Introduction
Hastalık kısa sürede küçük tümörler kan damarlarını 2,3 geliştirmek olarak saptanabilir 1 önce meme kanseri hücrelerinin kemik iliğine metastaz. Metastatik sürecin hızlı ama verimsiz. Hücreler günde 4 başına milyonlarca hızla yeni kan damarları girmek ancak birkaç uzak organlara 5 gezi hayatta. Bununla beraber, bazı mikrometastazlar kemik hayatta ve tek hücre veya yeni tanı konmuş hastaların 1 kemik iliği aspiratlarında küçük hücreli kümeleri olarak bulunabilir. Bu hücreler, onları 6 ortadan kaldırmak çok amaç için uygulanır adjuvan kemoterapi, karşı. Bu direnç kemik iliği mikroçevresindeki 7,8 ile etkileşimler tarafından başlatılan sinyalizasyon canlılığında, esasen, sahip olduğunu. Mikrometastaz lokalize meme kanseri olan kadınların yaklaşık üçte birinde bulunabilir ve tek değişkenli analizde 9 tarafından bakıldığında sağkalım bağımsız göstergesi temsil edilebilir. Bazı micromeyıda metastaz yapmış büyüme başlatılan, ancak nüks hücre türüne bağlıdır. Üçlü negatif meme kanserli hastalar uykuda devlet üzerinde kötü kontrol düşündüren, 1 ila 4 yıl arasında tekrarlama eğilimindedir. ER / PR + hücreleri de dahil olmak üzere diğer hücre tipleri, nüks 10 sabit, sürekli oranı ile en fazla 20 yıl boyunca uykuda kalabilir. ER + ve ER- meme hücre hatları ve tümörler arasında dinlenme gen ifadesi imzaları farklılıklar farklı dinlenme potansiyelleri 11 yansıtmak iken, kemik iliği stroma ile etkileşimleri olası dinlenmesi önemli bir katkı oluşturmaktadır.
mikrometastazlar nadirdir ve 10'dan fazla 6 kat ile hematopoetik hücreler tarafından sayıca az, çünkü in vivo uyuşukluk çalışma son derece zordur. Bu nedenle, ilgili modelleri mekanizmaları önermek ve in vivo test edilebilir hipotezler üretebilir in vitro verilere sağladığı oluşturulmalıdır. MATHE içeren dinlenme modellerinin bir sayımatical modeller 12,13, in vitro modeller 7,8,14,15, in vivo ksenograft modelleri 16, in vitro kombinasyonları ve ksenograft modelleri 17,18 ve spontan tümör ve metastaz modelleri 19, kanser hücresi dinlenmesi 20 içine bazı bilgiler vermiştir . Bu modellerin her biri, kendi sınırlamaları vardır ve kendileri moleküler sinyalizasyon ve dormansi daha biyolojik ilgili modelleri test edilmesi yöneten etkileşimler ile ilgili hipotezler üretme için öncelikle yararlıdır.
Dormansinin moleküler mekanizmaları, ER + hücreleri nüks neden döngüsü tutuklama, redifferentiation ve tedavi direnci ve mekanizmalar ile sonuçlanan mikroçevresinin ile etkileşimleri tanımlayan genel hedefi ile, ilgili unsurları seçilmiş sağlayan bir in vitro model geliştirdi stromal mikroçevresinin 7. Kendi bilefleninde ise nispeten seyrek Bu model,alınan parçaları, dormansi önemli fonksiyonlarını etkileyen spesifik moleküler mekanizmaları elde etmek için araştırmacılar izin yeterince sağlamdır. Bu deneyler, doğrudan in vivo test edilebilir hipotezler üretir. Model biz dormansi ilgili olduğu gösterilmiştir birkaç temel unsuru dayanır. Bunlar etkileşimi alt tabakası ve orta çözünür bileşenler, bir fibronektin alt tabaka ve bazik fibroblast büyüme faktörünün varlığı ile öncelikle bir klonojenik yoğunlukta estrojene bağlı meme kanseri hücrelerinin, hücre kültürünün kullanımı (FGF-2) ortam içinde.
Biz, TGFβ 22 aracılık FGF-2 21 ile hücre döngüsü tutuklama indüksiyon dahil olmak üzere in vitro sistemi yöneten mekanizmalar, karakterize bağlıydı bir epitel fenotip için PI3 Kinaz 7,8 ve ERK 8 ve morfojenik farklılaşma yoluyla sinyal sağkalım RhoA inaktivasyonu integrin45; 5β1 upregülasyonu ve hayatta kalma için 7,15 stromal fibronektin ligasyonu (Şekil 1). MCF-7 hücreleri üzerinde FGF-2, in vitro hücre döngüsü etkileri konsantrasyonlarda 10 ng / ml 21,23 altında en az bir günlük başlar. mantık memeli sistemlerinde 24-27 bir dizi meme kanalı morfojenezi siklik genişleme ve durgunluk yöneten FGF-2 ifadesinin zamansal kontrol dayanıyordu. Biz FGF-2 duktal 3D kültür 28 morfogenez ve genellikle insan tümörlerinin 29 malign transformasyonu ile kaybolur FGF-2 ifadesi de dahil olmak üzere, farklılaşmasını uyardığı gösterilmiştir. FGR1 ifadesi, tüm 4 FGF alıcılarını 30 ifade etmeye devam 29 ve MCF-7 hücreleri incelenen göğüs karsinomalarında bozulmadan kalmıştır. Uyuşukluk bağlamında, FGF-2 tarafından verilen ve ağır hematopoetik kök hücrelerin 33 korunmasında fonksiyonları, kemik iliği stroma 31,32 üzerine bırakılır. Biz demFGF-2 o morfojenik farklılaşmasını 7 indükler kemik iliğinde, ayrıca bol fibronektin Tabakasındaki, kültüre ER + meme kanseri hücrelerinde sönmüş bir devlet uyardığı belirlenmiütir. Modelde, göğüs kanseri hücrelerinin büyümesi inhibe edilir, RhoGap GRAF ile Rho A inaktive epitelyal fenotipe redifferentiate ve habis ilerlemesi ile integrinleri α5β1 lost-ekspres yeniden. Bu integrin α5β1 ile fibronektin bağlanan ve bu sitotoksik tedavi 7,8,15 (Şekil 1), karşı dirençli hale sinyal hayatta aktive eder. Rho sınıfı GTPases inhibisyonu atıl bir fenotip 34 uyarılması için, daha önce ortaya konmuştur.
Burada modelini kurmak ve ER + meme kanseri hücrelerinin dormansi düzenleyen spesifik moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için araştırmacılar izin verecektir belirli prosedürleri açıklayacağım. Burada yer alan deneylerde modeli kullanımını göstermek içinBiz bir Akt inhibitörü ve bir PI3K inhibitörü ve bir pan-Rho inhibitörü ve bir Rho Kinaz (ROCK) inhibitörü ile Rho ailesi (Şekil 1B) tüm üyeleri ile PI3K yolu (Şekil 1B) hedef aldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. clonogenic Deneyi
- Adımları kullanarak MCF-7 ve T47D hücreleri aşağıda belirtilen estrojene bağlı meme kanseri hücre çizgilerinin bir tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması
- MCF-7 ya da T-47D hücreleri ile en fazla% 50 konfluent bir 10 cm'lik bir doku kültürü kabı kültür ortamı (DMEM /% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu / glutamin ve pen / strep) aspire. PBS ile durulayın. 1-4 dakika boyunca, 37 ° C'de% 0.25 / 2.21 mM EDTA DMEM yüksek glukoz içinde çözüldü tripsin kuluçkalayın.
- Tek bir hücre dağılımı sağlamak için faz kontrast mikroskop altında 1 dakika aralıklarla hücreleri kontrol edin. Hemen hemen değişmez, tek hücre durumunu elde etmek için, hücre-hücre teması bozmak için birkaç kez pipetleme ve aşağı 2 mi pipet ile tekrar süspansiyon hücreleri.
- Inkübasyon sadece 2 dakika sonra, hücre kümeleri gözlemlemek halinde en fazla 4 dakika boyunca 37 ° C'de tripsin hücreleri inkübe devam edin. Onlar e yapışık kalırsa clonogenic çalışmalar için bu hücreleri kullanmayıntrypsinization 4 dakika sonra diğer ach hata koloni sayısı veriminde tanıtılacak çünkü.
NOT: Hücreler clumped ise, oluşan kolonilerin sayısı kuluçkaya sayısından daha az hücre ürünü yansıtacaktır. Hücreler aşırı tripsinize edilir ise, bunların klonojenik potansiyeli azalabilir. - Için gerekli olan tüm birimi ihtiva eden bir ana tüp içinde seri seyreltmeler ile, (hücre türü ya da geçiş sayısına bağlı olarak, + 500 hücre / ml) 24 yuvalı plakalar ya da daha az, / ml kültür ortamı 1500 hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak deneyde tüm değişkenler.
Not: Amaç 800 hücre / cm2 (yaklaşık 500 1.100 hücre / cm2 aralığında) bir nihai hücre yoğunluğu. amacı, nispeten kolay sayma izin veren, yaklaşık 100 ± 50 koloniler elde etmek için olan engellerse ve koloniler artan ya da deneysel perturba azalmıştır zaman istatistiksel olarak anlamlı farklar ile sonuçlanması için yeterli koloniler izin verirleri.
- Adımlar Kullanma Clonogenic Yoğunluk inkübe Hücreler Aşağıda Outlined
- 1500 hücre / ml'lik bir ana tek bir hücre süspansiyonu tüp / oyuk 1500 hücre klonojenik yoğunlukta 24 yuvalı fibronektin kaplı plakalar üzerine dört kere ölçülen kuyucuklardaki hücreleri inkübe edin. 3 ml hazırlanması ve 2 kuyu her 1 ml ortam dağıtma ile 5 ml pipet olan hücreleri içeren bir ortam Karışım.
Not: fibronektin kaplı plakalar önceden kaplanmış satın alınması gereken bir ticari bir satıcıdan. Kontrollü bir kalite dışında Kaplama tabaklar, pürüzlü bir yüzeyde otomatik işlem sonuçları bu deney için elverişsiz. - , 5 ml pipet ile pipetleme ve aşağı süspansiyon karıştırın hücre süspansiyonu 3 ml hazırlamak ve 1 ml her biri 2 kuyu doldurun. Tek pipet herhangi bir anda sadece 2 kuyu doldurun. Aşağı yukarı pipetleme ve tekrar ana tüp içinde hücre süspansiyonu pipet tekrar süspansiyon hücreleri kalan hacim dönün ve başka bir 2 wel doldurmak için başka 3 ml hazırlamak1 ml her biri ls.
NOT: Hücreler sürekli tortu çünkü ana borusunun sürekli karıştırma gereklidir. Sadece 2 kuyu doldurmak için yeterli sesini Çizim hücrelerin yanı sıra pipet tortu, çünkü her bir kuyunun benzer hücre sayıları eklemek gerekir. - Izin hücreler clonogenic potansiyel (yayınlanmamış gözlemler) modüle edecek oda sıcaklığında ve CO 2 konsantrasyonunda süspansiyon oturup çünkü hücrelerin geniş hacimli dağıtmak için hızla çalışın.
- Koloni deneyleri için kuyulara içine pipetleme eylemi sırasında hücrelerin mekansal dağılımını optimize edin. Yavaş yavaş kuyunun ortasına nihai hücre konsantrasyonu içeren süspansiyonu pipetleme bunu. Hücreler dibe önce hareket ilerletmek için plaka maruz bırakmayın. Dairesel karıştırma etkin bir 6 gün iyi yaratarak yüksek hücre yoğunlukları ve sayılamayan konfluen kolonilerinin çevresine hücreleri santrifüj çünkü plaka girdap etmeyin.
NOT: Bu tüm süspansiyon hücreleri ile ses tanıttıktan sonra hiçbir karıştırma daha az tercih edilir çünkü gerekli olmadıkça karıştırmayın. Bu hücrelerin karışımı için gerekli ise, düz bir yüzeye duruyor ise dik yönlerde ileri geri hareket ettirerek plakayı bunu. - 6 gün süre ile ortam değişikliği olmadan, 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe hücreleri. iyi 6 gün sonra hücrelerin sayısının az ölçüde besin veya sitokin kompozisyonu ne de orijinal ortamın pH etkisi olmayacaktır.
- Analiz aşağıda belirtildiği gibi zaman sürecini Tasarım: 1 ml taze ortam ve taze ortam içeren ortam, mevcut yerine 1. günde fibronektin kaplı alt tabakalarının üzerinde hücrelerin inkübe FGF-2 aşağıdaki 6. günde 0. günde Leke hücreleri üzerinde 10 ng / ml 1.4). ) 1.3 olarak aşağıda, 3. günde herhangi bir deneysel tedirginlikler yürütün.
- 1500 hücre / ml'lik bir ana tek bir hücre süspansiyonu tüp / oyuk 1500 hücre klonojenik yoğunlukta 24 yuvalı fibronektin kaplı plakalar üzerine dört kere ölçülen kuyucuklardaki hücreleri inkübe edin. 3 ml hazırlanması ve 2 kuyu her 1 ml ortam dağıtma ile 5 ml pipet olan hücreleri içeren bir ortam Karışım.
- Moleküler Sinyali veya Adezyon Molekülleri Kurma Deneysel pertürbasyonlarının
- 3 gün, 100 eklemek56; kuyularda 1 mi ortamına bozucu maddenin nihai amaçlanan konsantrasyonu 10x ihtiva eden bir çözeltiye, l. Karıştırma. İlave bir 3 gün için 37 ° C,% 5 CO2 inkübe hücreleri devam edin.
Not: maddeler rahatsızlık vermesini atıl durumunu desteklemek rol oynayabilir bir önleyicileri çeşitli ve yapışma moleküllerinin, reseptör veya diğer yüzey proteinleri, hücre içi sinyal yolları, moleküller, faktör, kofaktörler veya yapısal proteinlerin inhibitörleri bloke edici ajanlar içerebilir. - 6. günde leke koloniler, aşağıdaki gibi.
- 3 gün, 100 eklemek56; kuyularda 1 mi ortamına bozucu maddenin nihai amaçlanan konsantrasyonu 10x ihtiva eden bir çözeltiye, l. Karıştırma. İlave bir 3 gün için 37 ° C,% 5 CO2 inkübe hücreleri devam edin.
- Leke Koloniler
- % 2 etanol / 10 mM sodyum borat taze yapılmış bir% 0.1 kristal violet (pH 9.0) çözeltisi ile kültür içinde 6 gün sonra leke hücreleri. Aspire ortam ve 20 dakika boyunca her bir göze bir ml kristal viyole çözeltisi ilave edilir.
- Bir buz kovası içine dar bir açıyla aşağı bakacak kuyu açıklıklar sürekli çalışan musluk ile taşan onları daldırarak plakaları yıkayınlavabo su. Kez sualtı yatay açı plaka yatırın kuyuya açarak ve bir yumuşak akan hareket çıkarırken daha sonra bir dar açıda geri yatırın.
- Kuyuların dibinde su artık mavi olana kadar daldırma 2 ya da 3 kez tekrarlayın. Güçlü yıkama sayma ve veri hata önemli ölçüde katkı, deneysel müdahale daha az yapışkan olan hücreler ya da koloniler kaldırabilir.
- Baş aşağı bunlara karşılık gelen etiketli kapakları bitişik tezgah üstünde havlu yerleştirerek gecede Kuru plakalar.
- Koloni Sayısı
- İnkübasyon, boyama ve kurutma her iyi sonra 6 gün büyüyen ve uykuda kolonilerin sayısını. Bir ters faz kontrast mikroskop optimal 40X büyütmede kolonileri sayın. Hücreler büyüdükten büyük expa kıyasla çok büyük boyutta morfolojik görünüşü ile, büyüyen ve 12 ya da daha az hücre koloniler olarak> 30 hücre kolonileri sayınBüyük sitoplazmalı NDED sitoplazma Şekil 1'de 7,15 gösterilen oranları, çekirdeğe.
NOT: basit uyuşukluk tayinlerde çok sık değil gibi 13-29 hücre kümeleri normal sayılmaz. Tedirginlikler ya büyüyen ya da durağan hücrelerin büyüme potansiyelini vardiya halinde Onlar sayılabilir. Bu sonuçlar, daha sonra biyolojik öneme sahip ilişki gerekecektir.
- İnkübasyon, boyama ve kurutma her iyi sonra 6 gün büyüyen ve uykuda kolonilerin sayısını. Bir ters faz kontrast mikroskop optimal 40X büyütmede kolonileri sayın. Hücreler büyüdükten büyük expa kıyasla çok büyük boyutta morfolojik görünüşü ile, büyüyen ve 12 ya da daha az hücre koloniler olarak> 30 hücre kolonileri sayınBüyük sitoplazmalı NDED sitoplazma Şekil 1'de 7,15 gösterilen oranları, çekirdeğe.
İmmünofloresan Çalışmaları 2. clonogenic Kuluçka
- Sayılar / 24 yuvalı deneylere benzer bir yüzey alanı hücre karşılık, 6 oyuklu plakalarda / oyuk yaklaşık 7,500-8,000 hücrelere hücre sayısını ayarlar.
- Hücre eklenmesinden önce görüntüleme çalışmaları için 6 oyuklu plakaların her bir oyuğa tabanına yuvarlak steril, fibronektin kaplı kapak kayma yerleştirin. ) 1.2 yukarıda clonogenic deneyler için tarif edildiği gibi, her kuyuya 3 ml hacminde Pipetleyin hücreleri konsantrasyonlarda bir anda 2 kuyu, ana hatlarıyla.
- Inkübe hücreleriYukarıdaki 1.2.4 ve 1.2.5, 6 gün için. 1,3 koloni deneyi prosedürleri de tarif edildiği gibi), 300 ul hacminde 10 x konsantrasyonda günde 3 bozucu etkenler ekleyin.
- Antikorlarla 6. günde Leke hücreleri, örneğin integrinler α4, α5, α6, β1, β3, örneğin fokal yapışma karmaşık moleküllerdir FAK, paxillin ve vinkülin olarak hücre yapıştırma moleküllerine, örneğin α-tubulin motilitesinde karışan proteinler, örneğin, fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, örneğin, ya da uyuşukluk rolü için araştırmanın hedefi, doğrudan ya da dolaylı olarak ilişkin standart teknikler kullanılarak, herhangi bir başka protein gibi sinyal yolu üyeleri immünofloresan boyama.
- Aseton forseps gün 6. Fix slaytları çıkarın / metanol 1: 1 -20 ° C'de 20 dakika ve kuru hava için ° C. Alternatif bir sabitleyici, gerektiğinde paraformaldehid gibi, kullanılabilmektedir. 2 dakika f% 0.1 Triton X-100,% 0.1 sodyum sitrat ile Permeabilize hücrelerihücre içi antijenlere ya da tespiti. Hücrelerin PBS ile yıkayın.
- Dolaylı immunofluorecence boyama,% 5 BSA ile oda sıcaklığında 1 saat süre ile ya da ikincil bir antikor elde edildiği türe% 10 preimmün serum blok slaytlar için.
- Yol üyeleri veya PBS içinde üretici tarafından tavsiye edilen özel dilüsyonları seyreltilmiş uyuşukluk rolü için araştırmanın hedefi olan herhangi bir başka protein sinyalizasyon, yapışma molekülleri, fokal moleküllerin hücre primer antikorlar ile 4 ° C'de gece boyunca inkübe% 0.1 TRİTON X- -100.
- 3 kez PBS ile yıkayın. 2 st için oda sıcaklığında florofor-konjuge antikor ile kapak slipi inkübe edin. Bir örnek olarak, Alexa Fluor 488 eşek anti-fare IgG antikoru murin monoklonal primer antikorları tespit etmek için kullanılabilir. Dağı Dapi ile antifade madde kullanılarak cam slaytlar aşağı hücre tarafı lamelleri. Oje ile çevrelerinin Seal.
- Doğrudan Immünofloresan için, BSA yürütmekYukarıdaki 2.4.2) bloke 4 ° C'de gece boyunca florofor ile konjüge primer antikor ile inkübe edin. 3 kez PBS ile yıkayın. Oje ile bir antifade ajan ve Dapi ve mühür ile slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
- 4 ° C'de alüminyum folyo ve mağaza ile Kapak slayt tepsiler Görüntüleme ve fotoğrafçılık zaman kadar birkaç hafta sonra C °. 1,000x büyütmede bir kamera ile donatılmış herhangi bir floresan mikroskobik görüntüleme sistemlerini kullanarak görüntüleme ve fotoğraf hücreleri.
- Fibril aktin boyama için,% 1 sığır serum albümini (BSA), blok slaytlar, 30 dakika ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında BODIPY FL-Phallacidin (yeşil) ya da Rhodamine phalloidin (kırmızı) inkübe edilir. Bir antifade maddesi ekleyin ve yukarıdaki gibi mühür.
Moleküler Çalışmaları 3. clonogenic Kuluçka
- Western blot
- Fibronec 20.000 hücre / 60 mm levha ve 50,000 hücre / 100 mm plaka klonojenik yoğunluklarda ER + meme kanseri hücreleri, MCF-7 ya da T47D inkübekalay kaplı% 5 CO2 içinde 37 ° C'de plakalar.
- Lizatlanndan protein mg miktarlarda gerektiren moleküler çalışmalar için 75.000 hücre / 100 mm plaka biraz daha yüksek yoğunluklarda hücreleri inkübe. Western lekeleri kullanılarak molekül çalışmalar ya da Northern blotlar için RNA izolasyonu için yeterli protein toplamak için deney noktası için on plakalara kullanın.
- Hücre sayısı göre jel yükleme çok farklı büyüklükte büyüyen ve durağan hücrelerde protein ifadesini karşılaştırmak için gerekli bir ilave maddedir. Trypsinizing hücreleri toplamak ve yerine tek kenar bıçak ile hücrelerin kapalı kazıma Western lekeleriyle için lizatları hazırlanması için% 0.2 Tripan Mavi bir hemositometrede bir kısım saymak.
- Santrifüj hücreler 2 dakika için 10,000 x g'de, aspirasyon ile ortamını çıkarın 200 ul liziz tamponu ilave lizis tampon hücreleri sonikasyon ve protein konsantrasyonu belirlenir.
- Hücrelerin sayısına göre protein verimi bölünmesiyle hücre başına protein miktarını hesaplayıno miktarda üretilir. Eşdeğer hücre sayıları temsil protein) eşdeğer miktarlarda ve B) protein miktarları hem de temsil eden ayrı bir poliakrilamid jeller her kuyuya lizat yükleyin. En az 25 ug protein, her bir kuyunun içine yüklenmiş olması gerekir.
NOT: Bu boyut ve protein içeriği (şekil 1) önemli ölçüde farklı olan büyüyen ve uykuda hücreleri arasında karşılaştırmalar izin verir.
- Akış sitometrisi
- 3.1 gibi, tripsinizasyon ile 100 mm tabak hücreleri toplamak ve 2.4 de tarif edilen hücre içi ya da hücre dışı antijenlere ya birincil veya ikincil immünofloresan boyama ile (FACS) protokollerini ayırma, standart floresan aktive hücre tarafından analiz eder.
Not: Antikor etiketleme ile belirlendiği gibi tripsinizasyon ile doku kültürü plakalarından hücrelerin ayrılması membran proteinlerinin konsantrasyonu etkilemez.
- 3.1 gibi, tripsinizasyon ile 100 mm tabak hücreleri toplamak ve 2.4 de tarif edilen hücre içi ya da hücre dışı antijenlere ya birincil veya ikincil immünofloresan boyama ile (FACS) protokollerini ayırma, standart floresan aktive hücre tarafından analiz eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneyler tahlili özetlemek için yürütülmüştür. Deney zaman süreci Şekil 2A'da gösterilmiştir. Hücreler, gün -1 'de klonojenik yoğunlukta inkübe edilir, FGF-2, taze ortam içinde 0. günde ilave edilir ve boyanmış ve koloniler sayılmıştır, hücreler 6 gün kadar kültürlenir. Sistem için herhangi bir pertürbasyonlar 10 X son konsantrasyonda 100 ul hacim içinde 3. günde tatbik edilmektedir, istenen. Şekil 2B büyüyen ve atıl kolonilerin tipik bir görünüm gösterir. Büyüyen koloniler> 30 hücreler içeren ve uykuda koloniler büyük sitoplazma / çekirdek oranlarına sahip hücrelerin büyüme daha büyük birçok kez 12 ya da daha az hücre içerirler. Şekil 2C dört nüsha olarak yapılan tipik bir deneysel sonuç gösterir. , FGF-2 varlığında, klonların büyük çoğunluğu hareketsiz iken FGF-2 ilavesi olmadan hücrelerin baskın dağılımı büyüyen klonlar tarafından temsil edilmektedir.
> Şekil 3, bozucu ajanlar 3. günde Şekil ilave edildiği bir deneyin bir örneği olan "ontent bir pan-Rho önleyicisi C3-transferaz ve bir yan GTPases Rho ailesinin inhibisyonuyla atıl klonlann doza bağlı olarak engellenişini gösteren sadece metodolojiyi göstermek için sunulmuştur itibaren deney atıl klonlar ve büyüyen klonlar ilave inhibitörlerinin ED 50 değerlendirmek önleyicisi Y27632. Rho kinaz (taş). Bu deneyde, büyüyen klonlar üzerindeki etkisi tespit edilmemiştir.Şekiller 4 ve 5, tahlil atıl klonların sağkalıma önleyicilerinin kombine etkilerini değerlendirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bizim önceki çalışmalar PI3K yolu kısmen sönmüş klon 7 hayatta kalmasını inhibe PI3K ve Akt hem de bu model ve inhibisyon atıl hücrelerinde sürekli bir aktivasyon maruz olduğunu göstermiştir. Burada, ön gözlemler, gösterdi tKüçük GTPases Rho ailesinin hat spesifik olmayan inhibisyonu ayrıca kısmen sönmüş klonların hayatiyetini sürdürmesini inhibe etmektedir. Şekiller 4 ve 5'te sunulan veriler C3-transferaz ve kaya inhibitörü ile Rho familyası inhibisyonu ile, PI3K inhibisyonu ve efektörlere, AKT birini birleştiren hemen hemen tamamen, bazı durumlarda atıl klon yaşam ortadan kaldırabilir göstermektedir. Daha önce atıl klonlar PI3K inhibisyonu kalan ancak Akt'nin artık görünür yerine mezenşimal ve sıkıntılı 7 atıl bir fenotip sergiler, ancak hücrelerden oluşan olduğunu göstermiştir. Atıl klonlar hücreler olan Rho ailesi geniş C3 transferaz inhibe edilmiş ve ROCK inhibitörü ayrıca, tipik uyuyan bir görünüm kaybetmek fibrolastoid görünümleri ve kabarttı membranlar üstlenecek ve aynı zamanda (Şekil 6) sıkıntılı görünür. Bu deneyler, çok br sorgulanabilir bir model göstermekOAD şekilde tedaviye dormansi ve direnç yöneten unsurların bir anlayış elde etmek.
Şekil 1:. Mekanizmalar (A) In vitro dinlenme modeli yöneten ve FGF2 10 ng / ml 7 (100 X büyütme) olmadan fibronektin kaplı plakalar üzerinde klonojenik yoğunlukta 6 günlük bir inkübasyon sonrası büyüyen ve atıl MCF-7 klon. (B) Özet şema verileri özetleyen bu FGFR ve α5β1 paralel kararlı durum sinyal etkinleştirmek ve dinlenmesi 7 korumak için gerekli olan integrin. FGF-2 sinyal initiatesurvival ve birkaç gün sonra kararlı duruma ulaştığında integrini α5β1 7, upregüle ERK 8 ve PI3 kinaz 7 aktive G1 durması 21 ile sonuçlanan, sikline bağımlı kinaz inhibitörleri artırdığım göstermektedir. İkili sinyal ThrougPI3K vasıtasıyla ve bağımsız olarak fibronektinin integrin α5β1 ligasyonu yoluyla, H FGFR RhoA GAP GRAF 15 FAK aktivasyonunun ve membran lokalizasyonu ve aktivasyonu için gereklidir. Bu RhoA ve F-aktin (phalloidin lekeli fotomikrograf), epitel yeniden farklılaşma ve uyuşukluk 15 kortikal yeniden düzenlenmesi için bir müsamahakar kararlı devlet inaktivasyonu ile sonuçlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: in vitro dinlenme tahlilinde elemanları dinlenme tahlilinde zamansal bileşenlerinin (A) Şema.. Hücreler, bir inc bir 24 yuvalı plaka / oyuk 1500 hücrelerinin bir yüksek yoğunlukta, klonojenik yoğunlukta fibronektin kaplı doku kültür levhaları üzerinde inkübe edilirortamı, taze ortam veya ihtiva eden taze ortam maddesi ile 0. günde değiştirilir 1. günde, 37 ° C 'de ubator ve% 5 CO2 FGF-2 10 ng / ml ve hücreler, yeniden kuluçkaya yatırılır. Lekeli görünümünü Hücreler 10x arzu edilen konsantrasyonlarda 100 ul hacim içinde 3. günde ilave edilir 6. günde herhangi inhibitörleri ya da pertürbasyon maddeler ile ilgili tarif edildiği gibi, kristal viyole çözeltisi ile boyanır ve hücreler, bir gün 6 (B) kadar yeniden kuluçkaya yatırılır büyüyen ve atıl MCF-7 kolonileri. Büyüyen koloniler> 30 hücreler içeren ve uykuda koloniler 12 veya daha az hücre içerirler. Hareketsiz hücreler büyük sitoplazma / çekirdek oranlarına sahip hücrelerin büyüme daha gözleme şeklinde birçok kez daha büyüktür. (100 X büyütme). (C), Grafik ve FGF-2 10 fibronektin-kaplı 24 yuvalı plakalar üzerinde ng / ml olmadan kuluçkalanmıştır 1500, MCF-7 insan göğüs kanseri hücrelerinin klonojenik potansiyelini sergiledi. FGF-2 olmadan hücrelerin baskın dağılımı ise FGF- varlığında büyüyen klonlar tarafından temsil edilmektedir Klonların 2 büyük çoğunluğu uykuda. Deneyler dört kat olarak gerçekleştirilmiştir. (Hata çubukları SD + olan)
Şekil 3: pan-Rho ailesi tarafından atıl klonlann doza bağlı olarak önlenmesi C3-transferaz ve kaya önleyicisi Y27632 inhibitörleri, T-47D hücreleri, FGF-2, de 24 de fibronektin kaplı plakalar başına 1000 hücre yoğunluğunda klonojenik inkübe edildi. 6 gün süre ile 10 ng / ml olmuştur. Ortam, C3-transferaz 3 ya da 5 ug / ml ve kaya önleyicisi Y27632 0.1, 1 veya 10 ug / ml 3. günde ve atıl klonlar 6. günde grafik üzerinde sayıldı lekeli atıl klonlarının bir doza bağımlı bir inhibisyon gösterir KAYA inhibitörünün bu deneyde 1 ila 10 uM iken günü 6. C3 ED50 yaklaşık 3 ug / ml idi. Deneyler dört kat olarak gerçekleştirilmiştir. (Hata çubukları SD + olan)
Şekil 4:., Bir Akt inhibitörü ile ya da durağan T-47D klonları hayatta kalma bir PI3 kinaz inhibitörü ile pan-Rho familyası önleyicisi C3 kombine etkisi, T-47D hücreleri de fibronektin 24, oyuk başına 1000 hücre yoğunluğunda klonojenik kuluçkalanmıştır 6 gün süre ile FGF-2 10 ng / ml kaplı plaklara ilave edildi. C3 ve AKT inhibitörünün kombine etkileri Bunlara ilave olarak görünmektedir Ortam, C3-transferaz 5 ug / ml, Akt 25 uM inhibitörü ve LY294002 20 uM 6 gün sayıldı tek tek ya da 3 gün ve uykuda klonlar kombinasyon halinde ilave edildi konsantrasyonlar ancak C3 ve PI3K inhibitörü kombine etkileri atıl klonu hayatta kalma inhibisyonu, bu deneylerde karşılıklı etkili oldukları görülmektedir. Deneyler dört kat olarak gerçekleştirilmiştir. (Hata çubukları SD + olan)
= "Şekil 5" src = "/ files / ftp_upload / 52672 / 52672fig5.jpg" />
Şekil 5:., Bir Akt inhibitörü ile ya da durağan T-47D klonları hayatta kalma bir PI3 kinaz inhibitörü ile ROCK önleyicisi Y27632 kombine etkisi, T-47D hücreleri, 24 gözlü fibronektin kaplı plakalar üzerinde oyuk başına 1000 hücre yoğunluğunda klonojenik kuluçkalanmıştır 6 gün süre ile FGF-2 10 ng / ml. Ortam, ROCK önleyicisi Y27632 3 ug / ml, Akt 25 uM inhibitörü ve LY294002 20 uM tek tek ya da 3 gün ve uykuda klonlar kombinasyon halinde ilave edildi 6. günde Y27632 ve kombine edilen olarak görünmez AKT inhibitörü sayıldı Bu konsantrasyonlarda, ancak Y27632 ve PI3K inhibitörü kombine etkilerini ilave atıl klonu hayatta kalma inhibisyonu, bu deneylerde, katkı maddesinden daha fazla olduğu görülmektedir. Deneyler dört kat olarak gerçekleştirilmiştir. (Hata çubukları SD + olan)
.jpg "/>
Şekil 6:. Tarif edildiği gibi C3-transferaz ve kaya inhibitörü Y27632 ile muamele edildikten sonra durgun T-47D klonlar hayatta görünümünü koloni deneyleri, FGF-2 / oyuk 1000 hücre 24 oyuklu fibronektin kaplı doku kültür plakaları içinde dört kez kuruldu, inhibitörler gösterilen konsantrasyonlarda günde 3 ilave edildi, hücreler pan-Rho ailesi inhibitörleri ile tedavi 6. Hücreler lekeli ve gününde fotoğraflanmıştır, onların yayılmasını görünümünü kaybetmiş, küçük dendritik oldu ve sıkıntılı göründü. (100 X büyütme).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim modeli kemik iliğindeki uyuşukluk birkaç anahtar unsurlarından oluşur. O fibronektin, kemik iliği önemli bir yapı elemanının, FGF-2, bir büyüme faktörü bol kemik iliği stroma ile sentezlenebilir oluşur, östrojen uzun süreler için 10 iliğinde atıl kalması muhtemel tip duyarlı hücreler, oluşmaktadır ve ağır etkileşimleri alt tabaka ile öncelikle klonojenik yoğunlukta hücrelerin kemik iliğinden 31,32 ve inkübasyon dışı matriks içinde yatırılır. Kemik iliği mikroçevresinin çok daha karmaşık olsa da, belirli mekanik sorular sormak gerektiği gibi, bu basit sistem kadar eklenen karmaşıklığı ile inşa edilebilir.
Model, bir dizi yolla hücrelerin büyüyen hücre, biyolojik teknikler, moleküler teknikler ve in vivo teknikler de dahil olmak üzere atıl karşılaştırma için kullanılabilir. Hücre fenotipleri yeniden klonlama, motilite ile tahlil edilebilirve işgali yapışmayan tümöre spesifik bloke antikorlar veya peptitler 7 kullanıyorsanız mikroçevresinin ile etkileşim için fonksiyonel çalışmalar spherule oluşumu 36 başlatarak veya tarafından, 35 inceler.
kolojenik tahlil birincil çıkış hücrelerinin büyüyen ya da uykuda clonogenic potansiyele çevirir, ya büyüyen ya da uykuda, kolonilerin sayısal sayısıdır. Yukarıda ima edildiği gibi, değişken sayıda tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için mümkün olduğu kadar sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerekir, her biri, bu sonucu, etki potansiyeline sahiptir. Bu hücrelerin kaynağı, genel olarak geçiş numarası, bir dondurarak saklama tekniği ve donduruldu hücre kültürlerinin kalitesinin, çözülme yana geçitlerin sayısını, tek hücre preparatları elde edildiği kültürün yer kaynağı ve kalite fetal dana serumu, tripsinizasyonla süreleri ve yeniden üretilebilirlik, süreOda sıcaklığında bırakıldığında hücre, her bir oyuğa, beceri olarak eşdeğer hücre sayıları pipetleme ya da eşit iyi olarak bütün yüzey alanı boyunca hücrelerin dağıtılması becerisi, sayısı bir tabak onlarca arasında, gözlem için inkübatör kaldırılır diğerleri. Genel kabul görmüş doku kültürü kalite kontrolleri temsil ek olarak, bu değişkenler deneme deneyden uykuda clonogenic potansiyeli etkiler. Intra-deneysel değişkenlik, ancak deneyden yüzde değişimleri sonucu son derece tekrarlanabilir olduğunu deneme, tipik az% 8-10 olduğunu. Tipik olarak, verilerin varyans sistemi ve bu testte yürüten harcanan zaman ile deneyci artan deneyimi direkt korelasyon ile azalmaya başlar.
Atıl ve büyüyen hücrelerde gen ifadesi RT PCR, Northern blot, Western blot, immüno-çökeltme / Batı ve fonksiyonel kompleks çökeltme / Western ile değerlendirilebilir, Immünofloresan veya immünohistokimya, Mikroakiskan tarafından çoğullama, Raman spektroskopisi, akım sitometri ve diğer teknikler. Bu teknikler, belirli bir reseptör, diğer membran proteinleri, sinyal yolağı, transkripsiyon faktörleri, histon değiştiricileri, organeller ve mitokondriyal protein, metabolik yolların ve enerji kullanımı, sayısız yollarla mikro-gerilim ve kuvvet ve etkileşim rolü belirlemek için kullanılabilir dormansi rolü.
Bizim önceki çalışmalar atıl klon 7 hayatta hem de kortikal aktin 15 epitelyal dağılımı ile atıl fenotipi muhafaza PI3K yolları için önemli roller göstermiştir. Ayrıca atıl fenotipi etkinleştirilmesi için RhoA özel olarak ise, amacıyla inhibe edilmesi gerektiğini ortaya koymuştur. Bu pan-inhibitörleri ile Rho familyası inaktivasyonu atıl klonlarının hayatta azalır Burada sunulan veriler, aksine bir. TOnun alt çizgi mekanizmaları incelemek için kimyasal inhibitörleri kullanılarak tehlikesi ve inhibe veya belirli yolları etkinleştirmek için genetik yaklaşımlar kullanılarak ihtiyacı. Bu amaçla, yöntem kalıcı transfeksiyonu veya transdüksiyonu ile ya da geçici transfeksiyon 15, siRNA veya nano-tanecikleri yoluyla hücrelerin genetik manipülasyon için çok uygundur. Bu ölçülebilir 6 gün sonra önemli bir fenotipik etkilere neden olur tahlil süresi, geçici gen ekspresyonu ya da müdahalesi 6 gün olduğu.
Girme mekanizmaları çalışmak yanı sıra dormansi çıkmak için potansiyel kabul ederek, şu anda bu hücrelerin dinlenmesi kaçmak için mekanizmalar araştırmaktadırlar. Dormansi giren çok az anlaşılmış olsa da, atıl durumdan çıkmak yöneten mekanizmaların anlaşılması daha zor olduğunu. Biz yaralı stroma inflamatuar yanıtlar dor yeniden canlanması katkıda bulunabileceğini ilk gözlemlerini bildirmiştirmant MCF-7 bu model 37 kullanılarak hücreler. Model, aynı zamanda, T-47 hücreleri bir ER + meme kanseri hücre çizgisi uygulanabilir. ER- hücreler FGF-2 yanıt olarak atıl olmazlar birlikte, sonraki araştırmalarda Farklı farklılaşma maddeleri ile diğer kanser hücre tipleri için bir yöntem adapte etmek mümkündür.
Dormansi katılan anahtar mekanizmayı tanımlamak için son derece faydalı bir teknik olmasına rağmen, in vitro bir model kalır. Bununla birlikte, uyuşukluk ya da in vitro manipülasyon geçirmiş hücreler, ksenograft tümör oluşturma kapasitesi açısından test edilebilir. Sistemin ana potansiyel yarar, ancak, son derece karmaşık in vivo dormansi modellerde test edilebilir bir hipotez geliştirilmesini izin verecek mekanizmaların belirlenmesidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Savunma Hibeler DAMD17-01-C-0343 Bölümü ve DAMD17-03-1-0524, New Jersey Eyalet Komisyonu Kanser Araştırma 02-1140-CCR-E0 ve Kanser Araştırma Ruth Estrin Goldberg Memorial (RW) tarafından desteklenen
Acknowledgments
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cells | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Liquid | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitor |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (green) | Molecular Probes | B607 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red) | Molecular Probes | R415 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
References
- Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
- Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
- Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
- Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
- Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
- Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
- Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
- Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
- Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
- Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).
- Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
- Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
- Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914 (2011).
- Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
- Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
- Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
- Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
- Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
- Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
- Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
- Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
- Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
- Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
- Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
- Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
- Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
- Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
- Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
- Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
- Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
- Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).
