Summary
프로토콜 인간 뼈 조직 이식편 모델 시스템에서 유방암 세포의 이동, 증식 및 집락 공부 설명된다.
Abstract
뼈 유방암 전이의 가장 흔한 위치이다. 이것은 널리 미세 영향 암세포 동작 것이 허용되어 있지만, 약간의 인간 뼈 조직의 기본 미세 환경 내에서 유방암 세포의 특성과 동작에 대해 잘 알려져있다. 우리는 추적 정량화의 미세 환경 내에서 인간 유방암 세포를 조절하는 방법을 개발했다 고관절 교체 수술을 다음 폐기 대퇴골에서 분리 배양 된 뼈 조직 조각. 유방암 세포 루시페라아제 위해 설계 및 녹색 형광 단백질 (EGFP) 식을 확장을 사용하여, 우리는 재현성 후 유방암 세포를 형광 현미경을 이용하여 뼈 조각 내에 생물 발광 영상을 이용하여 이동 및 증식 패턴 (BLI), 트랙 세포 상호 작용을 정량하고, 평가할 수있다 유동 세포 계측법과 식민지. 이 모델의 주요 장점은 다음과 같습니다 : 1) 기본, 구조적 손상 조직 microe중요한 인간 세포 유형을 포함하며, 신속한 정량적 모니터링 및 유방 및 뼈 세포 특성, 동작 및 상호 작용의 섭동을 용이하게 미세 환경, 2)에 직접 액세스 nvironment. 기본 제한은 현재의 단기 배양 연구에 윈도우를 한정 조직편, 유한의 생존이다. 모델 시스템의 애플리케이션 내 틈새 전이성 유방암 및 기타 뼈 추구 악성 종양 기초 생물학을 연구하고 효과적으로 골조직의 유방암 표적 세포 치료 전략의 개발이 포함된다.
Introduction
종양 미세 환경 널리 유방암 진행성 전이성 암세포 중에 거동의 중요한 결정 인자로 인식되고 1-3 확산. 여기에 제시된 방법의 목적은 인간의 뼈 조직, 유방암 전이 4-6의 가장 빈번한 위치의 미세 환경 내에서 유방암 세포의 연구를 촉진 할 것이다. 뼈는 전이성 진행 (10, 11)에 연루 세포와 분비 요인 항구 둘 광물 및 골수 구획 7-9으로 구성되어 있습니다. 널리 생체 마우스 모델에서 사용하지만 전이 과정 12 ~ 15의 체계적인 연구를 촉진, 골격 내에서 세포 상호 작용은 관찰과 직접 섭동에 대해 쉽게 액세스 할 수 없습니다. 연구 및 마우스 골조직과 마우스 골수 세포를 배양 모델 시스템은 더 액세스를 제공하고 유방암 세포의 기초 m 많은 크로스 토크에 관한 통찰력과 메커니즘을 수득 한쥐의 골격 16-22 etastasis. 그러나, 연구는 뼈 조직 (23, 24)에 대해 osteotropism 종의 특정 패턴이있을 수 있음을 제안 하였다. 이러한 패턴은 뼈의 가능성 결정 인자 모두는 고유의 종 특이 골조직 특성의 차이, 면역 결핍 마우스 (11)에 변경된 골수 개체군 인한 차이들, 및 / 또는 실험에 사용 된 마우스의 비교적 어린 나이를 반영 할 수 미세.
시험 관내에서 통상적으로 골수 유래 골아 세포 또는 단층 배양 한 간질 세포 나 설계된 3 차원 모델 시스템 25-35 내의 특정 뼈 세포 유형에 집중 한 자가골 공동 배양에서 유방암 세포를 연구를 위해 접근한다. 2 차원 세포 배양 모델에서 시험 관내의 대들보를 형성 암 연구에 접근 하였지만, 그것은 롱 셀의 동작은 기본적으로 m에서 변경되는 것을 인식되어왔다문화 시스템 18,36,37 onolayer. 이것은 매트릭스 - 및 콜라겐 등의 천연 소재로 이루어지는 지지체 기반 모델을 포함하여 3 차원 살아있는 조직의 복잡성을 모방 설계된 미세 환경의 개발을 주도하고있다, 또는 합성 중합체는 조직 형 미세 환경을 만들기 위해 특정 유형의 세포로 시딩 36-41. 엔지니어링 접근 방법도 제어하고 미세 18,19,41-43의 호르몬 환경을 연구하는 생물 반응기 플랫폼의 사용을 포함했다. 생체 모방 모델 생물 반응기가 제어 된 환경에서 복잡한 미세 조직의 많은 요소를 제공하고, 성공적으로 뼈 18,19,35,42,43 유방암 전이 학습을 사전에 적용되었지만, 모델 설계된 시스템은 일반적으로 포함하지 않는다 뼈 네이티브 환경 내 존재하는 세포 형태 및 세포 외 기질 성분의 전체 스펙트럼.
최근까지, 유방암세포는 인간 뼈 조직의 네이티브 그대로 3 차원 미세 환경 내 연구되지 않았다. 최근 우리는 (THR) 수술 44 시편 고관절 여분로부터 단리 인간 뼈 조직 단편을 사용하여 공 배양 모델의 개발을보고 하였다. 이 표본은 모두에게 단기 문화 마이크로 전이 기전을 연구하는 데 필요한 광물과 골수 구획을 항구. 이전 연구에서 우리는 뼈 조각 (44) (MDA-MB-231-fLuc) 공 배양 루시페라아제 발현 유방암 세포의 증식을 모니터링하는 생물 발광 영상 (BLI)을 사용하기위한 원칙의 증명을 수립. 여기에서 우리는 인간의 뼈 조직 이식편을 사용하여 원시 미세 환경의 컨텍스트 내에서 유방암 세포 암의 증식, 식민지 및 마이그레이션 연구를위한 실험 프로토콜을 상세하게 제시한다.
먼저 우리는 유방을 측정하는 골편에 인접한 공동 배양 유방암 세포에 대한 프로토콜을 제시BLI를 사용하여 세포 증식. 이 섹션에서는, 유방암 세포 현탁액은 뼈 왁스의 조각에 의해 고정되어 뼈 조각에 인접 6 웰 플레이트의 세포 명소로 씨앗을 품고있다. 제어 우물은 뼈 왁스,하지만 뼈 조각이 포함되어 있습니다. 셀 반점 부착하면 배지를 첨가하고, 플레이트를 측정한다 BLI 생물 발광 신호 강도 (셀 번호와 관련된) 24 시간 후, 배양이다. 다음 단계에서는 집락 증식을 연구하는 골편에 직접 파종 공동 배양 유방암 세포에 대한 방법을 제시한다. 여기 유방 세포 현탁액은 세포 집락 수를 추적하기 위해 시간에 걸쳐 BLI 및 형광 현미경에 의해 모니터되는 배양 골조직 단편에 직접 피펫 팅한다. 이 방법에서는, 골수 구획 유세포 식민지 유방암 세포 분석을위한 임의의 시점에서 뼈 조각에서 플러시, 골수 또는 생존력 분석 될 수있다.
또, 디유방암 세포의 이동을 측정하기위한 두 가지 접근법 스크라이브. 첫 번째 방법의 단계는 뼈 조직 배양 상청액을 향해 이동을 측정하기위한 나와있다. 없이 Transwell의 내부, 상부면이 8 ㎛의 공경을 멤브레인에 삽입 (도 1a에 도시 된 바와 같이)이 프로토콜에서 유방암 세포를 시딩 하였다. 이어서 인서트 골조직 상등액 또는 제어 매질을 포함하는 웰을 가진 수용기 판에 배치된다. 20 시간의 잠복기의 과정 동안, 유방암 세포의 작은 숫자는 아래가 BLI에 의해 검출 첨부 낮은 조직 문화의 우물에 삽입 세포막을 통해 이동한다. 두 번째 방법에서는 이주 유방암 세포없이 Transwell 인서트 막의 하부, 외부 표면 상에 시딩 하였다. 골 조직 단편을 삽입 컵에 배치되고, 유방암 세포 (도 1b에 도시 된 바와 같이) 뼈 조각에 정착하는 멤브레인을 통해 이동하는다음 BLI를 사용하여 몇 군데 있습니다.
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Protocol
대퇴 머리는 스탠포드 의과 대학에서 정형 외과의학과 과목 THR 수술을받은 환자에서 수집되었다. 모든 조직은 스탠포드 대학 연구 준수 부서의 규정에 따라 드 확인 된 표본으로 수집 하였다.
1. 유방암 세포주 (들)을 선택
- 구하는 루시 페라 제 또는 GFP 리포터 구성체 원하는 유방암 세포주 (들)를 형질. 이하의 실험은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 플라스미드 pKT2 / LuBiG로 형질 MDA-MB-231, MCF-7 유방암 세포주 반딧불이 루시퍼 라제의 안정한 발현을 위해 설계 (fLuc) 및 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 사용하여 수행 하였다 및 트랜스 플라스미드 약동학 / hUbiC-SB11 45,46.
주 : 형질 감염된 세포주 MDA-MB-231-fLuc-EGFP 및 MCF-7-EGFP fLuc라고 칭한다.
2. 격리를 조직 F대퇴 머리에서 ragments
- THR 수술 후 생리 식염수로 채워진 멸균 용기에 폐기 된 대퇴골 두를 수집합니다. 실험실로 시편을 전송하고 수술 1-3 시간 이내에 처리합니다. 주 : 처리 지연이있는 경우, 4 ℃에서 시험편을 배치.
- 실험의 각 유형은 아래 규정 된 멸균 장갑, 수술 rongeur, 집게, 비커를 70 % 이소프로판올로 악기 및 조직 배양 용기를 씻어 : 층류 조직 문화 후드에 흡수 매트에 다음 항목을 배치하여 작업 영역을 준비 .
- 멸균 수술 장갑을 착용 한 손으로 둥근 대퇴골의 머리를 잡아 대퇴골의 노출 된 상부 샤프트에서 원하는 크기 (~ 2-5mm)의 소주 뼈 조각을 추출하는 반면에 rongeur를 사용합니다. 배양 용기 내로 뼈 조각을 전송 (예를 들면, 6, 12, 또는 조직 배양 플레이트 또는 마이그레이션 챔버 24 웰), 증식의 종류에 따라, COL또는 마이그레이션 onization 실험, 단계 3, 4 또는 5에 기재된 바와 같이.
주 : 각 특정 증식, 군체 또는 마이그레이션 분석을위한 초기 단계를 완료 한 후 전술 한 바와 같이 뼈 조직 단편을 수확한다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 단편의 크기의 범위 일 것이다. 파편 전 또는 표준화의 목적으로 다양한 실험을 칭량 할 수있다.
뼈 조각에 인접 3. 공동 배양 유방암 세포는 BLI를 사용하여 유방 세포의 증식을 측정하는
- 실험 전에, 2 × 105 유방암 세포 / 50 μL를 함유하는 현탁액을 제조하고, 배양 뼈 조각을 고정 뼈 왁스 플러그를 준비한다. 3 조각으로 P200 마이크로 피펫 팁을 잘라 뼈 왁스의 작은 (~ 35 mg)을 조각을 잘라 '쿠키 커터 (cookie cutter)'방식으로 가장 큰 조각의 좁은 끝을 사용합니다. 페트리 접시에 뼈 왁스 플러그를 꺼내 작은 조각의 넓은 끝 부분을 사용하여저장.
- 각 웰의 12시 방향에 뼈 왁스의 조각을 놓고 부드럽게 멸균 장갑을 낀 검지 손가락으로 누르십시오.
- 피펫 6- 웰 플레이트의 각 웰의 중앙에 DMEM-10 % FBS + 펜 스트렙토 1 × 105 유방암 세포를 포함하는 세포 현탁액 50 μL. (또는 원하는 경우 분산 패턴에 씨앗 세포.) 세포 부착을 촉진하기 위해 45 분 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
- 각각의 실험은 물론 뼈 왁스의 1 개에 1 뼈 조각을 배치하고 고정 rongeur와 부드러운 압력을 적용합니다. 아래 세 개의 우물 만 컨트롤과 같은 뼈 왁스를 포함하면서, 주어진 THR 표본에서되도록 3 뼈 조각이 상위 세 우물에 배치됩니다 세중에서 실험을 수행합니다.
- 5 ㎖ 피펫을 사용하여 조심스럽게 천천히 유방암 세포 또는 뼈 조각을 빠지 피하기 위해 각 웰의 측면에 DMEM-10 % FBS 5 mL를 전달한다. 37 접시를 놓고76; 20 ~ 24 시간 동안 C 조직 문화 인큐베이터.
- 생물 발광 이미징을 수행하기 위해 (BLI)는 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고, 각 웰 (300 ㎍ / ml의 농도를 달성하기 위해) 루시페린 기질을 추가한다. 이미지 다음 매개 변수를 사용하여 IVIS 이미징 플랫폼에서 즉시 플레이트 : 1의 f- 스톱, 작은 비닝 (binning), 1 초의 노출 시간, 레벨 D.는 신호 각각의 강도뿐만 아니라 평균 복사 휘도 (광자 / 초 / 제곱 센티미터를 / 측정 스테 라디안).
- 모든 실험 및 제어 우물의 평균 복사 휘도를 정량하는 관심 영역 (ROI)을 정의하는 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 엑셀 시트로 내보내기 평균 복사 휘도 값은 통계를 수행하고 그래프를 생성합니다.
뼈 조각에 직접 시드 4. 공동 배양 유방암 세포는 식민과 세포 수를 연구에
- 24 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 직접 빈 뼈 조각을 배치 (1 단편 / 웰) 집게를 사용한다.
- 삐악 삐악 울다직접 각각의 뼈 조각 위에 한 X 10월 3일부터 6일까지 유방암 세포를 함유하는 DMEM-10 % FBS의 50 μl를 세포 현탁액 액적 ette. 세포 부착을 촉진하기 위해 45 분 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 조심스럽게 조각이 완전히 매체에 빠져들 것을 각 웰 등의 측면에 1-2 ml의 DMEM-10 % FBS를 추가합니다. 20 ~ 24 시간 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어.
- 배양 후, 각 웰에 1 ㎖의 DMEM-10 % FBS를 함유하는 새로운 24 웰 플레이트에 각 골 조직 단편을 전송하는 집게를 사용한다. BLI을 수행하려면, 단계 3.6-3.7 위를 따르십시오. 또한, 단편을 형광 현미경을 사용하여 볼, 또는 단계 6에 기재된 유방암 세포 수 및 특성에 대한 분석을위한 인구 골수를 얻기 위해 플러싱 될 수있다.
- BLI, 피펫 형광 라벨링 비스포스포네이트 용액을 5 μL (프리 다음, 형광 현미경으로 질적 평가를 위해 그대로 단편을 제조하기 위하여뼈 조각의 광물의 spicules 레이블을 각 웰에) 제조업체의 지시에 따라 깎았 다. 또 다른 24 시간을위한 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어.
- 형광 비스포스포네이트 라벨링 용액 배양 24 시간 이후, 화상 GFP (485 ㎚) 및 비스포스포네이트 라벨 (680 ㎚)로 구성된 형광 현미경을 사용하는 페놀 레드없는 배지 뷰로 함유 조직 배양 플레이트에 프래그먼트를 전송하는 집게를 사용한다.
5. 뼈 조직 파편과 배양 된 뼈 조각 상층 액에 유방암 세포의 마이그레이션을 측정
- 뼈 조직 배양 상층 액을 향해 마이그레이션.
주 : 중으로 지정된 THR 시료로부터되도록 세 조각을 실험을 수행 상등액 3을 생성하는데 사용된다. 각 실험의 경우, 마이그레이션 뼈 상층 액 대 제어 매체만을 포함하는 세 우물을 포함하는 세 우물에서 비교된다.- 뼈 TIS를 생성웰 당 2.2 ㎖의 DMEM-10 % FBS를 함유하는 12 웰 플레이트에 뼈 조각을 배치하여 상청액 고소. 24 시간 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터 문화. 24 시간에 매체를 철회하고 2.2 ml의 신선한 DMEM-10 % FBS로 교체. DMEM-10 % FBS를 함유하는 동일한 방식으로 치료 대조군 웰.
주 : 매체는 수술로 인한 조직 외상에 반응하여 분비되는 요인을 제거하기 위해 24 시간으로 변경됩니다. 뼈 조직이 상청액에 생성되기 때문에 단지 유방암 세포 이동에 FBS의 기여도를 제어하기 위해 포함 FBS 함유 배지를 함유하는 배지를 웰 FBS 함유. - 48 시간에서, 수용기 판의 각 웰에 뜨는 / 제어 매질과 0.9 ㎖를 피펫을 모은다. 삽입은 나중에이 우물에 배치됩니다. 인서트 심는 조직 배양 인큐베이터에서 수용기 판을 인큐베이션. 주 : 나머지 상청액 (~ 증발시킨 후 1 ml)을 secretome 사실상의 분석을 위해 수집 될 수있다RS는 경우 44 원했다.
- 트랜스 웰 삽입을 시드, 표준, 빈 24 잘 조직 배양 플레이트에 배치합니다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 각 인서트의 상부, 내부 막 표면 상 DMEM-10 % FBS에서 1 × 105 유방암 세포를 함유하는 350 μL 피펫 세포 현탁액. 첨부 파일을 촉진하기 위해 45 분 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에 시드 삽입을 포함하는 24 웰 플레이트를 놓습니다.
- 셀 인서트에 부착 한 후에, 제조자의 지시에 따른 수용기 판에 인서트를 전송하는 집게를 사용한다. 각도 삽입 막 잘 뜨는 수신기 사이의 거품 형성을 방지하기 위해 잘 수신기로 배치 각 삽입. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 20 시간 동안 삽입과 수신기 판을 품어.
참고 : 삽입 막 잘 supernatan 수신기 사이의 거품에 대한 수신기 판의 바닥면을 확인t. 기포가 보이면, 특정 삽입물을 제거하고 기포가 존재하지 않을 때까지 잘 수신기에 다시 배치합니다. - 20 시간 사용 집게 후 수신기 판에서 삽입을 제거합니다. 단계 절차를 사용하여 이미지를 3.6-3.7로 마이그레이션과 수용기 판 웰의 바닥에 부착 한 세포를 BLI을 수행한다.
- 뼈 TIS를 생성웰 당 2.2 ㎖의 DMEM-10 % FBS를 함유하는 12 웰 플레이트에 뼈 조각을 배치하여 상청액 고소. 24 시간 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터 문화. 24 시간에 매체를 철회하고 2.2 ml의 신선한 DMEM-10 % FBS로 교체. DMEM-10 % FBS를 함유하는 동일한 방식으로 치료 대조군 웰.
- 뼈 조직편 향해 마이그레이션.
참고 : 중으로 주어진 THR 표본에서되도록 3 조각을 실험을 수행 3 별도의 삽입에 배치하고, 3 유리 구슬은 컨트롤과 같은 3 별도의 삽입에 배치됩니다.- 물론 각각에 0.9 ml의 DMEM-10 % FBS를 피펫 팅하여 수신기 판을 준비합니다. 삽입을 준비하는 동안 조직 문화 인큐베이터로 배치합니다.
- 인서트 시드, 뚜껑이있는 플라스틱 미세 원심 분리 관 상자의 표면에 그들을 반전. 1 × 105 유방암 세포 d에 함유 DMEM-10 % FBS의 50 μl를 세포 현탁액 방울을 피펫irectly (역 삽입에 위를 향) 각 삽입 막의 외부, 바닥 표면에. 뚜껑을 미세 원심 튜브 상자가 열려 금이 커버 및 세포 부착을 촉진하기 위해 45 분 동안 37 ° C 조직 배양기로 전송.
- 조직 문화 후드에 미세 원심 튜브 상자로 이동하고, 오른쪽면이 위로 시드 삽입을 켜고 수신기 판의 우물에 전송할 집게를 사용합니다. 각 삽입 컵에 피펫 0.450 ml의 DMEM-10 % FBS. 집게를 사용하여 각 준비 삽입 컵에 하나의 뼈 조직 조각 (~ 3mm)를 전송합니다. 선택적으로, 추가 우물에 유리 구슬에게 부정적인 컨트롤을 사용합니다. 20 시간 동안 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
- 이주를 측정하기 위해, 웰 당 1 ㎖의 DMEM-10 % FBS를 함유하는 표준 24- 웰 조직 배양 플레이트를 준비한다. 인큐베이터에서 수신기 판을 제거하고 표준 판의 별도의 우물에 각에서 삽입을 뼈 조각과 구슬을 전송하는 집게를 사용합니다. 루시페린 추가기질을 각 웰에 (300 ㎍ / ml의 최종 농도를 달성하기 위해) 및 단계 3.6-3.7의 절차를 사용하여 수행 BLI.
6. 추가 사전 및 사후 실험 분석
- 플러시 골수의 분석.
- 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 상단에 배치 된 70 μm의 셀 스트레이너로 뼈 조각을 전송. 격렬 원뿔형 튜브 내에 골수 세포의 현탁액을 수득 PBS 10 mL로 단편을 플러시 25 G 바늘 10 ㎖ 주사기를 사용한다. 원심 분리기는 세포 현탁액 300 XG에 3 분 21 ° C에 대해, 뜨는을 기음과 PBS의 펠렛 세포 또는 유동 세포 계측법에 대한 다른 원하는 솔루션을 재현 탁.
주 : 볼륨 재현 탁하고, 원심 분리하고,인가 후의 세포 펠렛의 크기에 따라 달라진다. - 생존력 분석법의 PBS ~ 75-300 μL 용량 시판 fluorescenc를 사용 적합하고, 상기 현탁액은 분석 될 수있다E 기반 생존력 분석은 제조자의 지시에 따라, 종래의 혈구에 피펫 및 반전 형광 현미경을 이용하여 세었다.
- 유세포 분석을 위해 또는 GFP 양성 유방암 세포의 검출에 기초하여, 정렬 2 % FBS, 2mM의 EDTA를 함유하는 1 ml의 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁하고, 10 농도가 1 × 106 세포 / ml이다 mM의 HEPES되도록.
- 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 상단에 배치 된 70 μm의 셀 스트레이너로 뼈 조각을 전송. 격렬 원뿔형 튜브 내에 골수 세포의 현탁액을 수득 PBS 10 mL로 단편을 플러시 25 G 바늘 10 ㎖ 주사기를 사용한다. 원심 분리기는 세포 현탁액 300 XG에 3 분 21 ° C에 대해, 뜨는을 기음과 PBS의 펠렛 세포 또는 유동 세포 계측법에 대한 다른 원하는 솔루션을 재현 탁.
- H & E 염색과 면역.
- 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 및 / 또는 면역 조직 화학 염색의 조각을 처리하기 위해 2 연필로 표지 플라스틱 카세트의 조각을 배치하고 24 시간 동안 10 % 포르말린으로 채워진 용기에 잠수함.
- 파라핀 삽입을위한 프로세스 조직 절편 각 조각 내에서 광물의 spicules를 고려하여 탈회 단계를 포함 루틴 프로토콜을 사용하여 염색.
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Representative Results
대퇴 머리에서 조직 파편을 분리
대퇴 머리는 남성과 스탠포드 의과 대학에서 정형 외과의학과 과목 고관절 교체 수술을받은 여성 환자 (나이 44~90년) 같은 수의에서 수집 하였다. 각각의 폐기 대퇴골은 광물의 spicules 및 골수 구성 소주 뼈 조직을 품고 상부 대퇴골의 작은 부분이 포함되어 있습니다. 이 조직은 작은 조각들을 추출하는 수술을 사용 rongeur 샤프트 (도 2a)의 외과 적 노출 단면을 통해 접근 할 수있다. 추출 된 부분의 조직학은 광물과 골수 구성 요소를 공개,도 2b에 도시된다. 도 2c에 도시 된 바와 같이 추출 된 부분의 외관은 골수의 지방 세포 함량에 따라 황색에서 적색에 이르는 상이한 환자로부터 수득 대퇴골, 걸쳐 변한다. W즉 루시 페라 EGFP 발현 설계 유방암 세포 동적 상호 작용을 측정하기 위해 단기 분석법 이러한 골 조직 단편의 사용을 입증한다.
인접한 뼈 조각에 공동 배양 유방암 세포 생물 발광 이미지를 사용하여 유방 세포의 증식을 측정하는
BLI를 이용한 유방암 세포 증식을 측정하는 고정화 뼈 조각에 인접한 공동 배양하는 MDA-MB-231-fLuc-EGFP 유방암 세포 배양 플레이트 셋업은도 3a에 도시되어있다. 뼈 조각의 부재가도 3c에 도시되어 대 24 시간에 플레이트 BLI는 존재하에 강화 된 세포 증식을 보여주는,도 3의 실험에서 BLI 신호도 3b에 도시하고있다.
뼈 조각에 직접 시드 공동 배양 유방암 세포는 식민과 세포 수를 연구에
MCF-7-fLuc-EGFP (C)의 콜로니도 4a에 도시되어 24 시간을 연속적으로 측정 BLI 통해 학습 학생은 감소 파종 밀도와 관련된 신호를 보여주는 감소, 골 조직 단편에 직접 접종. 직접 시드 단편과 골 광화 구획 내의 유방암 세포의 콜로니를 공개 형광 현미경에 의해 촬상 같이 형광 시약 biphosophonate 라벨링 후,도 4B에서 48 시간을 연속적으로 도시된다. 이러한 식민지 패턴도 아세포 항체 (그림 4C와 4D)와 면역 조직 화학 염색에 대한 사후 실험적으로 처리 직접 시드 조각에 공개됩니다.
뼈 조직 파편 배양 된 뼈 조각 상층 액에 유방암 세포의 마이그레이션을 측정
뼈 조직 배양 상청액 향해 뼈 조각 내로 이주 다공성 막에 걸쳐 MDA-231-fLuc-EGFP 셀 마이그레이션 B로 검출도 5에 도시 된 바와 같이 소정의 LI THR 시편의 세 단편으로부터 유래 배양 상청액 향해 강력한 이주 패턴 제어 매질 대 골조직 상청액을 함유하는 웰로 이동을 증가 나타내는데,도 5a에 도시된다. 모든 이주 패턴이 있지만 뼈 상층 액을 향해이 강력한 마이그레이션은 대부분의 실험에서 제어 매체를 향해보다 일반적으로 크다. 주어진 THR 시편에서 뼈 조각 내로 이주 전형적인 패턴은도 5b에 도시된다.
플러시 marrows의 분석
또, 골수 세포 집락 단편에서 플러시 될 수 있음을 예시하고 흘려 유방암 세포는 유동 세포 계측법 (도 6B), BLI (도 6c)에 의해 이들 세포 중에서 검출 될 수 있고, 및 / 또는 형광 현미경 (도 6D) .
측정 생존
그림 1 : 마이그레이션 실험 설정합니다. "순방향 이송"실험에서 (A)는, 수용기 판 웰은 이전에 생성 된 뼈 조직 배양 상청액로 채워진다. DME-10 % FBS를 함유하는 인서트 컵없이 Transwell 멤브레인의 내부, 상부면 상에 시딩 유방암 세포는 세포막을 통해 이동하고 BLI에 의한 검출을위한 웰의 바닥에 부착. 
그림 2 : 대퇴골에서 조직 조각을 격리를. (A) 수술 rongeur를 사용하여 소주 뼈의 조각을 추출. (B) 조직학은 대퇴골 조직에서 추출 후 즉시 고정 조각의 광물 (흰색 화살표)과 골수 (검은 색 화살표) 구획을 표시합니다. (C), 소주 뼈 조각이 두 가지에서 추출 빨간색 대 노란색 골수 내용의 변화를 보여 대퇴골. 
도 3 : 생물 발광을 촬상하여 유방암 세포의 증식을 측정하는 골편에 인접한 공동 배양 한 유방암 세포. (A) 공동 배양 화살표로 나타낸 바와 같이 고정화 뼈 조각에 인접하는 MDA-MB-231-fLuc-EGFP 유방암 세포에 대한 배양 플레이트 셋업 : 셀 스폿 (블루), 골 왁스 (블랙), 및 뼈 조각 (적색 ). 골 왁스의 위치는 검은 점선 원으로 주목된다. 판은 매체의 추가되기 전에 표시됩니다. 상위 3 우물은 24 시간에서 판의 뼈 왁스 만. (B) BLI를 포함하는 뼈 왁스 및 하단 세 개의 우물에 닿는 뼈 조각이 포함되어 있습니다. MDA-MB-231-fLuc-EGFP 셀에 대한 BLI 신호 (C) 정량 (부재 대 존재 (자주색 바)에 녹색 막대를 성장) THR 바와 같이 배양 표본으로부터 세 단편. 대 3 컨트롤 우물 - 각 THR 시편의 경우, 바 3 조각 함유 걸쳐 측정 된 평균 BLI의 값을 나타냅니다. 이 결과는 뼈 조각의 부재 대 존재하에 높은 수준의 증식을 보여준다. 오차 막대는 표준 오차 (P <0.01)를 나타냅니다. 허가 (44) 재현. 
도 4 : 뼈 조각 상에 직접 파종 유방암 세포의 검출. 24 시간에서 BLI 의해 검출 뼈 조직편에 직접 접종 MCF-7-fLuc-EGFP 셀 (A) 콜로니는, 48 시간 포스트 시드에서. 직접 시딩 단편 (B)을 감소 파종 밀도와 연관된 신호를 감소 및 표시 형광 biphosophonate 시약 24 시간 후 라벨. 형광 현미경은 EGFP + 유방암 세포로 밝혀sociated 광물 골편 (녹색 화살표)와, 그리고 골수 실 (흰색 화살표)에서 지방 세포. 이러한 식민지 패턴은 72 공동 문화 (C)의 시간과 (D)를 다음 AE1 / AE3 팬 - 아세포 항체를 사용하여 면역 조직 화학 염색에 대해 처리 직접 시드 조각에 공개됩니다. 화살표로 표시된 (C) 아세포 양성 유방암 세포에서, 골수, 지방 세포 구획에 인접 관찰된다. IN (D) 아세포 양성 유방암 세포는 광물 골편 부착이 관찰된다. (C)와 (D)의 재생 권한 44. 
도 5 :. 뼈 조직의 단편과 뼈 조각 배양 상청액에 유방암 세포의 이동을 측정 마이그레이션 MDA-MB-231뼈 조직 배양 상청액 향해 BLI 24 시간을 연속적으로 검출 된 뼈 조각 내로 다공질 이주 막 걸쳐 -fLuc-EGFP 세포. (A) BLI 신호는 주어진 THR 유래의 배양 상청액을 향해 이동이 제어 매질 대 시편 향상된 드러내는. (B ) 단일 THR 시험편 3 뼈 조각 내로 유방암 세포의 이동 패턴을 보여 BLI 신호. 뼈 조직 절편 점선 흰색 동그라미로 나타낸다. 유리 구슬을 포함하는 제어 우물은 하단에 표시됩니다. 
그림 6 :.. 플러시 marrows의 식민지 조각에서 플러시 된 marrows에서 MDA-MB-231fLUC-EGFP 세포의 검출 (왼쪽)이없는 (A) 파편 BLI 의해 검출 (오른쪽), 유방암 세포를 식민지와 (B) 분석 F에 의해 조각 (A)에서낮은 세포 계측법. EGFP 양성 유방암 세포는 BLI 양성 조각에서 플러시 골수에서 발견하지만,이 아닙니까 BLI 음성 조각. BLI 양성 조각에서 플러시 골수의 문화로 인한 유방암 세포의 콜로니 (C) BLI 검출. 골수 세포의 분야에서 MDA-MB-231fLUC-EFGP 셀을 도시 BLI 양성 단편에서 플러시 골 구획의 (D) 형광 현미경. 
그림 7. 생존 능력을 측정의 생존 4 THR에서 분리 된 조직 조각에서 플러시 골수 세포에 대한 수집 후 즉시 시편 24, 48, 72 시간 및 DMEM-10 % FBS 문화의 육일. 보통 24, 72 시간에 바뀌었다.
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Discussion
메라 등. 이전 고품질 조직을 드러내는 전이성 프로세스 (47)을 연구하는 자가골 샘플의 사용의 유효성을 검사, 부검시 수확 전이성 전립선 암 환자의 사후 수집 및 뼈 시료 분석을 설명 하였다. 여기에 우리가 수집, 처리 및 유방암 세포의 이동, 정착 및 확산을 연구하는 단기 공동 문화 시스템에서 THR 수술 후 폐기 대퇴골에서 얻은 인간의 뼈 조직 조각을 사용하는 프로토콜을 설명했다. 약 30 만 고관절 교체 수술은 미국 (정형 외과 의사의 미국 아카데미; Orthoinfo.aaos.org)에서 매년 실시하고 있으며, 이들 표본은 일반적으로 폐기됩니다. 수술이 가장 빈번한 나타내는 지표 관절통 결과 대퇴골을 덮는 연골 표면의 점진적인 파괴로 이어지는 고관절의 골관절염이다. 고관절 replacem 중ENT 수술은 위 대퇴골의 작은 부분은 대퇴골과 함께 제거된다. 대퇴골 유방암 전이 48의 일반적인 사이트이며, 이들 표본은 소주 뼈 조직, 전이성 유방암 세포 집락의 사이트를 포함합니다. 엉덩이 교체를 받아야 대부분의 환자들은, 피크 유방암 발병률의 년을 괄호 연령 범위 50-80년 나이. 따라서, 이들 조직은 유방암 뼈 전이 틈새를 연구하기위한 가치있는 자원을 구성한다.
이러한 기술과 관련된 몇 가지 중요한 단계 및 고려 사항이 있습니다. 첫째, 좋은 품질의 수술 ronguer 반대, 장갑을 낀 손으로 대퇴골의 머리를 들고있는 동안 작은 소주 뼈 조각을 추출하기위한 필수적이다. 그들은 광물의 spicules를 포함 섬유주 조직을 추출 할 수있을만큼 튼튼하지 않기 때문에 집게가 작동하지 않습니다. 상기 분석 방법의 또 다른 중요한 고려 사항은 유방암 세포주 처리 및 계대,이 특별히에 관한마이그레이션 분석에 관해서 내는데. 트립신 절차에 장기 통로 및 / 또는 변화는 잠재적 실험에서 철새 응답을 변경, 더 / 덜 끈기 세포 집단의 순차적 인 선택으로 이어질 수 있습니다. 또 다른 문제는 다른 나이 및 질병 상태의 환자들로부터 얻은 조직의 외과 적 가변성 주어진 실험의 표준화에 관한 것이다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 모든 변수가 중으로 테스트하는 내 주제 실험 설계를 사용 (예를 들어, 세 조각 / 실험 우물 대 세 조각 / 제어 우물에서) 주어진 환자의 수술 표본에서 조각을 사용하여. 변수는 다수의 환자 검체에 이러한 설계를 사용하여 테스트 및 데이터는 반복 실험을 통해 평균화 위해 짝 t 검정을 이용하여 통계적인 유의성을 분석 및 / 또는 내 피험자 일방향 ANOVA 반복 실험을 통해 데이터를 수있다. 그리고 마지막으로,이 방법의 주요 제한은 viab의 짧은 창입니다이식편 문화 동안 ility.
우리의 측정은 골수 흡인 (49)로부터 얻을 가능성 측정을 유지하고, 수집의 날에 90 % ~의 골수의 생존을 밝혔다. 우리가 광물 구획의 생존 능력을 측정하지 않았지만 시간이지나면서, 그러나, 우리는 하루 (6)에 의해 생존의 극적인 손실, 일, 둘, 셋을 통해 점진적 하락을 관찰, 질적 관찰의 생존 능력에 유사한 감소가 있다는 것을 시사 그림 4D에서와 같이 뼈 라이닝 조골 세포와 골 세포,. 이 실험을 바탕으로, 우리는 48 또는 72 시간에 걸쳐 수행 단기간의 연구에 우리의 문화 실험을 제한했다. 예비 실험 (포함되지 않음) 가능성이 골수 세포를 유지하기 위해 공식화 상업적으로 이용 가능한 미디어를 사용하여 개선 될 수 있음을 지적했다. 그러나 우리는이 실험에서 골수 세포 집단을 특징으로하지 않은, 그리고 알 수없는 경우 선택에서 개선 된 생존 결과특정 골수 세포 개체군의 파생물. 서스테인 이러한 이식편의 생존을 연장 프로토콜 개발이 모델 시스템을 향상시키는 데 중요하다.
모니터링 뼈 미세까지, 2) 접근성 자가골 미세 환경을 구성하는 중요한 세포 유형을 은닉 한) 본래 3 차원 조직 :이 모델은 짧은 시간 기간으로 제한되지만, 다른 방법과 관련된 주요 장점은 다음과 같은 특징을 포함 과가 혼란 동적 상호 작용, 3) 복제 실험 표본 당 조각의 높은 숫자, 4) 낮은 비용은 동물 모델에 비해.
우리는 뼈 유방암 전이 연구를위한 분석을 설명 하였지만, 이들 시험편과 접근 용이 전립선 암뿐만 아니라 다른 뼈의 병변 등의 다른 뼈 찾는 연구 악성 종양에 확장 될 수있다. 우리는 그렇게으로 주로 폐기 대퇴골을 사용했지만조직 절편은, 나아가,이 시편은 또한 전통적으로 젊은 자원자로부터 골수를 통해 수집되는 인간 골수, 추가의 소스를 구성한다. 우리는 생물 발광 및 형광 설계된 세포주를 이용한 방법을 설명 하였다 동안 이들 세포주 및 / 또는 이미징 플랫폼을 사용할 수없는 경우, 그리고 마지막으로, 대부분의 절차는 다른 세포와 함께 사용하도록 변형 될 수있다.
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Acknowledgments
이러한 연구는 대체 연구 개발 재단 (107588), 국립 보건 연구소 (1U54CA136465-04S1) 및 캘리포니아 유방암 연구 프로그램 (201B-0141)에서 보조금에 의해 부분적으로 자금을 지원했다. 우리는 박사 감사합니다. 의 관대 한 기부에 대한 앤드류 윌버와 R. 스콧 McIvor 자신의
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
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