Summary
Hier presenteren we een protocol om een proof-of-principle bivalente adenovirus type 5 (Ad5) vector genereren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door gebruik te maken van de Antigen Capsid-Incorporation strategie. Deze vector werd aangetoond kwalitatieve conditie vertonen het vermogen om Ad5-positieve sera in vitro, en de antigeniteit en immunogeniteit ontsnappen naar de opgenomen antigenen.
Abstract
Adenovirus serotype 5 (Ad5) is uitgebreid gemodificeerd transgen met traditionele methoden voor vaccinontwikkeling. De verminderde efficacies deze traditioneel gemodificeerde Ad5 vectoren in klinische trials kon hoofdzakelijk worden gecorreleerd met reeds bestaande immuniteit Ad5 (PEI) onder de meerderheid van de bevolking. To-Ad5 vectored vaccin ontwikkeling te bevorderen door het oplossen van de bezorgdheid van Ad5 PEI, heeft het innovatieve Antigeen Capsid-Incorporation strategie toegepast. Door verdienste van deze strategie, Ad5-vectored we eerst gebouwd de hexon shuttle plasmide HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S door subkloneren het hypervariabele gebied (HVR) 1 van hexon in een eerder opgebouwd shuttle plasmide HVR5-His 6 / pH5S, die moest Zijn 6-tag opgenomen in het HVR5. Deze HVR1 DNA-fragment dat een HIV epitoop ELDKWAS gesynthetiseerd. HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S was toen lineair en co-getransformeerd met gelineariseerde backbone plasmide pAd5 / ΔH5 (GL),homologe recombinatie. Deze gerecombineerde plasmide pAd5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-His werd getransfecteerd in cellen om de virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 genereren. Deze vector werd gevalideerd kwalitatieve conditie wordt aangegeven door virale titer fysische (VP / ml), infectieuze titer (IP / ml) en bijbehorende VP / IP ratio. Zowel de HIV-epitoop en Zijn 6-tag waren oppervlak blootgestelde op de Ad5 capside, en behield epitoopspecifieke antigeniciteit van hun eigen land. Een neutralisatietest vermeld het vermogen van deze divalente vector neutralisatie omzeilen door Ad5-positieve sera in vitro. Muizen immunisatie toonden de vorming van sterke humorale immuniteit specifiek voor het HIV epitoop en His 6. Deze studie proof-of-principle suggereerde dat het protocol in verband met het antigeen capside-Incorporation haalbare strategie kan worden toegepast voor de productie van Ad5-gevectoriseerd vaccins modificeren andere capside eiwitten. Dit protocol kan zelfs worden ferdere aangepast voor het genereren van zeldzame adenovirus serotype-gevectoriseerd vaccin.
Introduction
Human adenovirus (Ad) is een middelgrote, niet-omhulde virus met een icosahedraal nucleocapside met een dubbelstrengs DNA-genoom. Ad behoort tot de familie Adenoviridae, met een indeling in zeven groepen (A tot G). Elke groep bevat virus van verschillende serotypen. Waarvan adenovirus serotype 5 (Ad5) uit groep C is het meest uitgebreid bestudeerd en de meest gevraagde vectored benaderingen zoals gentherapie en vaccinatie.
De traditionele transgen strategie ontwikkeld en toegepast voor Ad5 modificaties die wordt gekenmerkt door de verplaatsing van het virus vroege genen met een gen-van-belang en de gerichte expressie van het gen-van-belang in een gastheer. Voorbeelden zijn de aanleg van pENV9 / Ad5hrΔE3 door vervanging vroege gen 3 (E3) met rev-gen van Simian Immunodeficiency Virus 1, de opbouw van AdCMVGag door vervanging vroege gen 1 (E1) met het gag-gen van Human ImmunodeficiencyVirus (HIV) 2 en de constructie van Ad lacZ door vervanging E1 met lacZ gen 3. De brede toepassing van de traditionele transgene strategie op Ad5 afhankelijk van de volgende voordelen: het brede scala van gastheren voor Ad5, het haalbare gentechniek op virus en virus vermeerdering, de grote accommodatie van vreemd gen insert en de veiligheid van Ad5 4,5. De verminderde efficacies van Ad5-gevectoriseerd klinische therapieën met behulp van deze strategie is een belangrijk knelpunt, die is toegewezen aan voornamelijk geassocieerd met Ad5 PEI, aangezien Ad5 zo voorkomt onder de meeste kinderen en volwassenen 4,6.
Om de belangrijkste bottleneck van Ad5 te overwinnen, het primaire doel is om een alternatieve strategie te omzeilen Ad5 PEI ontwikkelen. Aangeboren immuniteit 7, adaptieve immuniteit zoals neutraliserende antilichamen (NAbs) 8-10 en CD8 + T cel responsen 10 tegen Ad5 is aangetoond dat contribute tot Ad5 PEI, met Ad5 NAbs verschijnen aan de dominante rol in de bijdragen spelen om Ad5 PEI 10,11. Bovendien Ad5 NAD doelepitopen in capside-eiwitten, waaronder de voornaamste eiwit hexon, fiber en penton basis. Waarvan, hexon is het belangrijkste doelwit van Ad5 NAbs 8,11-13. Gebaseerd op deze bevindingen, is een innovatieve Antigeen capside-Incorporation strategie ingevoerd. Deze nieuwe strategie benadrukt de vervanging of incorporatie van eiwitten-of-rente op Ad5 capsideproteïnen, die verschuift of maskeert de Ad5 neutraliserende epitopen, wat leidt tot de verminderde erkenning door de NAbs en efficiënte Ad5 vector administraties. Het is opmerkelijk dat deze strategie concurrerend omdat het kan ook helpen systemen wekken sterke humorale immuniteit en krachtige cellulaire immuniteit door direct presenteren antigenen-plaats aan het immuunsysteem 4,14,15. Op basis van deze strategie kan de moleculaire klonering en recombinante virale vector Ad rescue structureel verdeeldin vier hoofdstappen: (a) de bereiding van gen-plaats-fragment door een polymerase kettingreactie (PCR) of synthese; (B) het ligeren van het genfragment in een shuttle plasmide dat het fragment gen-plaats en homologe armen een adenovirus skelet bevat; (C) de homologe recombinatie door co-transformatie van de shuttle plasmide dat het gen-van-belang-fragment met de gelineariseerde plasmide backbone pAd5 / ΔH5 (AR) 16; (D) de transfectie van lineair recombinante adenovirale plasmide aan de recombinante Ad vector opgenomen met antigenen-of-interest redden.
Onze groep en enkele anderen hebben deze alternatieve Ad integratie strategie voor Ad vectored ontwikkeling van vaccins tegen verschillende besmettelijke ziekteverwekkers verlengd. We meldden het genereren van een recombinante Ad vector Ad-HVR1-LGS-His 6-V3 doordat een His-gemerkte HIV-1 antigen V3 in het HVR1 locale van Ad5 hexon (hexon5). Dit gegenereerde vector geactiveerd strong humorale immuunrespons specifiek voor de V3 epitoop 4. We meldden ook de ontwikkeling van Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 door het opnemen van HIV-1 membraanproximale ectodomain gebied (MPER) in de HVR2 locale van hexon5 2. Daarnaast heeft het team van Dr. Zhou de voordelen van deze Ad opneming strategie gebruikt om Ad serotype 3 (Ad3) gevectoriseerd vaccins ie. Ontwikkelt, de vorming van virale vector R1SP70A3 doordat een neutraliserende epitoop SP70 enterovirus 71 in het HVR1 van Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 gegenereerde sterke NAbs en IFN-γ productie specifiek voor het epitoop SP70, die leiden tot het hoge percentage bescherming tegen Enterovirus 71 15 challenge.
Voor de toepassing van technische referentie, onze studie maakte gebruik van de kwalitatieve Antigeen Capsid-Incorporation strategie om zich te concentreren op het genereren van een divalent Ad5 vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door het opnemen van een HIV-1-antigeen in HVR1 eenda Zijn tag in HVR5 van hexon5. De gegenereerde virale vector werd immunologisch onderzocht. Het antigeen capside-Incorporation strategie kan worden toegepast voor de ontwikkeling van Ad5-gevectoriseerd vaccinatie benaderingen tegen verschillende infectieziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De universiteit van Alabama in Birmingham Institutional Animal gebruik en onderhoud goedgekeurd het gebruik van muizen als hierin beschreven onder het goedgekeurde protocol nummer 101.109.272.
1. Genetische Constructie van een gewijzigd Plasmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 met de Antigen Capsid-Incorporation Strategy
- De bouw van de shuttle plasmide HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S
- Bestel een plasmide dat het gesynthetiseerde DNA-sequentie HVR1-KWAS tussen de restrictie-enzymplaatsen Agel tot AccI van hexon5 gen.
- Digest 6 ug van het gesynthetiseerde fragment (HVR1-KWAS) met de enzymen Agel (6 eenheden) en AccI (6 eenheden) gedurende 3 uur bij 37 ° C. Scheid de verkregen fragment in een 2% agarosegel door elektroforese, en zuiver het fragment met DNA gel extractie kit volgens het protocol van de fabrikant.
- Op basis van de molaire verhouding van insertie tot vector van 3: 1, gebruik T4 DNA ligase en ligase bUffer tot 12 ng van het fragment (HVR1-KWAS) ligeren aan 100 ng van een eerder geconstrueerde shuttleplasmide HVR5 His-6 / pH5S 17 in een 10 pl volume bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, via de plaatsen van Agel en Accl.
- Transformeren 1 pl van 10 ul van het ligatieproduct in 50 ui elektrocompetente DH5a cellen in een electroporator (bij 1800 V). Voeg 950 pl SOC medium om de getransformeerde DH5a-cellen en incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 37 ° C met 300 rpm. Spread 100-200 pl van de 1 ml mengsel op Luria-Bertani (LB) agar met kanamycine en geïncubeerd O / N bij 37 ° C.
- Om te screenen ~ 10 kolonies door PCR targeting het fragment HVR1-KWAS, meng de voorwaartse primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT), reverse primer (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) en een enkele DH5a kolonie in een PCR master mix oplossing (volgens het protocol van de fabrikant). Run monsters op een thermocycler door te verwijzen naar de handleiding die bij de PCR master mix oplossing.
- Gebruik de voorwaartse primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) om het fragment HVR1-KWAS sequentie in de klonen gescreend in de sectie 1.1.4.1.
- Constructie van het plasmide pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6
- Digest 6 ug HVR1-KWAS-HVR5 His-6 / pH5S met enzymen EcoRI (6 eenheden) en Pmel (6 eenheden) gedurende 3 uur bij 37 ° C, en zuiver het fragment dat homologe recombinatie armen en het dubbele gemodificeerde hexon5 gen, zoals in stap 1.1.2. Lineariseren de ruggengraat plasmide pAd5 / ΔH5 (GL) 16 met Swal.
- Co-transformatie 100 ng van het doelwit fragment van de shuttle plasmide en 100 ng van gelineariseerde pAd5 / ΔH5 (GL) backbone in 50 ui elektrocompetente BJ5183 cellen voor de homologe recombinatie in een electroporator (bij 1800 V). Voeg 950 pl SOC medium om de getransformeerde cellen en incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 37 ° C, 300 rpm. Verdeel 100-200 gl van het mengsel 1 mlop LB-agar met kanamycine (uiteindelijke 50 ug / ml) voor O / N incubatie bij 37 ° C.
- Extra ~ 10 kleine kolonies in 3 ml vloeibare LB met kanamycine (uiteindelijke 50 ug / ml) voor O / N incubatie bij een schudapparaat (250 rpm, 37 ° C). Uittreksel plasmiden uit de kweek. Met PCR analyse om de 10 kolonies te screenen door het richten fragment HVR1-KWAS, zoals geïllustreerd in stap 1.1.4.1.
- Om hetzelfde kolonies door PCR-analyse te richten op de pIX fragment van de ruggengraat genoom te screenen, meng de voorwaartse primer (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), reverse primer (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) en een enkele BJ5183 kolonie in een PCR master mix oplossing (volgens het protocol van de fabrikant). Run monsters op een thermocycler door te verwijzen naar de handleiding die bij de PCR master mix oplossing.
- Wijzen de PCR dubbel-positieve kolonies als pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6.
- Transformeer 100 ng van het plasmide pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 inDH5a cellen zoals geïllustreerd in stap 1.1.4.
- Met PCR-analyse voor het screenen ~ 10 kolonies doelwit het fragment HVR1-KWAS, zoals geïllustreerd in stap 1.1.4.1.
- Met PCR-analyse met dezelfde kolonies te screenen door zich te richten de pIX fragment van de ruggengraat genoom, zoals geïllustreerd in stap 1.2.2.2.
- Gebruik de voorwaartse primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) om het fragment HVR1-KWAS sequentie in pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6.
2. Voorbereiding van de Modified Ad5 virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6
- Vormen de volledige medium door toevoeging FBS (uiteindelijke 10%), 100X Niet-essentiële aminozuren (0,1 mM uiteindelijke), 200 mM L-glutamine (2 mM final) en penicilline / streptomycine-oplossing (uiteindelijke 1%) in DMEM met hoog glucosegehalte . Handhaaf humane embryonale niercellen (HEK293) cellen in compleet medium in een incubator (37 ° C en 5% CO2 onder 85% bevochtigde omstandigheden).
- Redding van virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6
- Seed 3,0 x 10 6 van de HEK293 cellen in een T-25 kolf met 5 ml compleet medium en kweken O / N een monolaag met 80% confluentie bereiken.
- Lineariseren 15 ug pAd5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-His in een 100 pl volume met restrictie-enzym Pacl (15 eenheden) bij 37 ° C gedurende 3 uur.
- Uittreksel gelineariseerd pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door het centrifugeren het reactiemengsel twee keer (10.000 xg gedurende 1 min) met een gelijk volume fenol: chloroform: isoamylalcohol (ratio van 25: 24: 1) in een zuurkast en door opeenvolgende centrifugatie (10.000 x g gedurende 10 min) met een gemengde oplossing (300 ul 100% ethanol en 10 pl natriumacetaat) en 700 pl 70% ethanol. Gooi supernatant in elk stap van centrifugale bewerking.
- Resuspendeer het gezuiverde plasmide ~ 40 pi gedestilleerd water of Tris-EDTA (TE) -buffer. Kwantificeren het plasmide-DNA door de optische DEnsity (OD) bij 260 nm.
- Transfecteren 3 ug gelineariseerde plasmide commerciële liposomaal transfectiereagens in de T-25 kolf, volgens de handleiding van de fabrikant. Verander het transfectiemedium met compleet medium op 6 uur na transfectie en de daaropvolgende incubatie in de incubator. Handhaaf getransfecteerde cellen door het vervangen van compleet medium elke 2-3 dagen, tot individuele virale plaques vormen.
- Wanneer plaques volledig cytopathisch effect (CPE), schrapen de resterende cellen van de kolf in een steriele kap en oogsten cellysaat medium door centrifugeren bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Suspendeer de celpellet in ~ 1 ml medium dat 2% FBS en cellen doorbreken door vriesdrogen viermaal. Verzamel de bovenstaande vloeistof bevattende geredde virus na centrifugeren lysaat bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Grootschalige verspreiding van de virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6
- Propageren the virus in een T-75 kolf met HEK293-cellen in de steriele kap door het infecteren met 1/3 tot volledige lysaat van de T-25 kolf. Laat volledige CPE om binnen 2-3 dagen in de incubator. Oogst de lysaat supernatant zoals in stap 2.2.5.
- Propageren virus in 1-3 T-175 flessen in de steriele kap door het infecteren met 1/2 tot volledige lysaat van de T-75 kolf, afhankelijk van de virus geluidsoverdracht. Laat volledige CPE om binnen twee tot drie dagen in de incubator. Oogst de lysaat supernatant zoals in stap 2.2.5.
- Propageren virus in een twaalftal T-175 flessen in de steriele kap door het infecteren met 1/2 tot volledige lysaat van de vorige T-175 kolf (s). Bepaal de hoeveelheid kolf taalgebruiksgebaseerde het virus geluidsoverdracht en de hoeveelheid virus in nood. Oogst de lysaat supernatant zoals in stap 2.2.5 wanneer volledige CPE binnen twee tot drie dagen in de incubator.
- Purificatie van Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door cesium chloride
- Bereid twee dichtheden van CsCl oplossing in 5 mM HEPES: 1,33 g / ml en 1,45 g / ml en het vermijden van contact met CsCl.
- Lading 4 ml CsCl (1,33 g / ml) in een steriele ultracentrifuge buis en voorzichtig laad 4 ml CsCl (1,45 g / ml) tegen bodem van de buis. Lading 4 ml lysaat supernatant langzaam bovenop de gradiënten in de steriele kap.
- Centrifugeer de buis bij 110.000 xg gedurende 3 uur bij 4 ° C tot de mature / onderste virusband gescheiden van de defecte / hogere virusband. Verzamel de onderste band met behulp van een 3 ml spuit gewapend met een 33 G naald en verdun de band met 5 mM HEPES tot een volume 4 ml in de steriele kap.
- Laad een andere buis met twee dichtheden van CsCl oplossingen en verdunde band virus zoals beschreven in stap 2.4.2. Centrifugeer de buis bij 110.000 xg O / N bij 4 ° C. Verzamel de virale band zoals beschreven in stap 2.4.3.
- Injecteer de verzamelde virus oplossing in een dialysis cassette door een 3 ml spuit gewapend met een 33 G naald in de steriele kap.
- Plaats de cassette in 700 ml 1 x dialysebuffer (1 L recept: 100 ml 10 x PBS, 100 ml 100% glycerol en 800 ml gedestilleerd water, filter de buffer door een 0,22 urn filter) en vervang de dialyse buffer elke 3 uur gedurende 4 keer. Zuigen uit gedialyseerde virus oplossing met genaaide spuit.
3. Validatie van de geredde virale vector
- Virale vector Titraties
- Voor de virus titer fysische, zowel verdund virus en dialyse buffer (achtergrondcontrole) op 1: 10 en 1: 20 virus in lysisbuffer (10% SDS in Tris-EDTA) in buisjes en incubeer alle buizen bij 56 ° C gedurende 10 min.
- Zet op een BioPhotometer en stel de wijze van absorptie bij OD 260 nm. Gebruik de verdunde dialyse buffer (1: 10) naar de achtergrond signaal evenwicht door te klikken op de "blanco" bottom. Type "10 + 90" in de BioPhotometer screen, en leest het signaal van de verdunde virusoplossing (1: 10).
- Lees het signaal van de verdunde virusoplossing (1: 20) volgens de werkwijze in stap 3.1.2, maar typ "5 + 95" in het BioPhotometer scherm. Vermenigvuldig de twee virus uitlezing getallen door 1.1x10 12 en bereken het gemiddelde titer een eenheid VP / ml, gebaseerd op de twee individuele titers van de twee verdunningen.
- Voor het infectieuze virus titer (IP / ml), met de Karber statistische TCID50 werkwijze 14 voor de infectie diepte op HEK293 cellen te bepalen op 10 dagen na infectie (dpi)
- Evaluatie van antigene blootstelling weergave op de virale vector
- Coat de virale vector in een ELISA plaat en gaan met de overige stappen in een standaard ELISA-werkwijze 14. Gebruik humane anti-gp41 (2F5) monoklonaal antilichaam (mAb) en muis anti-His tag mAb voor detectie van overeenkomstige opgenomen antigenen 14.
- Het oplossen van de virale vector in een denatured eiwit gel elektroforese (SDS-PAGE), waarna de rest van de stappen in een standaard Western blot-werkwijze 14. Gebruik humane anti-gp41 (2F5) monoklonaal antilichaam (mAb) en muis anti-His tag mAb voor detectie van overeenkomstige opgenomen antigenen 14.
- In vitro evaluatie van de vector op het vermogen om Ad5-positve sera omzeilen
- Handhaaf HeLa-cellen in compleet medium in de incubator (37 ° C en 5% CO 2 onder 85% bevochtigde omstandigheden). Vormen de volledige medium door toevoeging FBS (uiteindelijke 10%), 200 mM L-glutamine (2 mM final) en penicilline / streptomycine-oplossing (uiteindelijke 1%) in Minimum Essential Medium Eagle (MEME).
- Seed HeLa-cellen in 6-well platen met 1x10 6 cellen / putje en incubeer de platen in de incubator (37 ° C en 5% CO 2 onder 85% bevochtigde omstandigheden) gedurende 2 uur. Incubeer Ad5-positieve sera (0,1 ul of 0 pi) met 5 IP / cel van virale vector (Ad5 of Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6) in de incubator gedurende 1 uur vóór het toevoegen van het mengsel op de 6-well platen met cellen.
- Op 24 uur na infectie (HPI), spoelen cellen eenmaal met PBS en lyseren cellen in 0,5 ml lysis buffer. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 5 minuten en verzamel de supernatant. Meng 20 ui van het supernatant met 100 ui luciferase substraat voor luciferase signaallees-, omdat virussen bevatten het luciferasegen.
4. Immunologische Evaluatie van de geredde virale vector
- Bereid twee immunisatie groepen: Ad5 en Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6.
- Injecteer muizen (n = 8 / groep) intramusculair met virussen op 1x10 10 VP / muis, in een homoloog "prime-boost" immunisatieregime, met een interval van 2 weken.
- Op 2 weken na elke injectie, bloeden muizen zonder verdoving door wang bloeden met dierlijke lancetten (5 mm tip lengte) aanbloed te verzamelen in 1,5 ml buizen.
- Meng het bloed in de buizen door het omkeren en neer, en incuberen van het bloed bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Spin de buizen bij 10.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en overdracht sera (bovenlaag) nieuwe 1,5 ml buizen.
- Draai de nieuwe buizen bij 10.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en overdracht sera van nieuw gemarkeerde 1,5 ml buizen voor opslag bij -80 ° C.
- Evaluatie van antigeenspecifieke humorale immuniteit-sera gebaseerde ELISA
- Verdunnen Zijn peptide (voorraad bij 1 mM) en HIV-1 peptide (voorraad bij 1 mM) afzonderlijk in 100.
- mM carbonaatbuffer (pH 9,5) aan het peptide coatingconcentratie bereiken bij 10 uM. Coat de ELISA-platen met verdunde peptiden afzonderlijk door toevoeging van 100 pl per putje en het incuberen van de platen O / N bij 4 ° C.
- Was de platen met PBST viermaal met 200 gl / putje en block 1 uur in 5% BSA in PBST. Breng muizensera de platen bij 1: 100 verdunning in de blokkerende buffer, 100 ul / putje. Incubeer 2 uur incubatie bij KT.
- Was de platen met PBST vier keer. Blokkeer de platen incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min in blokkerende buffer bij 100 pl / well.
- Breng geit anti-muis IgG-HRP (1: 5000 in blokkerende buffer) en 100 gl / putje van zowel de platen bekleed met Zijn peptide en HIV-1 peptide afzonderlijk. Incubeer 2 uur bij KT. Was de platen met PBST.
- Lees de platen bij OD450 nm na incubatie met HRP-substraat gedurende 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het antigeen capside-Incorporation strategie (figuur 1A) werd gebruikt om de tweewaardige Ad5 virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 genereren. Ten eerste, de shuttle plasmide HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S werd geconstrueerd door subklonering HVR1-KWAS fragment in de vorige geconstrueerde shuttle plasmide HVR5-His 6 / pH5S 17. Ten tweede werd het plasmide pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 14 werd geconstrueerd door een homologe recombinatie tussen het fragment van "EcoRI-HVR1-KWAS-HVR5-His6-Pmel" en Swal-gelineariseerd pAd5 / ΔH5 (GL ) 16 (Figuur 1B). Transfectie van Pad geknipt pAd5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-His in een T-25 kolf leiden tot het redden van de virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 14. De geredde virale vector werd daarna gekweekt in grote schaal en gezuiverd door twee cycli van CsCI gradiënt ultracentrifuge.
Om tetonen de levensvatbaarheid / fitness van de geredde virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6, de fysieke titer werd bepaald op 1,3 x 10 11 VP / ml door het meten van de fysieke exemplaren van virale genoom, en de besmettelijke titer was bepaald bij 1,4 x 10 9 IP / ml door titratie van het werkelijke infectueuze virale partikels. De VP / IP-ratio werd vervolgens berekend op 92 14. Normaal gesproken, een advertentie met een VP / IP-ratio onder 1.000 duidt op een kwalitatieve conditie van dit virus. Om te bewijzen of het geredde virus wordt de antigene HIV-antigeen en His tag respectievelijk het oppervlak van het virale capside voornaamste eiwitcomponent hexon5, werd ELISA uitgevoerd met menselijke 2F5 mAb en muis anti-His tag mAb, respectievelijk. De resultaten gaven aan dat zowel de mens 2F5 mAb (Figuur 2A) 14 en de muis anti-His tag mAb (Figuur 2B) 14 vertoonden binding aan Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6, terwijl er geen binding aan de negatieve control vector Ad5. Western-blot-analyse werd gebruikt om de gegevens in de ELISA te bevestigen, aangezien zowel menselijke 2F5 mAb (Figuur 2C) 14 en muis-anti-His tag mAb (Figuur 2D) 14 gedetecteerd specifieke banden rond 117 kDa alleen het virus Ad5 / H5 HVR1-KWAS-HVR5-His 6, wat overeenkomt met de grootte van hexon5 eiwit. Om het potentieel van de evaluatie van Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 in het omzeilen van neutralisatie door Ad5-positieve sera, neutralisatie assay analyse werd uitgevoerd zoals vermeld in de sectie protocol 3.3. De resultaten toonden aan dat de relatieve lichtgevende unit (RLU) signaal van de virale vector Ad5 behandeld met 0 ul Ad5-positve sera is 12 maal hoger dan die van dezelfde vector behandeld met 0,1 gl Ad5-positve sera (p-waarde <0,001 ). Dit suggereerde de neutralisatie van de vector Ad5 door de Ad5-positvive sera. In tegenstelling, was er weinig verschil met de virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6behandeld met 0 pi en 0,1 pi Ad5-positve sera (figuur 3). Aangezien hexon is de belangrijkste doelwit van Ad NAbs en hexon-specifieke neutraliserende epitopen in alle HVRs van hexon 12,18 wonen, de bovenstaande gegevens blijkt dat Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 ontsnapte neutralisatie door Ad5-positve sera in vitro en stelde het potentieel van Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 op omzeilen Ad5 PEI in de gastheer.
Om te onderzoeken of het gewijzigde tweewaardige Ad5 virale vector met het antigeen capside-Incorporation strategie robuuste humorale immuniteit specifiek voor de opgenomen antigenen speciale locaties kunnen wekken, werd de "prime-boost" immunisatieregime toegepast immuniseren van muizen met controle-virale vector Ad5 en de divalente vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. Sera-gebaseerde ELISA bekleed met HIV-1-peptide lieten zien dat immunisatie sera van groep Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 hadden significant binding aan het HIV-1 peptide bij verdunningen tussen 40 en 640, in vergelijking met de sera van de controlegroep (p-waarde <0,001) (figuur 4A) 14. Sera-gebaseerde ELISA gecoat met His peptide toonde aan dat sera van de immunisatie groep Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 had significante binding aan het His-peptide in vergelijking met de sera van de controle groep, statistische p waarde < 0,001 bij verdunningen van sera 40 en 80, p waarde <0,01 bij een verdunning van 160 en p-waarde <0,05 op een 320 verdunning (figuur 4B) 14. De bovenstaande resultaten gaven de vorming van humorale immune reactie tegen de opgenomen antigenen op de tweewaardige virale vector.
Figuur 1. Schematische weergave van de genetische constructie van plasmide pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 met de Antigen Capsid-Incorporation strategie. (A) het antigeen capside-Incorporation strategie volgt antigen speciale locaties op het capside eiwitten (hexon, penta base, pIX en / of vezel) van adenovirus direct weergeven. Dit cijfer werd aangepast van Nemerow et al., 2009 Virology 384 (2009) 380-388, copyright Elsevier. (B) Gene fragment (HVR1-KWAS) werd gesynthetiseerd en gekloond in een pUC vector door een bedrijf. Dit fragment werd gesubkloneerd in de eerder geconstrueerde shuttleplasmide HVR5 His-6 / pH5S door de restrictie-enzymen Agel en AccI tot HVR1-KWAS-HVR5 His-6 / pH5S genereren. Het resulterende shuttleplasmide werd gedigereerd met enzymen EcoRI en Pmel en co-getransformeerd met SwaI-gelineariseerd plasmide backbone pAd5 / ΔH5 (GL) voor de homologe recombinatie, resulteert in de vorming van het gerecombineerde ruggengraat plasmide pAd5 / H5-HVR1-KWAS -HVR5 6-His. In deze figuur, R1 geeft HVR1 en R5 geeft HVR5 en GL geeft groene fluorescentie eiwit (GFP) en luciferase, afzonderlijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Evaluatie van de antigene blootstelling van geïncorporeerde capside antigenen op het oppervlak van de tweewaardige virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-His. Totaal virale vector ELISA werd uitgevoerd om te bepalen of de opgenomen antigenen werden blootgesteld aan vector oppervlak behoud antigene kenmerken van hun. ELISA platen werden gecoat met het tweewaardige vector en geïncubeerd met humane 2F5 mAb (A) of muizen anti-His mAb (B). Gegevens gaf de significante binding van de antilichamen aan het tweewaardige vector, maar niet met de controle vector Ad5. R1-KWAS-R5-His 6 geeft Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. Western-blot analyse werd uitgevoerd om de binding van de antigene humane 2F5 mAb (C) of muis-anti-His mAb (D) op de verwerkte antigenen op de tweewaardige vector te bevestigen. In beide (C) en (D), laan 1 geeft Ad5, en laan 2 aangeven Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Evaluatie van de tweewaardige virale vector in staat is om de neutralisatie van Ad5-positve sera in vitro. Neutralisatie assay ontsnappen werd uitgevoerd om te bepalen of de tweewaardige vector neutralisatie kon ontsnappen. De resultaten wezen de neutralisatie van Ad5 virus door de sera, maar eskaap van neutralisatie van de divalente virus in vitro. In deze figuur, R1-KWAS-R5-His 6 geeft Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6. De sterretjes *** geeft p-waarde van <0,001.
Figuur 4. In vivo vorming van humorale immuniteit door de tweewaardige virale vector in het muismodel. Sera-gebaseerde ELISA werd gebruikt om de humorale immuniteit tegen de ingebouwde eiwitten op de tweewaardige vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 evalueren . HIV-1-peptide (A) en His peptide (B) werden bekleed in ELISA platen afzonderlijk, gevolgd door incubatie met de sera van muizen beide immunisatiegroepen (Ad5 en Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6) . Gegevens aangegeven de aanzienlijke vorming van humorale immuunresponsen tegen het HIV-1 antigeen in HVR1 (A) en de His tag in HVR5 (B). Elk gegevenspunt vertegenwoordigt middelen en SD van acht herhalingen. De sterretjes *** geeft de waarde p <0,001, ** geeft p waarde van <0,01 en * de p waarde <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De toepassing van de traditionele transgen strategie Ad5 modificatie voor de ontwikkeling van vaccins is afgenomen voornamelijk door de bottleneck in verband met de Ad5 PEI 4,6. Dit knelpunt kan gedeeltelijk worden verminderd door toepassing van de alternatieve Antigeen Capsid-Incorporation strategie (figuur 1A), aangezien deze strategie neutralisatie kan omzeilen door Ad5 NAbs door het vervangen van neutraliserende epitopen van Ad5 met antigenen-of-interest, en het genereren van robuuste immuniteit te vergemakkelijken om de opgenomen antigenen-of-interest. In deze studie, de vorming van het gemodificeerde tweewaardige virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-His werd ingevoerd als conceptuele voorbeeld (Figuur 1B). Overeenkomt met de sectie protocol 1.1.1, de gesynthetiseerde fragment in de bestelde plasmide bevat een HIV-1 gp41 korte gen substitutie in het HVR1 locale van hexon5. De partiële gp41-gen codeert voor een epitoop ELDKWAS die vervangtgedeeltelijke HVR1 van de aminozuren 139-144 van hexon5 14. ELDKWAS een sterke neutraliserende epitoop van HIV-1 gp41 19.
Tijdens het klonen, waren er twee kritische stappen. Een stap was het selecteren van twee restrictie enzymen bij het synthetiseren van het genfragment interesse in het protocol 1.1.1. De keuze van de twee enzymen voorwaardelijk afhankelijk van de locatie van Ad capside te wijzigen, bijv., In deze studie werd genfragment dat KWAS aangewezen op te nemen in HVR1 van hexon5 eiwit. Restrictie enzymen Agel en AccI afzonderlijk bestaan bij N-eindstandige en C-eindstandige flankerende gebieden van het HVR1 locale en bestaan niet in het fragment HVR1-KWAS, waardoor Agel en AccI werden gekozen N-terminus en C afzonderlijk worden gebracht terminus van de gesynthetiseerde fragment HVR1-KWAS. Aangezien hexon is de belangrijkste doelwit van Ad NAbs en hexon-specifieke neutraliserende epitopen in alle HVRs van hexon 12,18 wonen, is het mogelijk dat the gemodificeerde hexon Ad5 vectoren met het antigeen capside-Incorporation strategie zou het vermogen de neutralisatie omzeilen door Ad5-positieve sera in vitro verkrijgen en zelfs de Ad5 PEI in ontvangst. In deze studie konden zowel HVR1 en HVR5 de tweewaardige virale vector bij aan het ontsnappen van neutralisatie door de Ad5-positieve sera. De andere kritische stap was in de sectie protocol 1.2.2. Nadat de O / N incubatie van gecotransformeerde mengsel op LB agar, moet de gegroeide kolonies BJ5183 onmiddellijk in vloeibaar LB zijn voor O / N en plasmiden moeten onmiddellijk worden geëxtraheerd uit de cellen BJ5183 ook. Het uitstellen van de procedures zal waarschijnlijk leiden tot mogelijke recombinatie en mutatie, omdat het gerecombineerde plasmide in de cellen BJ5183 niet stabiel. Het correcte plasmide uit de homologe recombinatie te worden omgezet in DH5a teneinde een stabiele en goed genoom species behouden.
Na het klonen, waren er twee meer kritische stappen. Deeerste stap in het protocol bevindt transfectie. Het is noodzakelijk de gerecombineerde Ad ruggengraat plasmide te transfecteren in cellen die expressie Ad5 E1 (HEK293), wanneer de ruggengraat plasmide E1 gen geschrapt. De andere stap in de paragraaf 2.3 protocol is ongeveer virus upscaling. De basisprocedure voor het virus opschaling volgt het principe van standaard virus opschalen van een T-25 kolf met T-75 kolven en T-175 kolven. Echter het aantal kolven (T-75 en / of T-175) voor gebruik op de groeisnelheid van het virus, de CPE ontwikkeling veroorzaakt door het virus infectie en het virus nodig.
De Antigen Capsid-Incorporation strategie zorgt voor een brede toepassing op Ad wijzigingen. Met deze strategie is het mogelijk te wijzigen of integreren heterologe antigenen op verschillende belangrijke capside-eiwitten, zoals 2,4,20 hexon, penton base 21 en fiber 22. De capside kleine eiwit pIX C-terminus toonde ook belofte voor de heterologous antigen / peptide incorporatie 21,23. Naast de enkele wijziging, meerdere wijzigingen op Ad met deze strategie ook bereikt succes. Voorbeelden hiervan zijn de generatie van divalente Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 in deze studie door oprichtingen in zowel HVR1 en HVR5 van hexon5, en de integratie van twee neutraliserende epitopen van het type enterovirus 71 in ofwel HVR1 en HVR2 of HVR1 en HVR4 of HVR1 en HVR5 van hexon3 24. Deze voorbeelden impliceren de haalbaarheid van hexon modificaties in andere serotypen van Ad, met het oog op zowel gentherapie en vaccinatie benadering. Onze data toonde ook de oprichtingen van twee Trypanosoma cruzi epitopen in hexon- en pIX (ongepubliceerde gegevens). Deze strategie is ook uitgebreid tot chimère Ad vectoren voor zowel vaccinatie of gentherapie benaderingen maken. Voorbeelden zijn het genereren van chimere Ad5H3 door hexon5 schakelen met hexon3 16, het genereren van chimere Ad3H7 door het schakelen hexon3 with hexon7 25, en het genereren van chimere Ad5F4 door vervanging van Ad5 fiber met Ad4 vezel 26.
In deze studie, het tweewaardige Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 toonde het opwekken van humorale immuunresponsen specifiek zijn voor de opgenomen antigenen speciale locaties. Ons huidige project toont dat Asp2-specifieke CD8 T-cel respons significant is geprimed door immunisatie met een vector Ad5-pIX-Asp2, die werd geproduceerd door het opnemen Asp2 peptide in eiwit IX (pIX) van Ad5, met het antigeen capside-Incorporation strategie (data niet getoond). Asp2, ook genoemd amastigoot oppervlakte-eiwit 2, is een immunodominant antigen van de digenetic intracellulaire protozoaire parasiet Trypanosoma cruzi (T. cruzi) 27. Deze nieuwe experimentele bevinding uitstrekt kennis dat de toepassing van antigeen capside-Opneming strategie Ad gevectoriseerd vaccins kunnen opwekken niet alleen humorale immuunresponsen, maar ook cellulaire immune reacties die specifiek zijn voor de antigenen-of-interest.
Hoewel relatief gunstig de traditionele transgen strategie, de Antigen capside-Incorporation strategie ook drie nadelen. Ten eerste kan het niet de opname van gen-van-belang mogelijk zolang traditionele strategie heeft. Vermeld is dat het antigeen capside-Opneming strategie hexon5 maakt inserties van ten hoogste 80 aminozuren (aa) in HVR1, 77 aa in HVR5 en 57 aa in HVR2 2. Waarvan, HVR1 is de meest tolerante locale voor de integratie. Echter, de kleine capside-eiwit voor pIX ruimte voor een insertie van 1000 aminozuren 28. Ten tweede, sommige antigenen van interesse in de natuur niet in opneming in de Ad capside eiwitten, vanwege factoren zoals de kosten en krachten van aminozuren, die lijken op de structurele rangschikking van Ad virus verstoren. In dit geval is de invoering van geschikte afstandhouders verband met de antigenen van belang kan helpen the succesvolle integratie 4. Ten derde, oprichtingen in sommige HVR locales, dwz., HVR6 of HVR7 kan leiden tot mislukte generatie van levensvatbare virale vectoren 12. Gezien de voordelen en nadelen van beide strategieën zal een verstandige keuze van de twee strategieën of een combinatie van beide strategieën afhangen van de specifieke omstandigheden / behoeften. Een voorbeeld van kammen beide strategieën is het genereren van Ad5 / HVR2-MPER-L15 (Gag), waarbij het membraan-proximale buitengebied (MPER) van HIV-1 gp41was ingebouwd in HVR2 van hexon5 met het antigeen capside-Incorporation strategie en HIV-1 Gag-gen werd ingebracht om het E1 gen locale van Ad5 te vervangen door traditionele transgen strategie 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health verleent 5T32AI7493-20 en 5R01AI089337-03. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit te publiceren, of de bereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
| 10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
| glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
| SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
| 100x Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
| 200 mM L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
| penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
| DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
| Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
| cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
| HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
| HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
| T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
| T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
| T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
| Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
| Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
| dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
| ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
| human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
| mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
| SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
| PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
| Animal lancet (point length at 5 mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
| Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |
References
- Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
- Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815 (2010).
- DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
- Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112 (2014).
- Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
- Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
- Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571 (2013).
- Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
- Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
- Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
- Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
- Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
- Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
- Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347 (2013).
- Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381 (2012).
- Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
- Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
- Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
- Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
- Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).
- Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
- Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
- Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
- Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
- Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
- Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533 (2013).
- Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).
- Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).
