Summary
Protocollen worden beschreven voor het bestuderen van borstkanker celmigratie, proliferatie en kolonisatie in een menselijk botweefsel explantaatmodel systeem.
Abstract
Bot is de meest voorkomende plaats van borstkankermetastasen. Hoewel het algemeen aanvaard dat de micro-invloeden kankercel gedrag, is er weinig bekend over borstkanker cel eigenschappen en gedragingen binnen de inheemse micro-omgeving van de menselijke botweefsel. We hebben benaderingen op te sporen, te kwantificeren en te moduleren menselijke borstkankercellen in de micro-omgeving van de ontwikkelde gekweekte menselijke botweefsel fragmenten geïsoleerd uit afgedankte femurkoppen na een totale heupprothese chirurgie. Met borstkankercellen ontworpen voor luciferase en versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) expressie, kunnen wij reproduceerbaar kwantificeren migratie en proliferatie patronen met bioluminescentie (BLI), spoor cel interacties binnen de botfragmenten middels fluorescentiemicroscopie en evalueren borstcellen na kolonisatie met flowcytometrie. De belangrijkste voordelen van dit model zijn: 1) een native, architectonisch intact weefsel microenvironment dat relevante menselijke celtypes omvat, en 2) een directe toegang tot de micro-omgeving, die een snelle kwantitatieve en kwalitatieve monitoring en verstoring van de borst en been cel eigenschappen, gedragingen en interacties vergemakkelijkt. Een belangrijkste beperking op dit moment is de eindige levensvatbaarheid van het weefsel fragmenten, die het raam van onderzoek op korte termijn cultuur beperkt. Toepassingen van het modelsysteem omvatten bestuderen de fundamentele biologie van borstkanker en andere bot-zoekende maligniteiten in de metastatische niche en ontwikkeling van therapeutische strategieën om gerichter borstkankercellen in botweefsel.
Introduction
De tumor micro-omgeving wordt algemeen erkend als een kritische determinant van kankercel gedrag tijdens borstkanker progressie en metastatische verspreiden 1-3. Het doel van de hier voorgestelde methode is het bestuderen van borstkankercellen in het micromilieu van menselijk botweefsel, de meest voorkomende plaats van borstkankermetastasen 4-6 vergemakkelijken. Bot bestaat uit gemineraliseerd en merg compartimenten 7-9, beide haven cellen en uitgescheiden factoren betrokken bij metastatische progressie 10,11. Hoewel veel gebruikt in vivo muismodellen te vergemakkelijken systemische studies van het metastatische proces 12-15, cel interacties binnen het skelet zijn niet gemakkelijk toegankelijk voor observatie en directe verstoring. Modelsystemen voor het bestuderen van en het kweken van de muis bot weefsels en muis beenmerg cellen zorgen voor een betere toegang en hebben veel inzichten met betrekking tot overspraak en mechanismen die ten grondslag liggen aan borstkanker cel m opgeleverdetastasis van de muizen skelet 16-22. Studies hebben echter gesuggereerd dat er mogelijk species-specifieke patronen van osteotropism voor botweefsel 23,24. Deze patronen kunnen inherent species-specifieke verschillen in botweefsel eigenschappen, die voortvloeien uit veranderde beenmerg populaties in immuun-deficiënte muizen 11 en / of de relatief jonge leeftijd van muizen die voor experimenten, die waarschijnlijk determinanten van het bot weergeeft micro-omgeving.
In vitro technieken voor het bestuderen van borstkankercellen in menselijk bot coculturen zijn doorgaans gericht op specifieke been celtypes zoals beenmerg afgeleide osteoblasten en stromale cellen gekweekt als monolagen of binnen gemanipuleerde 3-dimensionaal modelsystemen 25-35. Hoewel 2-dimensionele celkweekmodellen de steunpilaar van in vitro gevormd benaderingen voor kankeronderzoek is het al lang erkend dat celgedrag fundamenteel veranderd in monolayer kweeksystemen 18,36,37. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van gemanipuleerde micro-omgevingen die de complexiteit van 3-dimensionale levende weefsels, zoals matrix- en steiger gebaseerde modellen uit natuurlijke materialen zoals collageen nabootsen, of synthetische polymeren geënt met specifieke celtypen te weefselachtige microenvironments creëren 36-41. Gemanipuleerde benaderingen hebben ook het gebruik van de bioreactor platforms te controleren en de studie van de hormonale milieu van de micro-omgeving 18,19,41-43. Hoewel biomimetische modellen en bioreactoren bieden veel elementen van een complex weefsel micro-omgeving in een gecontroleerde omgeving, en zijn met succes toegepast op de studie van de uitzaaiing van borstkanker aan het bot 18,19,35,42,43 vooruit, denk engineered modelsystemen in het algemeen niet op te nemen het volledige spectrum van celtypen en extracellulaire matrix componenten aanwezig in het natuurlijk bot milieu.
Tot voor kort, borstkankercellen werden niet bestudeerd in het natieve, intacte, 3-dimensionale micromilieu van menselijke botweefsel. We hebben onlangs meldde de ontwikkeling van een co-cultuur model met behulp van menselijk bot weefselfragmenten geïsoleerd van de totale heupprothese (THR) chirurgie exemplaren 44. Deze exemplaren haven zowel de gemineraliseerde en merg compartimenten die nodig zijn om mechanismen die ten grondslag liggen micro-uitzaaiingen in korte termijn cultuur te bestuderen. In eerdere werk gevestigde we proof-of-principle voor het gebruik van bioluminescentie beeldvorming (BLI) om de proliferatie van luciferase uiten borstkankercellen (MDA-MB-231-Fluc) samen gekweekt met botfragmenten 44 monitoren. Hier presenteren we gedetailleerde experimentele protocollen voor het bestuderen borstcel kanker proliferatie, kolonisatie en migratie binnen het kader van de natieve micro met menselijk bot weefsel explantaten.
Eerst presenteren we een protocol voor co-kweken borstkankercellen grenzend aan botfragmenten om borstvoeding te metencelproliferatie behulp van BLI. In dit hoofdstuk worden borst celsuspensies geënt cel- spots in 6-well platen naast botfragmenten, die worden geïmmobiliseerd door botstukken was. Controle putjes bevatten bot was, maar geen bot fragment. Zodra cel spots te bevestigen, wordt medium toegevoegd en de plaat gekweekt gedurende 24 uur, waarna bioluminescente signaalintensiteit (geassocieerd met het aantal cellen) wordt gemeten BLI. In de volgende stap stellen we methode voor co kweken borstkankercellen direct gezaaid op botfragmenten kolonisatie en proliferatie bestuderen. Hier de borst celsuspensies worden direct gepipetteerd op het botweefsel fragmenten die in kweek worden bewaakt door BLI en fluorescentiemicroscopie tijd kolonisatie en aantal cellen te volgen. In deze werkwijze kan het beenmerg compartiment gespoeld uit de botfragmenten op elk tijdstip voor analyse gekoloniseerde borstkankercellen door flowcytometrie of merg levensvatbaarheid assays.
Daarnaast hebben we Dèschriftgeleerde twee verschillende benaderingen voor het meten van borstkanker cel migratie. In de eerste werkwijze stappen beschreven voor het meten migratie naar botweefsel kweeksupernatanten. In dit protocol borstkanker cellen worden gezaaid op de binnenste bovenvlakken van Transwell voegen membranen met 8 urn poriegrootte (zie figuur 1A). De inserts worden vervolgens geplaatst in een ontvanger plaat met putjes die botweefsel supernatant of controle medium. In de loop van 20 uur incubatieperiode kleine aantallen borstkankercellen migreren door het inzetstuk membranen naar het onderste weefsel kweekputjes wanneer zij hechten voor detectie door BLI. In de tweede migratiemethode borstkanker cellen worden gezaaid op de onderste buitenoppervlakken van Transwell insert membranen. Botweefsel fragmenten worden in de inzetkommen geplaatst en borstkankercellen migreren door de membranen om de botfragmenten koloniseren (zie figuur 1B), dieVervolgens worden afgebeeld met behulp BLI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Femurkoppen werden verzameld van patiënten die een electieve THR chirurgie in de afdeling orthopedische chirurgie aan de Stanford University School of Medicine. Alle weefsels werden verzameld als-de aangewezen exemplaren in overeenstemming met de voorschriften van de Stanford University Research Compliance Office.
1. Het selecteren van een cel Borstkanker Line (s)
- Verkrijgen of transfecteren de gewenste borstkanker cellijn (s) met een luciferase-GFP reporterconstruct. De volgende experimenten werden uitgevoerd met behulp van MDA-MB-231 en MCF-7 borstkanker cellijnen gemanipuleerd voor de stabiele expressie van vuurvlieg luciferase (Fluc) en versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) door transfectie met Doornroosje transposon plasmide pKT2 / Lubig en de transposase plasmide pK / hUbiC-SB11 45,46.
OPMERKING: De getransfecteerde cellijnen worden aangeduid als MDA-MB-231-fluctuaties-EGFP en MCF-7-fluctuaties-EGFP.
2. Isoleren Tissue Fragments uit femurkoppen
- Volgende THR chirurgie, het verzamelen van de afgedankte heupkop in een steriele container gevuld met fysiologische zoutoplossing. Het analysemonster overbrengen in het laboratorium en verwerken binnen 1-3 uur van de operatie. Opmerking: als er een vertraging in de verwerking, plaatst het monster bij 4 ° C.
- Bereid een werkgebied door het plaatsen van de volgende items op een absorberende mat in een laminaire stroming weefselkweek kap: steriele handschoenen, chirurgische rongeur, forceps, bekerglas met 70% isopropanol instrumenten en weefselkweekvaten spoel zoals hieronder aangegeven voor elk type experiment .
- Het dragen van een steriele chirurgische handschoen de ronde femurkop in één hand, gebruik rongeur in de andere hand trabeculair bot fragmenten van gewenste grootte (~ 2,5 mm) vanaf het blootgestelde bovenste schacht van de femur extraheren. Overdracht botfragmenten in het kweekvat (bijvoorbeeld 6-, 12- of 24-well weefselkweek plaat of migratie kamer), afhankelijk van het type van proliferatie, colonization of migratie-experiment, zoals beschreven in stappen 3, 4 of 5.
OPMERKING: Botweefsel fragmenten moeten worden geoogst zoals hierboven beschreven na het voltooien van de eerste stappen voor elke specifieke proliferatie, kolonisatie of migratie assay. Fragmenten variëren in grootte zoals weergegeven in figuur 2. Fragmenten kunnen worden gewogen vóór of na experimenten met het oog op standaardisatie.
3. Co-kweken van borstkankercellen Aangrenzend aan botfragmenten te Breast celproliferatie te meten met behulp van BLI
- Voorafgaand aan het experiment bereiden van een suspensie met 2 x 10 5 borstkankercellen / 50 ul en pluggen been wax bereiden immobiliseren botfragmenten in kweek. Snijd een P200 micropipet tip in 3 stukken en gebruik het smalle uiteinde van het grootste stuk in een "cookie cutter" manier om kleine (~ 35 mg) stukjes bot was te snijden. Met het brede uiteinde van de kleinste naar de bot was uitgeworpen pluggen in een petrischaalvoor opslag.
- Leg een stukje bot was op de 12 uur positie van elk putje en druk voorzichtig naar beneden met een steriel-gehandschoende wijsvinger.
- Pipetteer 50 ul celsuspensie met 1 x 10 5 borstkankercellen in DMEM-10% FBS + Pen-Strep in het midden van elk putje van een 6-wells plaat. (Als alternatief zaad cellen in een verspreide patroon indien gewenst.) Plaats de plaat in een 37 ° C weefselkweek incubator voor 45 min naar cel gehechtheid te bevorderen.
- Leg 1 stukje bot op 1 stukje bot wax voor elke experimentele goed en zachte druk uit te oefenen met de rongeur om het te beveiligen. Voeren experimenten in drievoud zodanig dat 3 botfragmenten uit een gegeven THR monster worden in de top drie putten geplaatst, terwijl de onderste drie putjes bevatten bot was alleen als controles.
- Pipetteer 5 ml, voorzichtig en langzaam afleveren 5 ml DMEM-10% FBS aan de zijkant van elk putje te vermijden loskomen de borstcellen of botfragmenten. Plaats de plaat in een 3776; C weefselkweek incubator gedurende 20-24 uur.
- Om bioluminescentie beeldvorming te voeren (BLI) verwijder de plaat uit de incubator en voeg luciferin substraat (tot een concentratie van 300 ug / ml te bereiken) aan elk putje. De plaat onmiddellijk op een IVIS Imaging Platform met de volgende parameters: f-stop van 1, kleine binning, belichtingstijd van 1 sec, niveau D. Meet het signaal intensiteit van elke evenals de gemiddelde straling (fotonen / seconde / vierkante centimeter / steradiaal).
- Gebruik imaging software om Regions of Interest (ROI) te definiëren aan de gemiddelde straling te kwantificeren voor alle experimentele en controle putten. Export gemiddelde uitstraling waarden naar een Excel sheet om statistieken uit te voeren en het genereren van grafieken.
4. Co-kweken van borstkankercellen Direct gezaaid op botfragmenten te studeren Kolonisatie en Cell Aantal
- Gebruik een tang om botfragmenten direct te plaatsen in de lege putjes van een 24-well weefselkweek plaat (1 fragment / putje).
- PipEtte 50 pi celsuspensie druppel DMEM-10% FBS bevattende 1 x 3-06 oktober borstkankercellen direct op elkaar botfragmenten. Plaats de plaat in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 45 minuten om celhechting bevorderen. Voeg voorzichtig 1-2 ml DMEM-10% FBS in de zijkant van elk putje zodat het fragment volledig wordt ondergedompeld in medium. Incubeer de plaat in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 20-24 uur.
- Na incubatie tang om elk botweefsel fragment naar een verse plaat met 24 putjes bevattende 1 ml DMEM-10% FBS aan elk putje. Om BLI voeren, volgt u de stappen 3.6-3.7 hierboven. Bovendien kunnen fragmenten worden bekeken met een fluorescentiemicroscoop of weggespoeld het merg populatie analyses van borstkanker celaantallen en eigenschappen te verkrijgen zoals beschreven in stap 6.
- Om de intacte fragmenten voor kwalitatieve evaluatie voor te bereiden met behulp van fluorescentie microscopie volgende BLI, pipet 5 ul van fluorescerende bisfosfonaat labelingoplossing (prevergeleken volgens de instructies van de fabrikant) in elk putje om de gemineraliseerde spicules van de botfragmenten label. Incubeer de plaat in de weefselkweek incubator eens 24 uur.
- Na 24 uur van de cultuur in fluorescerende bisfosfonaat etikettering oplossing, een tang om de fragmenten te dragen aan weefselkweek platen met fenol rood-vrij medium en bekijken met behulp van een fluorescentie microscoop geconfigureerd om het GFP (485 nm) en bisfosfonaat label (680 nm).
5. Het meten van Migratie van borstkankercellen te botweefsel Fragmenten en Gekweekte Bone Fragment Supematanten
- Migratie naar botweefsel kweeksupernatans.
Opmerking: Voer experimenten in drievoud zodat 3 fragmenten uit een bepaalde THR monster worden gebruikt om 3 supernatanten genereren. Voor elk experiment wordt migratie vergeleken in drie putjes bevattende supernatanten bot versus drie putjes die slechts medium controle.- Genereren bot tissue supernatanten door het plaatsen botfragmenten in de putjes van een 12-wells plaat met 2,2 ml DMEM-10% FBS per putje. Cultuur in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 24 uur. Trek het medium bij 24 uur en te vervangen door 2,2 ml vers DMEM-10% FBS. Behandel controleputjes DMEM-10% FBS dezelfde manier.
OPMERKING: Het medium wordt veranderd 24 uur factoren afgescheiden in respons op weefseltrauma gevolg van een operatie verwijderen. Omdat botweefsel supernatanten worden gegenereerd in FBS-bevattend medium, wells die FBS-bevattend medium uitsluitend zijn opgenomen om te controleren voor de bijdragen van FBS borstkanker celmigratie. - Na 48 uur, verzamel 0,9 ml van elk supernatant / stuurmedium en pipet in de putjes van een plaat ontvanger. De inserts zullen later in deze putten worden geplaatst. Incubeer de ontvanger plaat in de weefselcultuurincubator terwijl zaaien de inserts. Opmerking: De resterende supernatant (~ 1 ml na verdamping) kunnen worden voor analyse van secretoom factors desgewenst 44.
- Om de Transwell inserts zaad, plaats ze in een standaard, lege 24-well weefselkweek plaat. Pipetteer 350 ul celsuspensie met 1 x 10 5 borstkankercellen in DMEM-10% FBS op de bovenste, binnenste membraan oppervlak van elk inzetstuk zoals weergegeven in figuur 1A. Plaats de 24-wells plaat met de geënte inserts in de 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 45 min hechting bevorderen.
- Zodra de cellen inzetstukken hebben gehecht, een tang om de inserts dragen aan de ontvanger plaat volgens de instructies van de fabrikant. Hoek elke insert bij het plaatsen van het in de ontvanger goed op de vorming van luchtbellen tussen de insert membraan en de ontvanger goed supernatant te voorkomen. Incubeer de ontvanger plaat met inzetstukken 20 uur in een 37 ° C weefselkweek incubator.
OPMERKING: Controleer de onderkant van de ontvanger plaat voor luchtbellen tussen de insert membraan en de ontvanger goed supernatant. Als er bellen zichtbaar zijn, verwijder de specifieke inserts en plaats ze opnieuw in de ontvanger goed totdat er geen luchtbellen aanwezig zijn. - Na 20 uur gebruik een tang om de inserts van de ontvanger plaat te verwijderen. De procedures in stappen 3.6-3.7 voeren BLI beeld cellen die zijn gemigreerd naar en aan de onderzijde van de ontvanger putjes.
- Genereren bot tissue supernatanten door het plaatsen botfragmenten in de putjes van een 12-wells plaat met 2,2 ml DMEM-10% FBS per putje. Cultuur in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 24 uur. Trek het medium bij 24 uur en te vervangen door 2,2 ml vers DMEM-10% FBS. Behandel controleputjes DMEM-10% FBS dezelfde manier.
- Migratie naar botweefsel fragmenten.
OPMERKING: Voer experimenten in drievoud zodanig dat 3 fragmenten uit een bepaalde THR monster worden geplaatst in 3 afzonderlijke inserts, en 3 glazen kralen worden in 3 aparte inserts als controle geplaatst.- Bereid de ontvanger plaat door pipetteren 0,9 ml DMEM-10% FBS in elk putje. Plaats deze in de weefselkweek incubator, terwijl de voorbereiding van de inserts.
- Om de inzetstukken zaad, keer ze op het oppervlak van een kunststof microcentrifugebuis doos die een deksel heeft. Pipetteer 50 ul celsuspensie druppel DMEM-10% FBS bevattende 1 x 10 5 borstkankercellen directly op het buitenste ondervlak van elke insert membraan (die naar boven in de omgekeerde inserts). Bedek de microcentrifugebuis doos met deksel opengebroken en overgebracht naar de 37 ° C incubator weefsel gedurende 45 min celhechting bevorderen.
- Breng de doos microfugebuis aan de weefselkweek kap, en een tang om de geplaatste inserts rechtsaf omhoog en zet ze in de putjes van de ontvanger plaat. Pipet 0,450 ml DMEM-10% FBS in elk inzetkom. Met behulp van een tang, transfer één botweefsel fragment (~ 3 mm) in elk bereid inzetkom. Eventueel gebruikt glasparels als negatieve controles extra putjes. Plaats de plaat in een weefselkweek incubator voor 20 uur.
- Om migratie te meten, bereiden een standaard 24-well weefselkweek plaat met 1 ml DMEM-10% FBS per putje. Verwijder de ontvanger plaat uit de incubator tang om de botfragmenten en kralen overdracht van elkaar voegen in afzonderlijke putjes van de standaardplaat. Luciferin toevoegensubstraat elk (tot een eindconcentratie van 300 ug / ml te bereiken) en goed presteren BLI volgens de procedures in stappen 3.6-3.7.
6. Extra pre- en post-experimentele Analyses
- Analyse van gespoeld merg.
- Breng een botfragment in een 70 um cel zeef bovenaan een 50 ml conische buis. Gebruik een 10 ml spuit met een 25 G naald krachtig spoelen fragment met 10 ml PBS aan een suspensie van mergcellen verkrijgen in de conische buis. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 3 minuten bij 300 g en 21 ° C, zuig de supernatant en resuspendeer de gepelleteerde cellen in PBS of andere gewenste oplossing voor flowcytometrie.
OPMERKING: resuspenderende hoeveelheden afhankelijk van de grootte van de cel pellet na centrifugatie, en toepassing. - Voor levensvatbaarheid testen ~ 75-300 ul volumes PBS geschikt zijn, en deze suspensies kunnen worden geanalyseerd met behulp van in de handel verkrijgbare fluorescence gebaseerde levensvatbaarheid assays volgens de instructies van de fabrikant, gepipetteerd in een conventionele hemocytometer en geteld met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
- Voor flowcytometrische analyse en sortering op basis van detectie van GFP-positieve borstkankercellen, resuspendeer de celpellet in 1 ml PBS met 2% FBS, 2 mM EDTA en 10 mM HEPES zodat de concentratie 1 x 10 6 cellen / ml.
- Breng een botfragment in een 70 um cel zeef bovenaan een 50 ml conische buis. Gebruik een 10 ml spuit met een 25 G naald krachtig spoelen fragment met 10 ml PBS aan een suspensie van mergcellen verkrijgen in de conische buis. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 3 minuten bij 300 g en 21 ° C, zuig de supernatant en resuspendeer de gepelleteerde cellen in PBS of andere gewenste oplossing voor flowcytometrie.
- H & E kleuring en immunohistochemie.
- Om de fragmenten voor hematoxyline & eosine (H & E) kleuring en / of immunohistochemie verwerken, plaatst u de fragmenten in plastic cassettes gelabeld met een nummer 2 potlood en onderdompelen in een container gevuld met 10% gebufferde formaline gedurende 24 uur.
- Proces weefsels voor inbedden in paraffine, snijden en kleuring met behulp van routine protocollen die een ontkalking stap om rekening te houden met de gemineraliseerde spicules binnen elk fragment bevatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isoleren Tissue Fragmenten uit femurkoppen
Femurkoppen werden verzameld uit een gelijk aantal mannelijke en vrouwelijke patiënten (44-90 jaar) die een electieve totale heupprothese chirurgie in de afdeling orthopedische chirurgie aan de Stanford University School of Medicine. Elke weggegooid femurkop bevat een klein gedeelte van het bovenste dijbeen, die trabeculair botweefsel uit gemineraliseerde spicules en merg herbergt. Dit weefsel is toegankelijk via het chirurgisch blootgestelde dwarsdoorsnede van de as (figuur 2A) met een chirurgische rongeur kleine fragmenten extraheren. De histologie van de geëxtraheerde stukken wordt getoond in figuur 2B, waaruit de gemineraliseerde en merg componenten. Het uiterlijk van de geëxtraheerde stukken varieert femurkoppen verkregen uit verschillende patiënten, variërend van geel tot rood, afhankelijk van de adipocyten inhoud van het merg zoals weergegeven in figuur 2C. We tonen het gebruik van deze botweefsel fragmenten op korte termijn assays dynamische interactie met borstkankercellen ontworpen voor luciferase en EGFP expressie meten.
Co-kweken van borstkankercellen grenzend aan botfragmenten te Breast celproliferatie te meten met behulp van bioluminescentie Imaging
De kweekplaat opstelling voor co-kweken van MDA-MB-231-fluctuaties-EGFP borstkankercellen naast geïmmobiliseerd botfragmenten borst- celproliferatie middels BLI meten wordt getoond in figuur 3A. BLI van de plaat bij 24 uur is weergegeven in figuur 3B, en BLI signaal van 3 experimenten, demonstreren verhoogde celproliferatie in aanwezigheid versus afwezigheid van botfragmenten is getoond in figuur 3C.
Co-kweken van borstkankercellen direct gezaaid op botfragmenten te studeren Kolonisatie en Cell Aantal
Kolonisatie van MCF-7-fluctuaties-EGFP cells gezaaid direct op botweefsel fragmenten gemeten via BLI bij 24 uur is weergegeven in figuur 4A, waaruit verminderde signaal geassocieerd met afnemende zaaidichtheid. Een direct geplaatste fragment wordt getoond bij 48 uur in Figuur 4B, na labeling met fluorescerende biphosophonate reagens, zoals afgebeeld door fluorescentiemicroscopie kolonisatie van de borstkankercellen binnen de gemineraliseerde en merg compartimenten onthullen. Deze kolonisatie patronen worden ook geopenbaard in rechtstreeks geplaatste fragmenten post-experimenteel verwerkt voor immunohistochemische kleuring met cytokeratine antilichaam (Figuren 4C en 4D).
Het meten van Migratie van borstkankercellen te botweefsel Fragmenten en Gekweekte Bone Fragment Supematanten
Migratie van MDA-231-fluctuaties-EGFP cellen heel poreus migratie membranen in de richting van botweefsel kweeksupernatanten en in botfragmenten wordt gedetecteerd met BLI zoals weergegeven in figuur 5. Een robuuste migratiepatroon naar kweeksupernatanten afgeleid van drie fragmenten van een gegeven THR model wordt getoond in figuur 5A, één figuur verhoogde migratie in putjes bevattende botweefsel supernatant versus controle medium. Hoewel niet alle migratiepatronen zijn deze robuuste, migratie naar bot supematanten doorgaans hoger dan in de richting van controle medium in de meeste experimenten. Een normale migratie patroon in botfragmenten van een bepaalde THR model is weergegeven in Figuur 5B.
Analyse van Flushed Marrows
Daarnaast hebben we zien dat beenmergcellen kan worden gespoeld uit gekoloniseerd fragmenten, en dat gespoeld borstkankercellen kunnen worden gedetecteerd onder deze cellen door flowcytometrie (figuur 6B), BLI (figuur 6C) en / of fluorescentie microscopie (figuur 6D) .
Het meten van de levensvatbaarheid
Figuur 1: Opzetten van migratie experimenten. (A) In "forward migratie" experimenten, worden de ontvanger putjes gevuld met eerder gegenereerde botweefsel kweeksupernatanten. Borstkanker cellen die zijn gezaaid op de binnenste, bovenvlakken van Transwell membranen inzetkommen met DME-10% FBS migreren door het membraan en in de onderkant van de putjes detectie door BLI. 
Figuur 2: Het isoleren van weefsel fragmenten uit femurkoppen. (A) Het halen van fragmenten van trabeculair bot met behulp van een chirurgische rongeur. (B) Histologie van fragment direct na extractie uit dijbeen weefsel vaste tonen gemineraliseerd (witte pijl) en merg (zwarte pijl) compartimenten. (C) Trabeculaire botfragmenten gewonnen uit twee verschillende femurkoppen demonstreren variatie in rode vs. geel beenmerg inhoud. 
Figuur 3:-Co kweken van borstkankercellen grenzend aan botfragmenten om borstvoeding celproliferatie te meten met behulp van bioluminescentie beeldvorming. (A) kweekplaat opstelling voor co-kweken van MDA-MB-231-fluctuaties-EGFP borstkankercellen grenzend aan geïmmobiliseerd botfragmenten, zoals aangegeven door pijlen cell vlekken (blauw), been wax (zwart), en bot fragment (red ). De positie van het bot was wordt ook opgemerkt door een zwarte gestippelde cirkel. De plaat wordt vóór toevoeging drager. De top 3 putten bevatten botfragmenten vastgebonden aan het bot was en de onderste drie putjes bevatten alleen bot was. (B) BLI van de plaat bij 24 uur. (C) Kwantificering van BLI signalen voor MDA-MB-231-fluctuaties-EGFP cellen groeien in aanwezigheid (paarse bars) versus afwezigheid (groene balken) Fragmenten van drie THR specimens gekweekt zoals beschreven. Voor elke THR specimen, bars vertegenwoordigen gemiddelde BLI waarden gemeten over 3-fragment dat - vs. 3 controle putten. Dit resultaat demonstreert hogere proliferatie in aanwezigheid versus afwezigheid van botfragmenten. Foutbalken geven standaardfout (p <0,01). Overgenomen met toestemming 44. 
Figuur 4: Detectie van borstkankercellen direct gezaaid op botfragmenten. (A) kolonisatie van MCF-7-fluctuaties-EGFP cellen direct gezaaid op botweefsel fragmenten zoals gedetecteerd door BLI bij 24 uur, Resultaat verminderde signaal geassocieerd met dalende zaaien dichtheid. (B) Direct-geplaatste fragment op 48 uur na het zaaien, en 24 uur na het labelen met fluorescerende biphosophonate reagens. Fluorescentie microscopie onthult EGFP + borstkankercellen alspelde met een gemineraliseerde spicule (groene pijl), en met vet cellen in het beenmerg compartiment (witte pijlen). Deze kolonisatiepatronen worden eveneens geopenbaard in direct geplaatste fragmenten verwerkt voor immunohistochemische kleuring met een AE1 / AE3 pan-cytokeratine antilichaam na 72 uur co-kweek (C) en (D). In (C) cytokeratine-positieve borstkankercellen, aangegeven met pijlen, zijn waargenomen naast adipocyten in het beenmerg compartiment. In (D) een cytokeratine-positieve borstkanker cel wordt waargenomen een gemineraliseerde spicule verbonden. (C) en (D) overgenomen met toestemming 44. 
Figuur 5:. Meten migratie van borstkankercellen botweefsel fragmenten en gekweekte botfragmenten supernatanten Migratie van MDA-MB-231-fLuc-EGFP cellen heel poreus migratie membranen in de richting van botweefsel kweeksupernatanten en in botfragmenten gevonden bij 24 uur met BLI. (A) BLI signaal onthullend verbeterde migratie richting kweeksupernatanten afgeleid van een bepaalde THR specimen versus controle medium. (B ) BLI signaal waaruit blijkt migratiepatroon van borstkankercellen in 3 botfragmenten van één THR exemplaar. Botweefsel fragmenten worden aangeduid door witte gestippelde cirkels. Controle putjes die glasparels onderaan weergegeven. 
Figuur 6:.. Detectie van MDA-MB-231fLUC-EGFP cellen in merg gespoeld uit gekoloniseerde fragmenten (A) Fragmenten zonder (links) en met (rechts) gekoloniseerd borstkankercellen, zoals gedetecteerd door BLI (B) Analyse van merg gespoeld van fragmenten (A) van Flage cytometrie. EGFP-positieve borstkankercellen werden gedetecteerd in merg gespoeld uit het BLI-positieve fragment, maar niet de BLI-negatieve fragment. (C) BLI detectie van borstkanker cel kolonies verkregen uit de kweek van merg gespoeld uit BLI-positieve fragment. (D) Fluorescentie microscopie van het merg compartiment gespoeld uit BLI-positieve fragment, met MDA-MB-231fLUC-EFGP cellen in een gebied van mergcellen. 
Figuur 7:. Meten levensvatbaarheid levensvatbaarheid van beenmerg cellen gespoeld uit weefsel fragmenten geïsoleerd uit 4 THR specimens onmiddellijk na het verzamelen en bij 24, 48, 72 uur en 6 dagen kweek in DMEM-10% FBS. Het medium werd veranderd in 24 en 72 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mehra et al. Hebben eerder beschreven postmortem verzameling en analyse van bot specimens van uitgezaaide prostaatkanker patiënten geoogst bij de autopsie, waaruit hoogwaardige weefsels en valideren het gebruik van menselijke botsamples het metastatische proces 47 bestuderen. Hier hebben we protocollen beschreven voor het verzamelen, verwerken menselijk botweefsel verkregen fragmenten uit afgedankte femurkoppen na THR chirurgie in een korte co-kweeksysteem borst- celmigratie, kolonisatie en proliferatie bestuderen. Ongeveer 300.000 heupprothese operaties worden jaarlijks uitgevoerd in de VS (American Academy of Orthopaedic Surgeons; Orthoinfo.aaos.org), en deze monsters zijn meestal weggegooid. Een van de meest voorkomende indicaties voor deze operatie is artrose van het heupgewricht leidt tot geleidelijke afbraak van het kraakbeen oppervlakken die de femurkop, waardoor gewrichtspijn. Tijdens de totale heup replacement chirurgie een klein gedeelte van het bovenste dijbeen verwijderd met de femurkop. Het dijbeen is een gemeenschappelijke website van de uitzaaiing van borstkanker 48, en deze monsters bevatten trabeculair botweefsel, de site van metastatische borstkanker cel kolonisatie. De meeste patiënten die een nieuwe heup ondergaan zijn 50-80 jaar oud, een leeftijd dat de jaren van piek incidentie van borstkanker beugels. Aldus deze weefsels vormen een waardevolle bron voor het bestuderen van borstkanker botten uitgezaaide niche.
Er zijn verschillende kritische stappen en overwegingen in verband met deze technieken. Eerst een goede kwaliteit chirurgische ronguer essentieel voor de extractie kleine trabeculaire botfragmenten terwijl de femurkop in tegengestelde, gehandschoende hand. Tang zal niet werken omdat ze niet stevig genoeg om trabeculaire weefsel bevat gemineraliseerd spicules halen. Een andere belangrijke overweging bij deze testen heeft betrekking op de borst cellijn handling en passage, bijzonmatig met betrekking tot de migratie assays. Langdurige doorgang en / of variabiliteit in trypsine procedures kan tot de sequentiële selectie van meer / minder vasthoudend celpopulaties mogelijk veranderen van de trekkende respons experimenten. Een ander probleem betreft de standaardisatie van experimenten, gezien de variabiliteit van chirurgische weefsel van patiënten van verschillende leeftijden en ziektetoestanden. Om dit aan te pakken, we maken gebruik van een intra-subject experimenteel design, waarbij alle variabelen worden in drievoud getest (bijvoorbeeld over drie fragmenten / experimentele putten versus drie fragmenten / controle putten) met behulp van fragmenten uit chirurgische specimen een bepaalde patiënt. Variabelen kunnen worden getest met dit ontwerp op monsters van verschillende patiënten en geanalyseerd op statistische significantie met de gepaarde T-test voor data gemiddeld over replicaten en / of binnen-subjects eenzijdige ANOVA voor data over duplo. En tenslotte, een belangrijkste beperking van deze methode is het korte tijdsbestek van Viabiliteit tijdens explantaatkweek.
Onze metingen bleek merg levensvatbaarheid van ~ 90% op de dag van inzameling, in overeenstemming met de levensvatbaarheid verkregen uit beenmergaspiraten 49. Verloop van tijd echter, zagen we een geleidelijke daling op dagen twee en drie, met dramatisch verlies van levensvatbaarheid overdag 6. Hoewel we niet de levensvatbaarheid van de gemineraliseerde compartiment hebben gemeten, kwalitatieve waarnemingen suggereren dat er een soortgelijke afname in de levensvatbaarheid van been voering osteoblasten en osteocyten, zoals getoond in figuur 4D. Op basis van deze experimenten hebben we onze cultuur experimenten alleen op de korte termijn studies uitgevoerd over 48 of 72 uur. Voorlopige experimenten (niet inbegrepen) aangegeven dat de levensvatbaarheid kan worden verbeterd met behulp van commercieel verkrijgbare media geformuleerd mergcellen houden. We hebben echter niet gekarakteriseerd het beenmerg celpopulaties in deze experimenten, en niet weet of de verbeterde levensvatbaarheid resultaten van de geselecteerdeuitgroei van bepaalde merg cel subpopulaties. De ontwikkeling van protocollen in stand te houden en de levensvatbaarheid van deze explants breiden zal belangrijk zijn om dit model systeem te bevorderen.
Hoewel dit model is beperkt tot korte perioden, zijn belangrijke voordelen ten opzichte van andere methoden omvatten de volgende kenmerken: 1) intacte 3-dimensionale weefsels herbergen relevante celtypen die het menselijk bot micro, 2) toegang tot het bot micro voor bewaking vormen en storende dynamische interacties, 3) hoog aantal fragmenten per specimen replicaatexperimenten, en 4) lage kosten in vergelijking met dierlijke modellen.
Hoewel we hebben beschreven assays voor het bestuderen borstkankermetastasen bot, kunnen deze monsters en benaderingen gemakkelijk worden uitgebreid tot de studie van andere botzoekende maligniteiten zoals prostaatkanker, evenals andere bot aandoeningen. Hoewel we de afgedankte femurkoppen hoofdzakelijk gebruikt als een zource van weefselfragmenten, deze monsters vormen ook een extra bron van menselijke beenmerg, die traditioneel wordt verzameld via beenmerg aspiratie van jonge vrijwilligers. Tenslotte, terwijl we benadering en de cellijnen gemanipuleerd voor bioluminescentie en fluorescentie beschreven meeste procedures kunnen worden aangepast voor gebruik met andere cellen als deze cellijnen en / of beeldvorming platforms zijn niet beschikbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Deze studies werden gefinancierd, gedeeltelijk, door subsidies van de Alternatieve Research and Development Foundation (107.588), het National Institute of Health (1U54CA136465-04S1), en de California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Wij danken Drs. Andrew Wilber en R. Scott McIvor voor de gulle donatie van hun
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
References
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 1, 46-54 (2001).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, Suppl 3. S131-S139 (2008).
- Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
- Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
- Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
- Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
- Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
- Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
- Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
- Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265 (2012).
- Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
- Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
- Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an 'all human' animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
- Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
- Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
- Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
- Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
- Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients' bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
- Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
- Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
- Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
- Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
- Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
- Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
- Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
- Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
- Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
- Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
- Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M. Metastatic carcinoma of the long bones. Am Fam Physician. 76, 1489-1494 (2007).
- Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).
