Protokoller, insan kemik doku eksplantı model sisteminde göğüs kanseri hücre hareketi, çoğalması ve kolonizasyonu çalışmak için tarif edilmiştir.
Kemik meme kanseri metastazı en sık sitedir. Yaygın mikroçevresinin etkiler kanser hücresi davranışı kabul edilmesine rağmen, çok az insan kemik dokusunun doğal mikroçevresinin içinde meme kanseri hücre özellikleri ve davranışları hakkında bilinmektedir. Biz, izlemek ölçmek ve mikro-içinde insan meme kanseri hücrelerini modüle yaklaşımlar geliştirdik Total kalça protezi ameliyatları takip atılır femur başları izole kültür, insan kemik doku parçaları. Meme kanseri hücrelerini lusiferaz için tasarlanmış ve yeşil floresan protein (EGFP) ifade gelişmiş kullanarak, tekrarlanabilir sonra meme hücreleri floresan mikroskopi kullanılarak kemik parçaları içinde biyolüminesans görüntüleme kullanılarak göç ve çoğalması desenleri (BLI), parça hücre etkileşimleri ölçmek ve değerlendirmek mümkün Akış sitometrri ile kolonizasyon. Bu modelin temel avantajları şunlardır: 1) bir yerli, mimari sağlam doku microeilgili insan hücre tiplerini içerir ve hızlı nicel ve nitel izleme ve meme ve kemik hücre özellikleri, davranışları ve etkileşimleri pertürbasyon kolaylaştırır mikroçevresinin, 2) doğrudan erişim bütünlüklü. Birincil sınırlama, şu anda, kısa vadeli kültürüne çalışmanın pencere sınırlandırmaktadır doku parçalarının, sonlu canlılık olduğunu. Model sisteminin uygulamaları metastatik niş içinde meme kanseri ve diğer kemik arayan maligniteler temel biyoloji okuyan ve etkili bir kemik dokularında meme kanseri hücrelerini hedef tedavi stratejilerinin geliştirilmesi bulunmaktadır.
tümör mikro yaygın meme kanseri ilerlemesi ve metastatik sırasında kanser hücresi davranış kritik belirleyicisi olarak kabul edilmektedir 1-3 yayıldı. Burada sunulan yöntemin amacı, insan kemik dokusundan, göğüs kanseri metastazı 4-6 en sık site mikro-içinde, meme kanseri hücrelerinin çalışma kolaylaştırmaktır. Kemik metastatik ilerlemesi 10,11 sorumlu hücreler ve salgılanan faktörler barındıran her ikisi de mineralize ve iliği bölümlerinin 7-9 oluşur. Yaygın in vivo fare modellerinde kullanılan rağmen metastatik sürecinin 12-15 sistemik çalışmalarını kolaylaştırmak, iskelet içinde hücre etkileşimleri gözlem ve doğrudan pertürbasyon için kolayca erişilebilir değildir. Eğitim ve fare kemik dokuları ve fare kemik iliği hücreleri kültür Model sistemleri daha iyi erişim sağlamak ve meme kanseri hücre m altında yatan birçok karışma ilgili anlayışlar ve mekanizmalar vermiştirMurin iskelet 16-22 etastasis. Ancak, çalışmalar kemik dokusu 23,24 için osteotropism ve türe özgü desenleri olabileceğini düşündürmektedir. Bu modeller, kemik muhtemel belirleyiciler hepsi doğal türe özgü kemik dokusu özelliklerindeki farklılıklardan, bağışıklık-eksikli fareler 11 değiştirilmiş kemik iliği popülasyonlardan elde edilen farklar, ve / veya deneylerinde kullanılan fareler nispeten genç yaş, yansıtabilir mikroçevresinin.
In vitro olarak, tipik haliyle, kemik iliği türevli osteoblast veya tek katmanlar olarak kültür stromal hücreler olarak ya da genetik mühendisliği 3 boyutlu model sistemlerinde 25-35 içinde belirli kemik hücre tipleri üzerinde odaklanmıştır insan kemik eş kültürlerinde meme kanseri hücreleri incelemek için yaklaşımlar. 2-boyutlu hücre kültürü modelleri, in vitro dayanak oluşan kanser araştırmaları için yaklaşımlar var olsa da, uzun hücre davranışı temelde m değiştirilmiş olduğu kabul edilmiştirkültür sistemleri 18,36,37 onolayer. Bu matris ve kolajen gibi doğal malzemelerden oluşan iskele tabanlı modelleri dahil olmak üzere 3-boyutlu bir oturma dokuların karmaşıklığı taklit eden, işlenmiş mikroçevrelerde gelişmesine yol açmıştır ya da sentetik polimerler, doku gibi mikroçevrelerde oluşturmak için özel hücre tipleri ile tohumlandı 36-41. Engineered yaklaşımlar da kontrol ve mikroçevresinin 18,19,41-43 hormonal ortam çalışma biyoreaktör platformlarının kullanımı dahil ettik. Biomimetik modelleri ve biyoreaktörler kontrollü bir ortamda kompleks doku çevresinde birçok unsuru sağlar ve başarılı kemik 18,19,35,42,43 meme kanseri metastazı çalışma önceden uygulanmış olsa da, işlenmiş model sistemler, genel olarak yapılmasına olanak vermemektedir doğal kemik ortamında mevcut hücre tipleri ve hücre dışı matriks bileşenlerinin tam spektrum.
Yakın zamana kadar, göğüs kanseriHücreler, insan kemik dokularının yerli, bozulmamış, 3-boyutlu mikroçevresinin içinde çalışılmamıştır. Biz son zamanlarda (THR) ameliyatı 44 örneklerinde total kalça protezi izole insan kemik doku parçaları kullanarak bir ko-kültür modelinin gelişmesini bildirdi. Bu örnekler hem kısa vadeli kültüründe mikro-metastazı altında yatan mekanizmaları incelemek için gerekli mineralizasyon ve kemik iliği bölmeleri liman. Önceki çalışmada, kemik parçaları 44 ile (MDA-MB-231-Fluc) ko-kültür lusiferaz sentezleyen meme kanseri hücrelerinin çoğalmasını izlemek için biyoışıldama görüntüleme (BLI) kullanılarak kanıtını prensip oluşturmuştur. Burada insan kemik dokusu eksplantlarındaki yerli mikroçevresinin kapsamında meme kanseri hücre çoğalmasını, kolonizasyonu ve göç çalışmak için deneysel protokolleri ayrıntılı bulundular.
İlk olarak meme ölçmek için kemik parçaları bitişik eş-kültürleme göğüs kanseri hücreleri için bir protokol mevcutBLI kullanarak hücre çoğalması. Bu bölümde, meme hücresi süspansiyonları, kemik mumu parçaları ile hareketsiz hale kemik parçaları, bitişik 6 oyuklu plakalar içinde hücre noktalar olarak tohumlanır. Kontrol kuyuları, kemik mumu, ama hiçbir kemik fragmanı içerirler. Hücre noktalar eklemek sonra, orta eklenmiş ve plaka BLI ile ölçülür biyolüminesens sinyal yoğunluğu (hücre sayısı ile ilişkili) sonra 24 saat için kültüre edilir. Bir sonraki adımda, kolonizasyonun ve çoğalmanın çalışma kemik parçalarının doğrudan ekilmiş ko-kültür göğüs kanseri hücreleri için yöntemler sunar. İşte meme hücre süspansiyonları kolonizasyonu ve hücre sayısını izlemek için zamanla BL ve floresan mikroskobu ile kültüründe izlenir kemik doku parçaları, doğrudan pipetlenir. Bu yöntemde, kemik iliği bölme akış sitometrisi ile kolonize göğüs kanseri hücrelerinin analizi için her zaman noktasında kemik parçaları temizlendi, ya da ilik canlılığı deneyleri edilebilir.
Buna ek olarak, elimizdeki deMeme kanseri hücre göçü ölçmek için kâtip, iki farklı yaklaşım. İlk yöntemde adım kemik dokusu kültür yüzer doğru göç ölçülmesi için özetlenmiştir. Transwell iç üst yüzeyleri bir 8 um gözenek büyüklüğüne sahip membranlar eklemek üzerine (Şekil 1A 'da gösterildiği gibi), bu protokolde, göğüs kanseri hücreleri tohumlanır. Ekler daha sonra kemik dokusu süpernatan ya da kontrol ortamı içeren oyuklara sahip bir alıcı plaka içerisine yerleştirilmiştir. 20 saatlik bir bekletme sürecinden boyunca, meme kanseri hücrelerinin az sayıda aşağı bunlar BLI tespiti için eklemek alt doku kültür kuyu içine sokma zarları içinden yer değiştirmektedir. İkinci geçiş yöntemde meme kanseri hücreleri Transwell uç zarların alt dış yüzeyleri üzerine ekilir. Kemik dokusu parçaları uç bardak içine yerleştirilir ve göğüs kanseri hücreleri (Şekil 1 B 'de gösterildiği gibi), kemik parçaları kolonize zarlanndan taşınmalarısonra BLI kullanarak görüntülü.
Mehra ark., Daha önce yüksek kaliteli dokuları ortaya ve metastatik süreci 47 çalışma, insan kemik örneklerinin kullanımını doğrularken, otopsi sırasında hasat metastatik prostat kanseri hastalarından alınan postmortem toplama ve kemik örneklerinin analizi tarif var. Burada, toplama, işleme ve meme hücre göçü, kolonizasyon ve çoğalmasını incelemek için kısa vadeli bir ko-kültür sisteminde THR cerrahi sonrası atılır femur başları elde edilen insan kemik doku parçala…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmalar Alternatif Araştırma ve Geliştirme Vakfı (107.588), Ulusal Sağlık Enstitüsü (1U54CA136465-04S1) ve Kaliforniya Meme Kanseri Araştırma Programı (201B-0141) hibe, kısmen finanse edildi. Biz Dr teşekkür ederim. Cömert bağış için Andrew Wilber ve R. Scott McIvor onların transponson ve pKa / hUbiC-SB11 transposaz plazmidler. Biz minnetle John Tamaresis, Ph.D. kabul istatistiksel yöntemler tavsiye için, Timothy Brown flow sitometri gerçekleştirmek için, göçler tahliller tavsiye için Georgette Henrich, Nancy Bellagamba için THR örneklerinin koleksiyonu kolaylaştırılması.
DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL) | Life Technologies | L-8220 | |
Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |