Summary
I protocolli sono descritti per studiare la migrazione delle cellule del cancro al seno, la proliferazione e la colonizzazione in un tessuto osseo sistema modello espianto umana.
Abstract
Bone è la sede più comune di metastasi del cancro al seno. Anche se è ampiamente accettato che il comportamento delle cellule di cancro influenze microambiente, poco si sa circa le proprietà delle cellule del cancro al seno e comportamenti all'interno del microambiente nativo del tessuto osseo umano. Abbiamo sviluppato approcci per monitorare, quantificare e modulare le cellule del cancro al seno umano nel microambiente di frammenti umani in coltura di tessuto osseo isolati da teste femorali scartati seguenti totali interventi chirurgici di sostituzione dell'anca. Usando le cellule del cancro al seno ingegnerizzate per luciferasi e migliorate proteina fluorescente verde (EGFP) espressione, siamo in grado di quantificare in modo riproducibile di migrazione e proliferazione modelli che utilizzano l'imaging bioluminescenza (BLI), interazioni cellulari pista entro i frammenti ossei mediante microscopia a fluorescenza, e valutare le cellule del seno dopo colonizzazione con citometria a flusso. I vantaggi principali di questo modello sono: 1) un nativo, MicroE tessuto architettonico intattonvironment che include importanti tipi di cellule umane, e 2) l'accesso diretto al microambiente, che facilita la rapida quantitativa e monitoraggio qualitativo e perturbazione del seno e delle cellule delle ossa proprietà, comportamenti e interazioni. Una limitazione primaria, attualmente, è finita la vitalità dei frammenti di tessuto, che delimita la finestra di studio per coltura breve termine. Applicazioni del sistema modello comprendono lo studio della biologia di base di cancro al seno e di altri tumori maligni ossa cerca all'interno della nicchia metastatica, e lo sviluppo di strategie terapeutiche per indirizzare in modo efficace le cellule del cancro al seno nei tessuti ossei.
Introduction
Il microambiente tumorale è ampiamente riconosciuto come un fattore determinante del comportamento delle cellule di cancro durante la progressione del cancro al seno e metastasi diffuse 1-3. L'obiettivo del metodo presentato qui è quello di facilitare lo studio delle cellule del cancro al seno nel microambiente del tessuto osseo umano, la sede più frequente di cancro al seno metastasi 4-6. Bone comprende mineralizzati e midollo compartimenti 7-9, entrambe ospitano cellule e fattori secreti implicati nella progressione metastatica 10,11. Benché ampiamente utilizzato in modelli di topo vivo facilitare studi sistemici del processo metastatico 12-15, interazioni delle cellule all'interno dello scheletro non sono facilmente accessibili per l'osservazione e la perturbazione diretta. Sistemi modello per lo studio e la coltura dei tessuti osseo di topo e cellule del mouse midollo forniscono un migliore accesso e hanno prodotto molte intuizioni per quanto riguarda le interferenze ei meccanismi alla base delle cellule del cancro al seno metastasis dello scheletro murino 16-22. Tuttavia, gli studi hanno suggerito che ci possono essere specie-specifiche modelli di osteotropism per il tessuto osseo 23,24. Questi modelli potrebbero riflettere specie-specifiche intrinseche differenze nelle proprietà del tessuto osseo, differenze derivanti dalla alterati popolazioni di midollo osseo in topi con deficit immunitario 11, e / o la relativamente giovane età di topi utilizzati in esperimenti, che sono tutti probabili determinanti dell'osso microambiente.
In vitro approcci per studiare le cellule del cancro al seno in co-colture di ossa umane sono in genere concentrati su specifici tipi di cellule di osso, come osteoblasti derivate dal midollo o cellule stromali in coltura come monostrato oa ingegnerizzati sistemi modello 3-dimensionale 25-35. Sebbene i modelli di coltura cellulare a 2 dimensioni hanno costituito la colonna portante di in vitro approcci per la ricerca sul cancro, si è da tempo riconosciuto che il comportamento delle cellule è fondamentalmente alterata in monolayer sistemi di coltura 18,36,37. Questo ha portato allo sviluppo di microambienti ingegnerizzati che imitano la complessità dei tessuti viventi 3-dimensionali, compresi da matrice e modelli basati scaffold composti di materiali naturali quali collagene, polimeri sintetici o seminate con specifici tipi cellulari per creare microambienti tessuto-like 36-41. Approcci di ingegneria hanno incluso anche l'uso di piattaforme bioreattore per controllare e studiare il milieu ormonale del microambiente 18,19,41-43. Sebbene i modelli biomimetici e bioreattori forniscono molti elementi di un microambiente tissutale complesso in un ambiente controllato, e sono state applicate con successo per promuovere lo studio delle metastasi del cancro al seno alle ossa 18,19,35,42,43, sistemi modello ingegnerizzati genere non incorporano l'intera gamma di tipi di cellule e componenti della matrice extracellulare presenti all'interno dell'ambiente osso nativo.
Fino a poco tempo, il cancro al senocellule non sono stati studiati nel nativa, intatta, microambiente 3-dimensionale del tessuto osseo umano. Recentemente abbiamo segnalato lo sviluppo di un modello di co-coltura con frammenti di tessuto osseo umano isolato da protesi totale d'anca (THR) Chirurgia campioni 44. Questi esemplari porto sia i comparti mineralizzate e midollo necessarie per studiare i meccanismi alla base di micro-metastasi in coltura breve termine. In lavori precedenti abbiamo stabilito prova di principio per l'utilizzo di bioluminescenza (BLI) per monitorare la proliferazione delle cellule del cancro al seno-luciferasi che esprimono (MDA-MB-231-Fluc) co-coltura con frammenti di ossa 44. Qui vi presentiamo dettagliate protocolli sperimentali per lo studio la proliferazione delle cellule del cancro al seno, la colonizzazione, e la migrazione nel contesto del microambiente nativo utilizzando espianti di tessuto osseo umano.
Innanzitutto vi presentiamo un protocollo per la co-coltura di cellule di cancro al seno adiacenti frammenti ossei per misurare senoproliferazione cellulare utilizzando BLI. In questa sezione, sospensioni di cellule vengono seminate al seno come macchie di cellule in piastre da 6 pozzetti adiacenti frammenti ossei, che sono immobilizzati da pezzi di cera ossea. Pozzetti di controllo contengono cera ossea, ma nessun frammento osseo. Una volta che i punti di cellule attaccano, si aggiunge medio e il piatto è in coltura per 24 ore, dopo di che l'intensità del segnale bioluminescente (associato al numero di cellulare) viene misurata con BLI. Nella fase successiva vi presentiamo i metodi per le cellule del cancro al seno co-coltura seminati direttamente su frammenti di ossa di studiare la colonizzazione e la proliferazione. Qui le sospensioni cellulari seno sono pipettati direttamente sui frammenti di tessuto osseo, che sono monitorati nella cultura da BLI e microscopia a fluorescenza nel tempo per monitorare la colonizzazione e il numero di cellulare. In questo metodo, il vano osseo può essere lavato dai frammenti ossei in qualsiasi punto di tempo per l'analisi di cellule di carcinoma mammario colonizzati mediante citometria di flusso, o saggi di vitalità osseo.
Inoltre, Describa due diversi approcci per misurare la migrazione delle cellule del cancro al seno. Nel primo metodo passaggi vengono descritti per misurare la migrazione verso tessuto osseo supernatanti di coltura. In questo protocollo le cellule tumorali del seno vengono seminate sulle interni, superfici superiori di Transwell inseriscono membrane con un 8 micron dimensione dei pori (come mostrato nella Figura 1A). Gli inserti vengono poi poste in un piatto ricevitore con pozzetti contenenti surnatante tessuto osseo o mezzo di controllo. Nel corso di un periodo di incubazione di 20 ore, un piccolo numero di cellule di carcinoma mammario migrano attraverso le membrane inserto giù nei pozzetti inferiori tessuto coltura dove attaccano alla rivelazione per BLI. Nel secondo metodo di migrazione delle cellule tumorali del seno vengono seminate sulle superfici esterne inferiori delle membrane inserti Transwell. Frammenti di tessuto osseo vengono inseriti nelle tazze di inserimento e le cellule di carcinoma mammario migrano attraverso le membrane a colonizzare i frammenti ossei (come mostrato nella Figura 1B), chevengono poi ripreso con BLI.
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Protocol
Teste femorali sono stati prelevati da pazienti sottoposti a chirurgia elettiva THR presso il Dipartimento di Chirurgia Ortopedica presso la Facoltà di Medicina dell'Università di Stanford. Tutti i tessuti sono stati raccolti come campioni de-identificati conformemente ai regolamenti della ricerca dell'Ufficio Compliance Stanford University.
1. Selezione di un cancro al seno linea cellulare (s)
- Ottenere o trasfettare linea di cellule di cancro al seno desiderata (s) con una luciferasi-GFP giornalista costrutto. I seguenti esperimenti sono stati eseguiti utilizzando il MCF-7 di cancro al seno linee cellulari progettati per l'espressione stabile di luciferasi lucciola (Fluc) e la proteina fluorescente verde (EGFP) MDA-MB-231 e dalla trasfezione con la Bella Addormentata transposon plasmide pKT2 / Lubig e il pK trasposasi plasmide / hUbiC-SB11 45,46.
NOTA: Le linee cellulari transfettate sono indicati come MDA-MB-231-Fluc-EGFP e MCF-7-Fluc-EGFP.
2. Isolare Tissue Fragments da femorali Heads
- Dopo l'intervento chirurgico THR, raccogliere la testa femorale scartato in un contenitore sterile riempito con soluzione salina fisiologica. Trasferire il campione al laboratorio ed elaborare entro 1-3 ore di intervento chirurgico. Nota: se c'è un ritardo nella lavorazione, posizionare il campione a 4 ° C.
- Preparare una zona di lavoro inserendo le seguenti voci su un tappetino assorbente in una cappa coltura tissutale flusso laminare: guanti sterili, rongeur chirurgica, pinze, bicchiere con il 70% di isopropanolo per lavare gli strumenti e recipienti di coltura dei tessuti, come previsto per ogni tipo di esperimento .
- Indossare un guanto chirurgico sterile per tenere la testa del femore rotonda in una mano, utilizzare la rongeur nell'altra mano per estrarre frammenti ossei trabecolari di dimensioni desiderate (~ 2-5 mm) dal albero superiore esposta del femore. Trasferire frammenti ossei nel recipiente di coltura (ad esempio, 6, 12, o 24 pozzetti coltura tissutale o camera di migrazione), a seconda del tipo della proliferazione, colesperimento onization o la migrazione, come descritto nei passaggi da 3, 4 o 5.
NOTA: frammenti di tessuto osseo deve essere raccolto come descritto sopra dopo aver completato i passaggi iniziali per ogni saggio specifico di proliferazione, colonizzazione o migrazione. Frammenti varieranno in dimensioni come mostrato in Figura 2. I frammenti possono essere pesati prima o dopo esperimenti allo scopo di normalizzazione.
3. Co-coltura di cellule tumorali del seno Adiacente a frammenti ossei di Misura seno Cell Proliferation Uso BLI
- Prima dell'esperimento, preparare una sospensione contenente 2 x 10 5 cellule del cancro al seno / 50 microlitri, e preparare i tappi di cera osso per immobilizzare frammenti ossei nella cultura. Tagliare una punta P200 micropipetta in 3 pezzi e utilizzare l'estremità più stretta il più grande pezzo in modo "cookie cutter" per tagliare piccoli (~ 35 mg) pezzi di cera osso. Utilizzare l'estremità larga del pezzo più piccolo per espellere i tappi di cera osso in una capsula di Petriper lo stoccaggio.
- Posizionare un pezzo di cera osso nella posizione delle 12 di ogni bene e premere delicatamente con un indice sterile guantata.
- Pipettare 50 ml di sospensione cellulare contenente 1 x 10 5 cellule di carcinoma mammario in DMEM-10% FBS + Pen-Strep nel centro di ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. (In alternativa, le cellule di semi in un modello di dispersione, se lo si desidera). Posizionare la piastra a 37 ° C di coltura tissutale incubatore per 45 min a promuovere l'adesione delle cellule.
- Mettere frammento osseo 1 su 1 pezzo di cera dell'osso per ogni pozzetto sperimentale e applicare una leggera pressione con il rongeur per fissarlo. Effettuare esperimenti in triplice copia in modo che 3 frammenti ossei di un dato campione THR vengono inseriti nei primi tre pozzi, mentre la parte inferiore tre pozzi contengono cera osso solo come controlli.
- Usando una pipetta da 5 ml, delicatamente e lentamente fornire 5 ml di DMEM-10% FBS al lato di ogni pozzetto per evitare di spostare le cellule del seno o frammenti ossei. Posizionare la piastra a 3776; C tessuto cultura incubatore per 20-24 ore.
- Per eseguire l'imaging bioluminescenza (BLI) rimuovere la piastra dall'incubatore e aggiungere substrato luciferina (per ottenere una concentrazione di 300 mg / ml) per ciascun bene. Immagine del piatto immediatamente su una piattaforma di imaging IVIS utilizzando i seguenti parametri: f-stop di 1, piccolo di categorizzazione, tempo di esposizione di 1 sec, livello D. Misurare l'intensità del segnale di ogni e radianza media (fotoni / secondo / centimetro quadrato / steradiante).
- Utilizzare il software di imaging per definire regioni di interesse (ROI) per quantificare la radianza media per tutti i pozzetti sperimentale e di controllo. Esportare i valori medi di radianza a un foglio Excel per effettuare statistiche e generare grafici.
4. Co-coltura di cellule tumorali del seno seminati direttamente su frammenti ossei allo Studio Colonizzazione e numero di cellulare
- Utilizzare pinze per inserire frammenti ossei direttamente nei pozzetti vuoti di una piastra di coltura tissutale 24 pozzetti (1 frammento / pozzetto).
- Semeette 50 microlitri sospensione cellulare gocciolina di DMEM-10% FBS contenente 1 x 03-06 Ottobre cellule di carcinoma mammario direttamente sulla parte superiore di ciascun frammento osseo. Posizionare la piastra a 37 ° C di tessuto cultura incubatore per 45 min a promuovere l'adesione delle cellule. Aggiungere delicatamente 1-2 ml DMEM-10% FBS nel lato di ciascun pozzetto tale che il frammento è interamente sommerso in terreno. Incubare la piastra a 37 ° C di tessuto cultura incubatore per 20-24 ore.
- Dopo l'incubazione, utilizzare pinze per trasferire ciascun frammento tessuto osseo ad una piastra da 24 pozzetti fresco contenente 1 ml DMEM-10% FBS in ciascun pozzetto. Per eseguire BLI, seguire i passaggi 3,6-3,7 sopra. Inoltre, i frammenti possono essere visualizzati con un microscopio a fluorescenza, o scaricate per ottenere la popolazione osseo per le analisi di numero di cellule di cancro al seno e le proprietà come descritto al punto 6.
- Per preparare i frammenti intatti per la valutazione qualitativa al microscopio a fluorescenza seguente BLI, pipetta 5 ml di soluzione di etichettatura bifosfonati fluorescente (preconfrontato secondo le istruzioni del produttore) in ogni pozzetto per etichettare spicole mineralizzati dei frammenti ossei. Incubare la piastra nel tessuto culturale incubatore per un altro 24 hr.
- Dopo 24 ore di cultura in soluzione di etichettatura bifosfonati fluorescente, utilizzare pinze per trasferire i frammenti di piastre di coltura dei tessuti contenenti fenolo mezzo privo di rosso e vista utilizzando un microscopio a fluorescenza configurato per GFP immagine (485 nm) e l'etichetta bifosfonati (680 nm).
5. Misurare la migrazione delle cellule del cancro al seno a frammenti ossei dei tessuti e colto Bone Fragment surnatante
- La migrazione verso il tessuto osseo cultura surnatante.
NOTA: eseguire esperimenti in triplice copia in modo che 3 frammenti di un dato campione THR sono usati per generare 3 surnatanti. Per ogni esperimento, la migrazione è confrontata su tre pozzetti contenenti surnatanti ossee vs tre pozzetti contenenti mezzo di controllo solo.- Genera tis ossocitare supernatanti inserendo frammenti ossei nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti contenenti 2.2 ml DMEM-10% FBS per pozzetto. Cultura in un 37 ° C di tessuto cultura incubatore per 24 ore. Estrarre il supporto a 24 ore e sostituirlo con 2,2 ml di fresca DMEM-10% FBS. Pozzetti di controllo Trattare contenenti DMEM-10% FBS allo stesso modo.
NOTA: Il terreno è cambiata in 24 ore per rimuovere i fattori secreti in risposta al trauma dei tessuti derivanti da un intervento chirurgico. Perché supernatanti tessuto osseo sono generati in FBS contenenti medie, pozzetti contenenti FBS contenente medio solo sono inclusi per il controllo per i contributi di FBS alla migrazione delle cellule del cancro al seno. - A 48 ore, raccogliere 0,9 ml di ogni surnatante / mezzo di controllo e pipetta nei pozzetti di una piastra ricevente. Gli inserti saranno poi inseriti in questi pozzi. Incubare la piastra ricevente nel tessuto cultura incubatore mentre semina gli inserti. Nota: Il surnatante rimanente (~ 1 ml dopo evaporazione) possono essere raccolti per l'analisi di secretome factors se desiderato 44.
- Per seminare gli inserti Transwell, metterli in uno standard, di 24 e piastra di coltura tissutale vuoto. Pipettare sospensione cellulare 350 microlitri contenente 1 x 10 5 cellule di carcinoma mammario in DMEM-10% FBS sulla superficie della membrana interna superiore di ciascun inserto come illustrato nella Figura 1A. Posizionare la piastra da 24 pozzetti contenenti gli inserti testa di serie nel 37 ° C di coltura tissutale incubatore per 45 minuti per promuovere l'attaccamento.
- Una volta che le cellule hanno attribuito agli inserti, utilizzare pinze per trasferire gli inserti alla piastra ricevitore secondo le istruzioni del produttore. Angolo ogni inserto quando collocandola nel ricevitore bene per evitare la formazione di bolle tra la membrana di inserimento e il ricevitore ben surnatante. Incubare la piastra ricevitore con inserti per 20 ore a 37 ° C di tessuto cultura incubatore.
NOTA: Controllare il lato inferiore della piastra ricevente per bolle tra la membrana inserto e il ricevitore ben supernatant. Se le bolle sono visibili, rimuovere gli inserti specifici e riposizionarli nel ricevitore bene fino a quando non bolle sono presenti. - Dopo 20 ore di uso pinze per rimuovere gli inserti dalla piastra ricevente. Utilizzando le procedure nei passaggi 3,6-3,7 eseguire BLI all'immagine le cellule che hanno migrato in e allegate al fondo dei pozzetti della piastra del ricevitore.
- Genera tis ossocitare supernatanti inserendo frammenti ossei nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti contenenti 2.2 ml DMEM-10% FBS per pozzetto. Cultura in un 37 ° C di tessuto cultura incubatore per 24 ore. Estrarre il supporto a 24 ore e sostituirlo con 2,2 ml di fresca DMEM-10% FBS. Pozzetti di controllo Trattare contenenti DMEM-10% FBS allo stesso modo.
- Migrazione verso frammenti di tessuto osseo.
NOTA: eseguire esperimenti in triplice copia in modo che 3 frammenti di un dato campione THR sono posti in 3 inserti separati, e 3 perle di vetro sono posti in 3 inserti indipendenti come controlli.- Preparare la piastra ricevente pipettando 0,9 ml DMEM-10% FBS in ogni pozzetto. Inserirlo nel tessuto cultura incubatore durante la preparazione gli inserti.
- Per seminare gli inserti, li invertire sulla superficie di una scatola di provetta per microcentrifuga di plastica che ha un coperchio. Pipettare 50 microlitri sospensione cellulare goccia di DMEM-10% FBS contenente 1 x 10 5 cellule del cancro al seno directly esterna sulla superficie inferiore di ciascuna membrana inserto (che è rivolto verso l'alto sugli inserti invertiti). Coprire la scatola tubo microcentrifuga con il coperchio rotto aperto e le trasferisce al 37 ° C incubatore tessuto per 45 min a promuovere l'adesione delle cellule.
- Trasferire la casella tubo microcentrifuga alla cappa coltura tissutale, e utilizzare pinze per girare le teste di serie inserti lato destro e trasferirli nei pozzetti della piastra ricevente. Pipettare 0.450 ml DMEM-10% FBS in ogni tazza di inserimento. Utilizzando pinze, trasferire un frammento di tessuto osseo (~ 3 mm) in ogni tazza inserto preparato. Facoltativamente, utilizzare perle di vetro come controlli negativi in altri pozzi. Porre la piastra in un tessuto cultura incubatore per 20 ore.
- Per misurare la migrazione, preparare un 24-pozzetti di coltura tissutale standard contenente 1 ml di DMEM-10% FBS per pozzetto. Rimuovere la piastra ricevente dall'incubatore e utilizzare pinze per trasferire i frammenti e le perle di osso da ciascun inserto in pozzetti separati della piastra standard. Aggiungi luciferinasubstrato (per ottenere una concentrazione finale di 300 mg / ml) ad ogni pozzetto ed eseguire BLI utilizzando le procedure descritte in passaggi 3.6-3.7.
6. Ulteriori analisi pre e post-sperimentali
- Analisi di midollo arrossato.
- Trasferire un frammento osseo in una cella di filtro 70 micron posto alla sommità di una provetta conica da 50 ml. Utilizzare una siringa da 10 ml con un ago 25 G per irrigare energicamente il frammento con 10 ml di PBS per ottenere una sospensione di cellule di midollo nel tubo conico. Centrifugare la sospensione cellulare per 3 minuti a 300 xg e 21 ° C, aspirare il surnatante e risospendere le cellule pellet in PBS o altra soluzione desiderata per citometria a flusso.
NOTA: volumi di risospensione variano a seconda delle dimensioni del pellet cellulare dopo centrifugazione, e l'applicazione. - Per i saggi di vitalità ~ 75-300 volumi microlitri di PBS sono appropriate, e queste sospensioni possono essere analizzati utilizzando disponibili in commercio fluorescence saggi di vitalità basate secondo le istruzioni del fabbricante, pipettati in un emocitometro convenzionali, e contate con un microscopio a fluorescenza invertito.
- Per l'analisi citometrica di flusso o ordinamento base al rilevamento di cellule di carcinoma mammario GFP-positive, risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS contenente 2% FBS, 2 mM EDTA e 10 mM HEPES tale che la concentrazione è di 1 x 10 6 cellule / ml.
- Trasferire un frammento osseo in una cella di filtro 70 micron posto alla sommità di una provetta conica da 50 ml. Utilizzare una siringa da 10 ml con un ago 25 G per irrigare energicamente il frammento con 10 ml di PBS per ottenere una sospensione di cellule di midollo nel tubo conico. Centrifugare la sospensione cellulare per 3 minuti a 300 xg e 21 ° C, aspirare il surnatante e risospendere le cellule pellet in PBS o altra soluzione desiderata per citometria a flusso.
- H & E colorazione ed immunoistochimica.
- Per elaborare i frammenti di ematossilina e eosina (H & E) colorazione e / o immunoistochimica, posizionare i frammenti in cassette di plastica etichettati con una matita numero 2, e immergere in un contenitore riempito con il 10% formalina per 24 ore.
- Tessuti di processo per paraffina, sezionamento e colorazione utilizzando protocolli di routine che includono una fase di decalcificazione per spiegare le spicole mineralizzate all'interno di ogni frammento.
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Representative Results
Isolare frammenti di tessuto da femorali Heads
Teste femorali sono stati raccolti da un numero uguale di pazienti di sesso femminile (44-90 anni di età) sottoposti a chirurgia elettiva di sostituzione totale dell'anca presso il Dipartimento di Chirurgia Ortopedica presso la Facoltà di Medicina dell'Università di Stanford maschile e. Ogni testa femorale scartato contiene una piccola porzione del femore, che porti tessuto osseo trabecolare composto spicole mineralizzati e osseo. Questo tessuto è accessibile attraverso la sezione trasversale chirurgicamente esposta dell'albero (Figura 2A) utilizzando un rongeur chirurgica per estrarre piccoli frammenti. L'istologia dei pezzi estratti è mostrato in Figura 2B, rivelando i componenti mineralizzati e osseo. L'aspetto dei pezzi estratti varia teste femorali ottenuti da pazienti diversi, che vanno dal giallo al rosso, a seconda del contenuto adipociti del midollo come mostrato nella Figura 2C. We dimostrare l'uso di questi frammenti di tessuto osseo in saggi a breve termine per misurare le interazioni dinamiche con le cellule del cancro al seno ingegnerizzate per luciferasi e di espressione EGFP.
Co-coltura di cellule del cancro al seno accanto a frammenti ossei di Misura seno Cell Proliferation usando Bioluminescence Imaging
La configurazione piastra di coltura per la MDA-MB-231-Fluc-EGFP cellule di carcinoma mammario co-coltura adiacenti a frammenti ossei immobilizzati per misurare la proliferazione delle cellule del seno con BLI è mostrato nella Figura 3A. BLI della piastra a 24 ore è illustrato in Figura 3B, e il segnale BLI da 3 esperimenti, dimostrando proliferazione cellulare maggiore in presenza vs. assenza di frammenti ossei viene mostrato nella Figura 3C.
Cellule di carcinoma mammario co-coltura seminati direttamente su frammenti ossei allo Studio Colonizzazione e numero di cellulare
Colonizzazione di MCF-7-Fluc-EGFP cells seminate direttamente su frammenti di tessuto osseo misurata tramite BLI a 24 ore è illustrato nella figura 4A, dimostrando segnale associato minor densità di semina è diminuita. Un frammento direttamente testa di serie è indicato a 48 ore in figura 4B, dopo l'etichettatura con il reagente fluorescente biphosophonate, come ripreso al microscopio a fluorescenza a rivelare la colonizzazione delle cellule del cancro al seno entro i compartimenti mineralizzate e osseo. Questi modelli di colonizzazione sono anche rivelati in frammenti direttamente teste di serie elaborate post-sperimentale per la colorazione immunoistochimica con anticorpi citocheratina (figure 4C e 4D).
Misurare la migrazione delle cellule del cancro al seno a frammenti ossei dei tessuti e colto Bone Fragment surnatante
La migrazione delle cellule MDA-231-Fluc-EGFP attraverso le membrane porose di migrazione verso tessuto osseo sovranatanti e in frammenti di ossa viene rilevata con BLI come mostrato nella Figura 5. Un modello robusto migrazione verso surnatanti ottenuti da tre frammenti di un dato THR esemplare è mostrato in Figura 5A, che raffigura aumentata migrazione nei pozzetti contenenti tessuto osseo supernatante vs. mezzo di controllo. Anche se non tutti i modelli di migrazione sono questo robusto, la migrazione verso surnatanti osso è in genere superiore verso terreno di controllo in maggior parte degli esperimenti. Un tipico modello migratorio in frammenti ossei da un dato THR esemplare è mostrato nella Figura 5B.
Analisi di Lavata zucchine
Inoltre, facciamo vedere che le cellule del midollo possono essere immessi da frammenti colonizzati, e che le cellule del cancro al seno arrossato può essere rilevato tra queste cellule mediante citometria di flusso (Figura 6B), BLI (Figura 6C), e / o di microscopia a fluorescenza (Figura 6D) .
Viabilità di misura
Figura 1: Impostazione di esperimenti di migrazione. (A) In esperimenti di "migrazione" in avanti, i pozzetti della piastra ricevente sono pieni generati precedentemente tessuto osseo sovranatanti. Cellule tumorali della mammella che sono seminate sulle interni, superfici superiori delle membrane Transwell in tazze inserto contenenti DME-10% FBS migrano attraverso le membrane e si attaccano al fondo dei pozzetti per il rilevamento da BLI. 
Figura 2: Isolamento frammenti di tessuto dalle teste femorali. (A) Estrazione frammenti di osso trabecolare con un rongeur chirurgica. (B) Istologia del frammento fissato immediatamente dopo l'estrazione dal tessuto femore mostrando mineralizzato (freccia bianca) e osseo (freccia nera) scompartimenti. Frammenti ossei (C) trabecolare estratti da due diversi teste femorali dimostrano variazione rosso vs. contenuto midollo giallo. 
Figura 3: le cellule del cancro al seno co-coltura adiacenti a frammenti ossei per misurare la proliferazione delle cellule del seno con l'imaging bioluminescenza. (A) La cultura di installazione Piastra di MDA-MB-231-Fluc-EGFP cellule co-coltura di cancro al seno adiacenti frammenti ossei immobilizzati, come indicato dalle frecce: macchie di cellule (blu), cera osso (nero), e frammento osseo (rosso ). La posizione della cera ossea è anche osservato da un cerchio nero tratteggiata. La piastra è mostrato prima aggiunta del mezzo. I primi 3 pozzi contengono frammenti ossei impastoiati a cera ossa e le ultime tre pozzi contengono solo cera ossea. (B) BLI della piastra a 24 ore. (C) Quantificazione dei segnali BLI per le cellule MDA-MB-231-Fluc-EGFP cresce in presenza (barre viola) vs. assenza (barre verdi) Di frammenti da tre THR campioni coltivate come descritto. Per ogni campione THR, barre rappresentano i valori medi misurati BLI in 3-frammento contenente - pozzetti di controllo 3 contro. Questo risultato dimostra livelli elevati di proliferazione in presenza vs. assenza di frammenti ossei. Barre di errore rappresentano l'errore standard (p <0.01). Riprodotto con il permesso 44. 
Figura 4: Rilevamento delle cellule del cancro al seno seminate direttamente su frammenti ossei. (A) La colonizzazione delle cellule MCF-7-Fluc-EGFP seminati direttamente su frammenti di tessuto osseo, come rilevato da BLI a 24 ore, mostrando segnale associato calo densità di semina è diminuita. (B) frammento Direttamente testa di serie a 48 ore dopo la semina, e etichettatura postale 24 ore con il reagente fluorescente biphosophonate. Microscopia a fluorescenza rivela cellule EGFP + cancro al senociato con un spicule mineralizzata (freccia verde), e con le cellule adipose nel comparto osseo (frecce bianche). Questi modelli di colonizzazione sono anche rivelati in frammenti direttamente teste di serie preparate per la colorazione immunoistochimica con un pan-citocheratina anticorpi AE1 / AE3 dopo 72 ore di co-coltura (C) e (D). In (C) citocheratina-positivo cellule del cancro al seno, indicati dalle frecce, si osservano adiacente adipociti nel vano osseo. In (D) una cellula di cancro al seno citocheratina-positivo si osserva collegato a un spicule mineralizzata. (C) e (D) riprodotte con il permesso 44. 
Figura 5:. Misurare la migrazione delle cellule del cancro al seno di frammenti di tessuto osseo e coltivate surnatanti frammento osseo migrazione di MDA-MB-231cellule -fLuc-EGFP attraverso le membrane porose di migrazione verso tessuto osseo sovranatanti e in frammenti di ossa come rilevato in 24 ore con BLI. (A) segnale BLI rivelando una maggiore migrazione verso sovranatanti derivati da un dato THR esemplare vs. mezzo di controllo. (B ) Segnale BLI dimostrando modello migrazione delle cellule del cancro al seno in 3 frammenti di ossa di un singolo campione THR. Frammenti di tessuto osseo sono indicati da cerchi bianchi punteggiati. Pozzetti di controllo che contengono perle di vetro sono indicati sul fondo. 
Figura 6:.. Rilevamento di cellule MDA-MB-231fLUC-EGFP a zucchine arrossate da frammenti colonizzati (A) Frammenti senza (a sinistra) e con (a destra) colonizzato le cellule di cancro al seno, come rilevato da BLI (B) Analisi di zucchine arrossato da frammenti (A) di fbassa citometria. Cellule di carcinoma mammario EGFP-positivi sono stati rilevati nel midollo lavata dal frammento BLI-positivi, ma non il frammento BLI-negativi. (C) BLI rilevamento di colonie di cellule di cancro al seno risultanti dalla coltura di midollo lavata da un frammento BLI-positive. (D) microscopia a fluorescenza del vano osseo lavata da un frammento BLI-positivi, mostrando cellule MDA-MB-231fLUC-EFGP in un campo di cellule del midollo. 
Figura 7:. Redditività misura Viabilità per le cellule del midollo arrossate da frammenti di tessuto isolati dal 4 THR campioni immediatamente dopo la raccolta e al 24, 48, 72 ore, e 6 giorni di cultura in DMEM-10% FBS. Media è stato cambiato a 24 e 72 ore.
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Discussion
Mehra et al. Hanno descritto in precedenza la raccolta e l'analisi di campioni ossei postmortem di pazienti affetti da carcinoma prostatico metastatico raccolte al momento dell'autopsia, rivelando i tessuti di alta qualità e per validare l'uso di campioni di ossa umane per studiare il processo metastatico 47. Qui abbiamo descritto i protocolli per la raccolta, l'elaborazione e l'utilizzo di frammenti di tessuto osseo umano ottenuti da teste femorali scartati dopo l'intervento THR in un sistema di co-coltura di breve termine per studiare la migrazione delle cellule della mammella, la colonizzazione e la proliferazione. Circa 300.000 interventi chirurgici di sostituzione dell'anca vengono eseguiti ogni anno negli Stati Uniti (American Academy of Orthopaedic Surgeons, Orthoinfo.aaos.org), e questi campioni sono tipicamente scartati. Una delle indicazioni più frequenti per questo intervento è l'artrosi dell'articolazione dell'anca, con conseguente ripartizione graduale delle superfici cartilaginee che copre la testa del femore, che si traduce in dolore articolare. Durante totale replacem ancachirurgia ent una piccola porzione del femore superiore viene rimosso insieme con la testa femorale. Il femore è un luogo comune di cancro al seno metastasi 48, e questi campioni contengono tessuto osseo trabecolare, il luogo di colonizzazione delle cellule della mammella metastatico. La maggior parte dei pazienti che si sottopongono a protesi d'anca sono 50-80 anni, una fascia d'età che parentesi gli anni di picco di incidenza del cancro al seno. Così, questi tessuti costituiscono una risorsa preziosa per lo studio del cancro della mammella metastatico dell'osso nicchia.
Ci sono diversi passaggi critici e considerazioni associati con queste tecniche. In primo luogo, una ronguer chirurgica di buona qualità è essenziale per l'estrazione dei piccoli frammenti dell'osso trabecolare tenendo la testa del femore in, mano guantata di fronte. Pinze non funzionano perché non sono abbastanza robusti per estrarre il tessuto trabecolare contenente spicole mineralizzati. Un'altra considerazione importante in questi test riguarda la movimentazione linea cellulare del seno e passaging, particolarmente per quanto riguarda i saggi di migrazione. Passaggio a lungo termine e / o la variabilità nelle procedure tripsinizzazione può portare alla selezione sequenziale di più popolazioni di cellule meno tenaci /, potenzialmente alterare le risposte migratorie negli esperimenti. Un'altra questione riguarda la standardizzazione degli esperimenti, data la variabilità dei tessuti chirurgici ottenuti da pazienti di diversa età e stati di malattia. Per far fronte a questo, ci avvaliamo di un disegno sperimentale intra-soggetto, in cui tutte le variabili sono testati in triplice copia (ad esempio, in tre frammenti / pozzi sperimentali vs tre pozzi frammenti / controllo) utilizzando frammenti dal pezzo operatorio di un determinato paziente. Le variabili possono essere testati utilizzando questo design su campioni di più pazienti, e analizzati per la significatività statistica utilizzando il test t accoppiato per i dati mediati su replicati, e / o entro soggetti ANOVA per dati su replicati. E, infine, una limitazione principale di questo metodo è il breve lasso di viability durante Espianto.
Le nostre misurazioni hanno rivelato Viabilità osseo di ~ 90% il giorno della raccolta, in linea con le misure della vitalità ottenuti da aspirati midollari 49. Nel corso del tempo, però, abbiamo osservato un graduale calo nei giorni due e tre, con drammatica perdita di vitalità di giorno 6. Anche se non abbiamo misurato la vitalità del comparto mineralizzata, osservazioni qualitative suggeriscono che c'è un calo simile nella vitalità di osteoblasti osso-rivestimento e osteociti, come si vede in figura 4D. Sulla base di questi esperimenti, abbiamo limitato i nostri esperimenti di coltura di studi a breve termine condotti su 48 o 72 ore. Esperimenti preliminari (non incluso) hanno indicato che la redditività può essere migliorata utilizzando disponibili in commercio supporti formulato per sostenere le cellule del midollo. Tuttavia non abbiamo caratterizzato le popolazioni di cellule del midollo in questi esperimenti, e non so se i migliori risultati di redditività dal selezionatoconseguenza di alcune sottopopolazioni di cellule di midollo. Lo sviluppo di protocolli per sostenere ed estendere la vitalità di questi espianti sarà importante portare avanti questo sistema modello.
Anche se questo modello è limitata a brevi periodi di tempo, i suoi principali vantaggi rispetto ad altri metodi includono le seguenti caratteristiche: 1) intatti i tessuti in 3 dimensioni che ospitano tipi di cellule rilevanti che costituiscono il microambiente osseo umano, 2) l'accessibilità per il microambiente del midollo per il monitoraggio e interazioni dinamiche perturbanti, 3) un alto numero di frammenti per campioni per esperimenti replicati, e 4) a basso costo rispetto ai modelli animali.
Mentre abbiamo descritto saggi per studiare il cancro al seno metastasi ossea, questi campioni e approcci possono essere facilmente estesi allo studio di altre neoplasie ossee cerca come il cancro alla prostata, così come altre patologie ossee. Anche se abbiamo utilizzato le teste femorali scartati principalmente come cosìpubblico Fonte di frammenti di tessuto, questi campioni costituiscono anche una fonte supplementare di midollo osseo umano, che è tradizionalmente raccolte tramite aspirazione del midollo osseo da giovani volontari. Infine, mentre abbiamo descritto approcci utilizzando linee cellulari ingegnerizzate per bioluminescenza e fluorescenza, la maggior parte delle procedure possono essere modificate per l'uso con altre cellule se queste linee cellulari e / o piattaforme di imaging non sono disponibili.
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Acknowledgments
Questi studi sono stati finanziati, in parte, da finanziamenti della ricerca e sviluppo della Fondazione alternativa (107.588), l'Istituto Nazionale della Salute (1U54CA136465-04S1), e la California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Ringraziamo Drs. Andrew Wilber e R. Scott McIvor per la generosa donazione di loro
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
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