs.

Den Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi åpner for bred anvendelse på Ad modifikasjoner. Med denne strategien, er det mulig å endre eller innlemme heterologe antigener på ulike kapsidbindende store proteiner, slik som hekson 2,4,20, Penton basen 21 og fiber 22. Kapsidet mindre protein Pix C ende viste også lovende for heterologous antigen / peptid innlemmelse 21,23. Foruten den eneste modifikasjon, flere modifikasjoner på Ad med denne strategien også oppnådd suksess. Eksempler er generering av toverdig Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 i denne studien ved incorporations i både HVR1 og HVR5 av hexon5, og inkorporering av to nøytraliserende epitoper av enterovirus typen 71 til enten HVR1 og HVR2 eller HVR1 og HVR4, eller HVR1 og HVR5 av hexon3 24. Disse eksemplene antyder muligheten for hekson modifikasjoner i andre serotyper av reklame, i den hensikt å enten genterapi eller vaksinering tilnærming. Våre data viste også de incorporations av to Trypanosoma cruzi epitoper inn hekson og Pix (upublisert data). Denne strategien har også blitt utvidet til å gjøre kimære annonse vektorer for enten vaksinasjon eller genterapi tilnærminger. Eksempler er generering av kimære Ad5H3 ved å bytte hexon5 med hexon3 16, generering av kimære Ad3H7 ved å bytte hexon3 with hexon7 25, og generering av chimeriske Ad5F4 ved å erstatte Ad5 fiber med fiber 26 AD4.

I denne studien, det toverdige Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 demonstrerte få fram av humorale immunresponser som er spesifikke for de inkorporerte antigener-of-interesse. Vår nåværende prosjektet viser at ASP2 spesifikke CD8 T-celle respons betydelig primet ved immunisering med en vektor Ad5-Pix-ASP2, som ble generert ved å innlemme ASP2 peptid til protein IX (pix) av Ad5, med Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi (data ikke vist). ASP2, også kalt amastigote overflateprotein 2, er en immunodominant antigen av digenetic intracellulære protozoan parasitt Trypanosoma cruzi (T. cruzi) 27. Denne nye eksperimentelle funn utvider vår kunnskap om at anvendelsen av Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi på Ad vectored vaksiner kan lokke fram ikke bare humorale immunresponser, men også den cellulære immune responser spesifikke for antigener-of-interesse.

Selv om relativt fordelaktig til den tradisjonelle transgenet strategi har Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi også tre ulemper. For det første kan det ikke tillate inkorporering av gen-av interesse så lenge tradisjonell strategi gjør. Det har blitt rapportert at Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi på hexon5 tillater innsetting av maksimalt 80 aminosyrer (AA) i HVR1, 77 aa i HVR5 og 57 aa i HVR2 to. Herav er HVR1 den mest ettergivende locale for innlemmelse. Imidlertid kan mindre kapsidprotein Pix romme et innskudd av 1 000 aminosyrer 28. For det andre, noen antigener Interesse i naturen mislykkes i å innlemme i annonse kapsidproteiner, på grunn av faktorer som kostnader og kreftene av aminosyrer, som synes å forstyrre den konstruksjonsmessige arrangement av Ad virus. I dette tilfellet, innføring av egnede avstandsstykker knyttet til antigener interesse kan bidra the vellykket innlemmelse 4. Tredje, incorporations i enkelte HVR steder, altså., HVR6 eller HVR7 kan føre til mislykket generasjon av levedyktige virale vektorer 12. Gitt de fordeler og ulemper ved begge strategiene, vil et klokt valg fra de to strategiene eller en kombinasjon av begge strategiene er avhengig av de spesifikke vilkår / behov. Et eksempel på gre begge strategier er genereringen av Ad5 / HVR2-MPER-L15 (gag), hvorved den membran-proksimale ytre region (MPER) av HIV-1 gp41was innlemmet i HVR2 av hexon5 med antigenet kapsid-inkorporering strategi og HIV-1 gag-genet ble satt inn for å erstatte den E1 genet nasjonale av Ad5 med den tradisjonelle transgenet Strategi 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health gir 5T32AI7493-20 og 5R01AI089337-03. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Scientific SH30256.01 for cell spliting 
10x DPBS Thermo Scientific SH30378.02 for dialysis buffer preparation
glycerol SIGMA G5516-1L for dialysis buffer preparation
SDS BIO-RAD 161-0301 for virus lysis buffer preparation
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific SH30910.03 component of culture medium
100x Non-Essential Amino Acids  Thermo Scientific SH30238.01 component of culture medium
200 mM L-glutamine Cellgro 25-005-CI component of culture medium
penicillin/streptomycin solution  Cellgro 30-002-CI component of culture medium
DMEM with high glucose Thermo Scientific SH30081.01 for HEK293 cell culture
Minimum Essential Medium Eagle SIGMA M5650 for HeLa cell culture
phenol:chloroform:isoamyl alcohol  SIGMA P3803-100ML for large size of DNA purification
cesium chloride  Research Products International Corp. C68050 for virus purificiation
HEPES Cellgro 25-060-CI for CsCl solution preparation
HEK293 ATCC 51-0036 for virus rescue and upscale
HeLa ATCC CCL-2 for neutralization assay
T-25 flask Thermo Scientific 156367 for cell culture 
T-75 flask CORNING 430641 for cell culture 
T-175 flask Thermo Scientific 159910 for cell culture 
Ultracentrifuge BECKMAN NA for virus purification
Ultracentrifuge tube BECKMAN 344059 for virus purification
dialysis cassette  Thermo Scientific 66380 for virus dialysis
ELISA plate Thermo Scientific 442404 for ELISA
human anti-gp41 (2F5) mAb NIH AIDS Reagent Program 1475 for immunological assays
mouse anti-His tag mAb GenScript A00186 for immunological assays
SOC medium CORNING 46-003-CR for transformation
PCR master mix solution QIAGEN 201445 for PCR
Animal lancet (point length at 5 mm) MEDIpoint for mice bleeding 
Biophotometer Eppendorf for virus physical titer titration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
  2. Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815 (2010).
  3. DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
  4. Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112 (2014).
  5. Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
  6. Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
  7. Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571 (2013).
  8. Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
  9. Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
  10. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
  11. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
  12. Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
  13. Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
  14. Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347 (2013).
  15. Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381 (2012).
  16. Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
  17. Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
  18. Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
  19. Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
  20. Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).
  21. Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
  22. Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
  23. Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
  24. Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
  25. Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
  26. Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533 (2013).
  27. Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).
  28. Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).

Tags

Immunologi Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi transgen metode Adenovirus (Ad) vaksine kapsidproteiner dual modifikasjon pre-eksisterende immunitet (PEI)
Utnytte Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi for utvikling av Adenovirus Serotype 5-vectored Vaksine tilnærminger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gu, L., Farrow, A. L.,… More

Gu, L., Farrow, A. L., Krendelchtchikov, A., Matthews, Q. L. Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches. J. Vis. Exp. (99), e52655, doi:10.3791/52655 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter