Protocollen worden beschreven voor het bestuderen van borstkanker celmigratie, proliferatie en kolonisatie in een menselijk botweefsel explantaatmodel systeem.
Bot is de meest voorkomende plaats van borstkankermetastasen. Hoewel het algemeen aanvaard dat de micro-invloeden kankercel gedrag, is er weinig bekend over borstkanker cel eigenschappen en gedragingen binnen de inheemse micro-omgeving van de menselijke botweefsel. We hebben benaderingen op te sporen, te kwantificeren en te moduleren menselijke borstkankercellen in de micro-omgeving van de ontwikkelde gekweekte menselijke botweefsel fragmenten geïsoleerd uit afgedankte femurkoppen na een totale heupprothese chirurgie. Met borstkankercellen ontworpen voor luciferase en versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) expressie, kunnen wij reproduceerbaar kwantificeren migratie en proliferatie patronen met bioluminescentie (BLI), spoor cel interacties binnen de botfragmenten middels fluorescentiemicroscopie en evalueren borstcellen na kolonisatie met flowcytometrie. De belangrijkste voordelen van dit model zijn: 1) een native, architectonisch intact weefsel microenvironment dat relevante menselijke celtypes omvat, en 2) een directe toegang tot de micro-omgeving, die een snelle kwantitatieve en kwalitatieve monitoring en verstoring van de borst en been cel eigenschappen, gedragingen en interacties vergemakkelijkt. Een belangrijkste beperking op dit moment is de eindige levensvatbaarheid van het weefsel fragmenten, die het raam van onderzoek op korte termijn cultuur beperkt. Toepassingen van het modelsysteem omvatten bestuderen de fundamentele biologie van borstkanker en andere bot-zoekende maligniteiten in de metastatische niche en ontwikkeling van therapeutische strategieën om gerichter borstkankercellen in botweefsel.
De tumor micro-omgeving wordt algemeen erkend als een kritische determinant van kankercel gedrag tijdens borstkanker progressie en metastatische verspreiden 1-3. Het doel van de hier voorgestelde methode is het bestuderen van borstkankercellen in het micromilieu van menselijk botweefsel, de meest voorkomende plaats van borstkankermetastasen 4-6 vergemakkelijken. Bot bestaat uit gemineraliseerd en merg compartimenten 7-9, beide haven cellen en uitgescheiden factoren betrokken bij metastatische progressie 10,11. Hoewel veel gebruikt in vivo muismodellen te vergemakkelijken systemische studies van het metastatische proces 12-15, cel interacties binnen het skelet zijn niet gemakkelijk toegankelijk voor observatie en directe verstoring. Modelsystemen voor het bestuderen van en het kweken van de muis bot weefsels en muis beenmerg cellen zorgen voor een betere toegang en hebben veel inzichten met betrekking tot overspraak en mechanismen die ten grondslag liggen aan borstkanker cel m opgeleverdetastasis van de muizen skelet 16-22. Studies hebben echter gesuggereerd dat er mogelijk species-specifieke patronen van osteotropism voor botweefsel 23,24. Deze patronen kunnen inherent species-specifieke verschillen in botweefsel eigenschappen, die voortvloeien uit veranderde beenmerg populaties in immuun-deficiënte muizen 11 en / of de relatief jonge leeftijd van muizen die voor experimenten, die waarschijnlijk determinanten van het bot weergeeft micro-omgeving.
In vitro technieken voor het bestuderen van borstkankercellen in menselijk bot coculturen zijn doorgaans gericht op specifieke been celtypes zoals beenmerg afgeleide osteoblasten en stromale cellen gekweekt als monolagen of binnen gemanipuleerde 3-dimensionaal modelsystemen 25-35. Hoewel 2-dimensionele celkweekmodellen de steunpilaar van in vitro gevormd benaderingen voor kankeronderzoek is het al lang erkend dat celgedrag fundamenteel veranderd in monolayer kweeksystemen 18,36,37. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van gemanipuleerde micro-omgevingen die de complexiteit van 3-dimensionale levende weefsels, zoals matrix- en steiger gebaseerde modellen uit natuurlijke materialen zoals collageen nabootsen, of synthetische polymeren geënt met specifieke celtypen te weefselachtige microenvironments creëren 36-41. Gemanipuleerde benaderingen hebben ook het gebruik van de bioreactor platforms te controleren en de studie van de hormonale milieu van de micro-omgeving 18,19,41-43. Hoewel biomimetische modellen en bioreactoren bieden veel elementen van een complex weefsel micro-omgeving in een gecontroleerde omgeving, en zijn met succes toegepast op de studie van de uitzaaiing van borstkanker aan het bot 18,19,35,42,43 vooruit, denk engineered modelsystemen in het algemeen niet op te nemen het volledige spectrum van celtypen en extracellulaire matrix componenten aanwezig in het natuurlijk bot milieu.
Tot voor kort, borstkankercellen werden niet bestudeerd in het natieve, intacte, 3-dimensionale micromilieu van menselijke botweefsel. We hebben onlangs meldde de ontwikkeling van een co-cultuur model met behulp van menselijk bot weefselfragmenten geïsoleerd van de totale heupprothese (THR) chirurgie exemplaren 44. Deze exemplaren haven zowel de gemineraliseerde en merg compartimenten die nodig zijn om mechanismen die ten grondslag liggen micro-uitzaaiingen in korte termijn cultuur te bestuderen. In eerdere werk gevestigde we proof-of-principle voor het gebruik van bioluminescentie beeldvorming (BLI) om de proliferatie van luciferase uiten borstkankercellen (MDA-MB-231-Fluc) samen gekweekt met botfragmenten 44 monitoren. Hier presenteren we gedetailleerde experimentele protocollen voor het bestuderen borstcel kanker proliferatie, kolonisatie en migratie binnen het kader van de natieve micro met menselijk bot weefsel explantaten.
Eerst presenteren we een protocol voor co-kweken borstkankercellen grenzend aan botfragmenten om borstvoeding te metencelproliferatie behulp van BLI. In dit hoofdstuk worden borst celsuspensies geënt cel- spots in 6-well platen naast botfragmenten, die worden geïmmobiliseerd door botstukken was. Controle putjes bevatten bot was, maar geen bot fragment. Zodra cel spots te bevestigen, wordt medium toegevoegd en de plaat gekweekt gedurende 24 uur, waarna bioluminescente signaalintensiteit (geassocieerd met het aantal cellen) wordt gemeten BLI. In de volgende stap stellen we methode voor co kweken borstkankercellen direct gezaaid op botfragmenten kolonisatie en proliferatie bestuderen. Hier de borst celsuspensies worden direct gepipetteerd op het botweefsel fragmenten die in kweek worden bewaakt door BLI en fluorescentiemicroscopie tijd kolonisatie en aantal cellen te volgen. In deze werkwijze kan het beenmerg compartiment gespoeld uit de botfragmenten op elk tijdstip voor analyse gekoloniseerde borstkankercellen door flowcytometrie of merg levensvatbaarheid assays.
Daarnaast hebben we Dèschriftgeleerde twee verschillende benaderingen voor het meten van borstkanker cel migratie. In de eerste werkwijze stappen beschreven voor het meten migratie naar botweefsel kweeksupernatanten. In dit protocol borstkanker cellen worden gezaaid op de binnenste bovenvlakken van Transwell voegen membranen met 8 urn poriegrootte (zie figuur 1A). De inserts worden vervolgens geplaatst in een ontvanger plaat met putjes die botweefsel supernatant of controle medium. In de loop van 20 uur incubatieperiode kleine aantallen borstkankercellen migreren door het inzetstuk membranen naar het onderste weefsel kweekputjes wanneer zij hechten voor detectie door BLI. In de tweede migratiemethode borstkanker cellen worden gezaaid op de onderste buitenoppervlakken van Transwell insert membranen. Botweefsel fragmenten worden in de inzetkommen geplaatst en borstkankercellen migreren door de membranen om de botfragmenten koloniseren (zie figuur 1B), dieVervolgens worden afgebeeld met behulp BLI.
Mehra et al. Hebben eerder beschreven postmortem verzameling en analyse van bot specimens van uitgezaaide prostaatkanker patiënten geoogst bij de autopsie, waaruit hoogwaardige weefsels en valideren het gebruik van menselijke botsamples het metastatische proces 47 bestuderen. Hier hebben we protocollen beschreven voor het verzamelen, verwerken menselijk botweefsel verkregen fragmenten uit afgedankte femurkoppen na THR chirurgie in een korte co-kweeksysteem borst- celmigratie, kolonisatie en prolifer…
The authors have nothing to disclose.
Deze studies werden gefinancierd, gedeeltelijk, door subsidies van de Alternatieve Research and Development Foundation (107.588), het National Institute of Health (1U54CA136465-04S1), en de California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Wij danken Drs. Andrew Wilber en R. Scott McIvor voor de gulle donatie van hun transponson en PK / hUbiC-SB11 transposasegen plasmiden. Wij dankbaar erkennen John Tamaresis, Ph.D. voor advies over statistische methoden, Timothy Brown voor het uitvoeren van flowcytometrie, Georgette Henrich voor advies over migraties testen, en Nancy Bellagamba voor de inzameling van THR exemplaren vergemakkelijken.
DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL) | Life Technologies | L-8220 | |
Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |