एक<em> इन विट्रो</em> अस्थि मज्जा में एस्ट्रोजन के प्रति संवेदनशील स्तन कैंसर की निद्रा आदर्श: आणविक तंत्र स्टडीज और परिकल्पना पीढ़ी के लिए एक उपकरण
Summary
We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.
Abstract
The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.
Introduction
बीमारी के रूप में जल्द ही छोटे ट्यूमर रक्त वाहिकाओं 2,3 विकास के रूप में, पता लगाने योग्य है 1 पहले स्तन कैंसर की कोशिकाओं को अस्थि मज्जा को metastasize। मेटास्टैटिक प्रक्रिया तेजी लेकिन अक्षम है। प्रकोष्ठों 4 दिन प्रति लाखों में, तेजी से नए रक्त वाहिकाओं में प्रवेश लेकिन कुछ दूर के अंगों से 5 यात्रा जीवित रहते हैं। फिर भी, कुछ micrometastases हड्डी में जीवित रहने और एकल कक्षों या नव निदान रोगियों 1 से अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस में छोटे सेल clumps के रूप में पाया जा सकता है। इन कोशिकाओं को उन्हें 6 को नष्ट करने का बहुत उद्देश्य के लिए प्रशासित किया जाता है, जो सहायक कीमोथेरेपी, विरोध। यह प्रतिरोध अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट 7,8 के साथ बातचीत के द्वारा शुरू किए गए संकेत अस्तित्व से, काफी, संपन्न होता है। Micrometastases स्थानीयकृत स्तन कैंसर के साथ महिलाओं के बारे में एक तिहाई में पाया जाता है और univariate विश्लेषण 9 से विश्लेषण किया जब अस्तित्व की एक स्वतंत्र सूचक का प्रतिनिधित्व किया जा सकता है। कुछ micrometastases विकास की पहल की हैं, लेकिन पुनरावृत्ति पैटर्न सेल प्रकार पर निर्भर करते हैं। ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर के रोगियों निष्क्रिय राज्य से अधिक गरीब नियंत्रण, सुझाव है 1 से 4 साल के बीच दुबारा होना चाहते हैं। ईआर / पीआर + कोशिकाओं सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं, पुनरावृत्ति 10 की एक सतत, निरंतर दर के साथ, अप करने के लिए 20 साल के लिए निष्क्रिय रह सकता है। ईआर + और ईआर स्तन सेल लाइनों और ट्यूमर के बीच निद्रा जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर में मतभेद अलग निद्रा क्षमता 11 को प्रतिबिंबित करते हैं, अस्थि मज्जा स्ट्रोमा के साथ बातचीत की संभावना निद्रा लिए एक महत्वपूर्ण योगदान का प्रतिनिधित्व करते हैं।
micrometastases दुर्लभ हैं और 10 से अधिक 6 गुना से hematopoietic कोशिकाओं द्वारा outnumbered रहे हैं क्योंकि इन विवो में निद्रा का अध्ययन असाधारण मुश्किल है। इसलिए, प्रासंगिक मॉडल तंत्र का सुझाव और vivo में परीक्षण योग्य परिकल्पना उत्पन्न कर सकते हैं कि इन विट्रो डेटा उपलब्ध कराने में है कि उत्पन्न किया जाना चाहिए। Mathe सहित निद्रा मॉडलों के एक नंबर,matical मॉडल 12,13, इन विट्रो मॉडल 7,8,14,15, vivo xenograft मॉडल 16, इन विट्रो का संयोजन और xenograft मॉडल 17,18 और सहज ट्यूमर और मेटास्टेसिस मॉडल 19, कैंसर सेल निद्रा 20 में कुछ अंतर्दृष्टि झुकेंगे । इन मॉडलों में से प्रत्येक अपनी सीमाएं हैं और खुद की आणविक संकेत और निद्रा अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक मॉडल में परीक्षण किया जाना है कि सरकार बातचीत के बारे में परिकल्पना पैदा करने के लिए मुख्य रूप से उपयोगी होते हैं।
निद्रा के आणविक तंत्र, ईआर + कोशिकाओं में पुनरावृत्ति में परिणाम है कि चक्र गिरफ्तारी, redifferentiation और चिकित्सीय प्रतिरोध और तंत्र में यह परिणाम है कि microenvironment के साथ बातचीत को परिभाषित करने के समग्र लक्ष्य के साथ, हम में से प्रासंगिक तत्वों चयनित प्रदान करता है एक में इन विट्रो मॉडल विकसित स्ट्रोमल माइक्रोएन्वायरमेंट 7। इसके कम्पो में जबकि अपेक्षाकृत विरल यह मॉडलnents, निद्रा के महत्वपूर्ण कार्यों को प्रभावित करने वाले विशिष्ट आणविक तंत्र प्राप्त करने के लिए जांचकर्ताओं को अनुमति देने के लिए पर्याप्त रूप से मजबूत है। इन प्रयोगों सीधे vivo में परीक्षण किया जा सकता है कि परिकल्पना उत्पन्न करते हैं। मॉडल हम निद्रा में प्रासंगिक हो प्रदर्शन किया है कि कुछ महत्वपूर्ण तत्वों पर निर्भर करता है। वे उनकी बातचीत बुनियाद और मध्यम के घुलनशील घटक, एक फ़ाइब्रोनेक्टिन बुनियाद और बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक की उपस्थिति के साथ मुख्य रूप से है जहां एक clonogenic घनत्व में एस्ट्रोजन निर्भर स्तन कैंसर की कोशिकाओं, कोशिकाओं की संस्कृति का उपयोग शामिल है (FGF -2) मध्यम में।
हम TGFβ 22 के माध्यम से मध्यस्थता FGF-2 21 से सेल चक्र गिरफ्तारी की प्रेरण, सहित इन विट्रो में व्यवस्था है कि सरकार तंत्र, विशेषता पर निर्भर है जो एक उपकला फेनोटाइप, को PI3 Kinase 7,8 और ERK 8 और morphogenic भेदभाव के माध्यम से संकेत अस्तित्व RhoA निष्क्रियता, Integrin45, 5β1 upregulation और अस्तित्व 7,15 के लिए स्ट्रोमल फ़ाइब्रोनेक्टिन के बंधाव (चित्रा 1)। MCF 7 कोशिकाओं पर FGF-2 की इन विट्रो सेल चक्र प्रभाव सांद्रता में 10 एनजी / एमएल 21,23 के नीचे कम से कम एक प्रवेश शुरू करते हैं। तर्क यह स्तनधारी सिस्टम 24-27 की संख्या में स्तन नलीपरक morphogenesis, चक्रीय विस्तार और मंदी गवर्निंग FGF -2 अभिव्यक्ति के अस्थायी नियंत्रण पर आधारित था। हम FGF-2 नलीपरक 3 डी संस्कृति 28 में morphogenesis, और आम तौर पर मानव ट्यूमर 29 की घातक परिवर्तन के साथ खो जाते हैं कि FGF -2 अभिव्यक्ति सहित, भेदभाव को प्रेरित करता है कि प्रदर्शन किया। FGR1 की अभिव्यक्ति सभी 4 FGF रिसेप्टर्स 30 व्यक्त करने के लिए जारी रखने के लिए 29 और MCF 7 कोशिकाओं का सर्वेक्षण स्तन कार्सिनोमा में बरकरार रह गए। निद्रा के संदर्भ में, FGF-2 से निर्यात किया जाता है और यह भारी hematopoietic स्टेम सेल 33 के संरक्षण में कार्य करता है जहां अस्थि मज्जा स्ट्रोमा 31,32 पर जमा किया। हम डीईएमFGF-2 यह morphogenic भेदभाव 7 लाती है जहां मज्जा, में भी प्रचुर मात्रा में फ़ाइब्रोनेक्टिन substrata, पर सुसंस्कृत ईआर + स्तन कैंसर की कोशिकाओं में एक निष्क्रिय राज्य लाती है onstrated। मॉडल में, स्तन कैंसर की कोशिकाओं की वृद्धि हिचकते हैं, RhoGap ग्राफ के माध्यम से रो एक निष्क्रिय एक उपकला phenotype के लिए redifferentiate और घातक प्रगति के साथ integrins α5β1 lost एक्सप्रेस रहे हैं। वे Integrin α5β1 के माध्यम से फ़ाइब्रोनेक्टिन बाँध और कहा कि साइटोटोक्सिक चिकित्सा 7,8,15 (चित्रा 1) के लिए उन्हें प्रतिरोधी प्रस्तुत करना संकेत अस्तित्व को सक्रिय करें। रो वर्ग GTPases का निषेध एक निष्क्रिय phenotype के 34 प्रेरित करने के लिए पहले से प्रदर्शन किया गया है।
यहाँ हम मॉडल की स्थापना और ईआर + स्तन कैंसर की कोशिकाओं की निद्रा गवर्निंग विशिष्ट आणविक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए जांचकर्ताओं की अनुमति होगी कि विशिष्ट प्रक्रियाओं की रूपरेखा तैयार करेंगे। यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों में मॉडल के उपयोग का वर्णन करने के लिए, हम एक AKT अवरोध करनेवाला और एक PI3K अवरोध करनेवाला और एक पैन-रो अवरोध करनेवाला और एक रो kinase (रॉक) अवरोध करनेवाला के साथ रो परिवार (चित्रा 1 बी) के सभी सदस्यों के साथ PI3K मार्ग (चित्रा 1 बी) को निशाना बनाया।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे मॉडल अस्थि मज्जा में निद्रा के कई प्रमुख तत्वों के शामिल है। यह यह फ़ाइब्रोनेक्टिन, मज्जा का एक महत्वपूर्ण संरचनात्मक तत्व, FGF -2, एक वृद्धि कारक बहुतायत से अस्थि मज्जा स्ट्रोमा द्वारा संश्लेषित क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cells | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Liquid | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitor |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (green) | Molecular Probes | B607 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red) | Molecular Probes | R415 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
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