Introduction
질병 빨리 작은 종양 혈관 2,3- 개발로, 검출 한 전에 유방암 세포는 골수 전이. 전이 과정은 신속한하지만 비효율적이다. 세포는 하루 4 당 수백만, 빠르게 새로운 혈관을 입력하지만 몇 원격 장기 (5)에 여행을 생존. 그럼에도 불구하고, 일부 미세 전이는 뼈에서 생존 및 단일 세포 또는 새로 진단 된 환자 1에서 골수 흡인 작은 세포 덩어리로 찾을 수 있습니다. 이러한 세포들을 6을 제거 할 목적으로 아주 반트 투여되는 화학 요법 레지스트. 이 저항은 골수 미세 환경 7,8과의 상호 작용에 의해 개시 시그널링 생존하여, 실질적으로 부여된다. 미세 전이는 지역화 된 유방암 여성의 약 1/3에서 찾을 수 있으며, 단 변량 분석 (9)에 의해 분석 할 때 생존의 독립적 인 지표를 나타낼 수 있습니다. 일부 micrometastases 성장 시작하지만 재발의 패턴은 세포 유형에 따라 달라집니다. 트리플 부정적인 유방암 환자는 휴면 상태를 통해 가난한 제어를 제안, 1~4년 사이에 재발하는 경향이있다. ER / PR + 세포를 포함한 다른 세포 유형은 재발 (10)의 안정, 지속적인 속도, 최대 20 년 동안 휴면 남아있을 수 있습니다. ER + 및 ER- 유방암 세포주와 종양 사이의 휴면 유전자 발현 서명 차이는 다른 휴지 전위 (11)를 반영하지만, 골수 기질과의 상호 작용 가능성 휴면에 크게 기여하고있다.
미세 전이가 드문 이상 10 6 -fold에 의해 조혈 세포에 의해 열세 때문에 생체 내에서 휴면의 연구는 매우 어렵다. 따라서, 관련 모델 메커니즘을 제안하고 생체 내에서 검증 가능한 가설을 생성 할 수 있습니다 체외 데이터를 제공하는 생성해야합니다. mathe 포함 휴면 모델 번호,matical 모델 (12, 13), 시험 관내 모델 7,8,14,15, 생체 이종 이식 모델 (16), 시험 관내 조합 및 이종 이식 모델 (17, 18) 및 자발적 종양 및 전이 모델 (19), 암 세포 휴면 (20)에 대한 통찰력을 수득 한 . 이러한 모델은 각각 자신의 한계를 가지고 있고 자신 분자 시그널링 및 휴면 더 생물학적으로 중요한 모델에서 시험 될 지배 상호 작용에 관한 가설을 생성하기위한 주로 유용하다.
휴면의 분자 메커니즘, ER + 세포의 재발을 초래할주기 정지, 재분화 및 치료 저항 및 메커니즘 결과 미세 환경과의 상호 작용을 정의의 전반적인 목표로, 우리는의 관련 요소를 선택 제공하는 체외 모델을 개발 간질 미세 7. 그 COMPO에있는 동안 상대적으로 드문 드문 한이 모델은,넌트는 휴면의 중요한 기능에 영향을주는 특정 분자 메커니즘을 유도하기 위해 수사관을 허용 할 수있을만큼 충분히 강력하다. 이러한 실험은 생체 내에서 직접 테스트 할 수있는 가설을 발생시킨다. 이 모델은 우리가 휴면에 관련 증명 몇 가지 핵심 요소에 의존한다. 그들은 그들의 상호 작용이 기층과 매체의 수용성 성분, 피브로넥틴 하층 및 염기성 섬유 아세포 성장 인자의 존재에 주로 클론 원성 밀도 에스트로겐 의존성 유방암 세포, 세포 배양의 사용을 포함한다 (FGF-2) 배지.
우리는, TGFβ (22)을 통해 매개 된 FGF-2 (21)에 의해 세포주기 정지의 유도를 포함한 체외에서 시스템을 제어하는 메커니즘을 특징에 의존 상피 표현형에 PI3 키나제 7,8 및 ERK (8)와 형태 형성의 분화를 통한 신호 생존 에서 RhoA의 비활성화, 인테그린45; 5β1 상향 조절과 생존 7,15에 대한 기질 피브로넥틴의 결찰 (그림 1). MCF-7 세포에 FGF-2의 생체 외 세포주기 효과는 농도 10 NG / ㎖ (21,23) 아래에 적어도 하나의 로그를 시작한다. 이론적 근거는 포유류 24 ~ 27의 숫자에 유방 유관 형태 형성, 순환 확장과 경기 침체에 적용 FGF-2 발현의 시간적 제어를 기반으로했다. 우리는 FGF-2 도관 3D 문화 (28)의 형태 형성, 일반적으로 인간의 종양 (29)의 악성 변화로 손실되는 FGF-2의 발현을 포함, 분화를 유도하는 것을 보여 주었다. FGR1의 발현은 4 FGF 수용체 (30)을 표현하기 위해 계속 (29) 및 MCF-7 세포 조사 유방암에 그대로 남아 있었다. 휴면 맥락에서, FGF-2에 의해 반출되고, 심하게는 조혈 줄기 세포 (33)의 기능에 보존 골수 기질 (31, 32) 상에 침착. 우리 민주 공화국FGF-2가 7 형태 형성 분화를 유도 골수에도 풍부한 피브로넥틴 하층, 배양 ER + 유방암 세포에서 휴면 상태를 유도함 onstrated. 모델에서 유방암 세포 성장 억제되어, RhoGap 그라프를 통해의 Rho을 비활성화 상피 표현형에 재분화 및 악성 진행과 인테그린 α5β1 lost-Express를 다시. 그들은 인테그린 α5β1 통해 피브로넥틴을 결합하고 그 세포 독성 치료 7,8,15 (그림 1)에 내성 렌더링 신호 생존을 활성화합니다. 클래스의 Rho GTP 아제 저해 휴면 34 표현형을 유도하는 이미 입증되었다.
여기에서 우리는 모델을 설정하고 ER + 유방암 세포의 휴면을 관리하는 특정 분자 세포 메커니즘을 연구하는 연구자를 허용 할 특정 절차를 간략하게 설명합니다. 여기에 제시된 실험에서는 모델의 사용을 설명하기우리의 Akt 억제제 및 PI3K 억제제와 팬의 Rho 억제제와의 Rho 키나제 (ROCK) 억제제와의 Rho 가족 (그림 1B)의 모든 회원들과 PI3K 경로 (그림 1B)를 대상으로.
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Protocol
1. 클론 원성 분석
- 단계를 이용하여 MCF-7 및 T47D 세포는 아래 설명 에스트로겐 의존성 유방암 세포주의 단일 세포 현탁액을 준비
- MCF-7, T-47D 세포를 더 이상 50 % 합류하지 10cm 조직 배양 접시에서 배양 배지 (DMEM / 10 % 열 비활성화 우태 혈청 / 글루타민 및 펜 / 패 혈성)를 대기음. PBS로 씻어. 1-4 분 동안 37 ° C에서 0.25 % / 2.21 mM의 EDTA는 DMEM 높은 포도당에 용해 된 트립신 품어.
- 단일 세포 분포를 보장하기 위해 위상차 현미경 하에서 1 분 간격으로 세포를 확인한다. 거의 불변, 단일 세포 상태를 달성하기 위해 세포 - 세포 접촉을 방해하는 여러 번까지 피펫 팅에 의해 아래로 2 mL를 피펫으로 세포를 재현 탁.
- 당신이 배양의 2 분 후 세포의 덩어리를 관찰하는 경우 최대 4 분 동안 37 ° C에서 트립신에서 세포를 배양 계속합니다. 그들은 전자에 부착 남아 있으면 클론 원성 연구에 대한 이러한 세포를 사용하지 마십시오트립신의 4 분 후에 다른 ACH는 오류가 콜로니 번호 수율로 도입 될 것이기 때문에.
주 : 세포가 응집되어있는 경우, 콜로니의 수가 배양 세포 수보다 적은 수의 제품을 반영 할 것이다. 세포를 트립신 처리 지나치게되면 그 전위는 클론 원성이 감소 될 수있다. - 필요한 전체 볼륨을 포함하는 하나의 마스터 튜브의 연속 희석하여 (셀 타입 또는 통로의 수에 따라, + 500 세포 / ml) 24 웰 플레이트, 이하 대한 / ㎖ 배지 1500 세포의 단일 세포 현탁액을 제조 실험에서의 모든 변수.
참고 : 목표는 800 세포 / ㎠ (약 500 1,100 세포 / ㎠의 범위)의 최종 세포 밀도이다. 목표는 상대적으로 쉽게 계산을 허용하는, 약 100 + 50 식민지를 얻을 것입니다 군집을 방지하고 식민지가 증가 또는 실험 perturba 감소 할 때 통계적으로 유의 한 차이가 발생하기에 충분한 식민지를 허용TIONS.
- 단계를 사용하여 클론 원성 밀도에 품어 세포는 아래에 설명
- 1,500 세포 / ml의 마스터 단일 세포 현탁액 관에서 / 잘 1,500 세포의 클론 원성 밀도에서 24 잘 피브로넥틴 코팅 접시에 사통 우물에서 세포를 품어. 3 ㎖를 그리기 2 각 웰에 1 ml의 배지를 조제하여 5 ml의 피펫 세포를 함유하는 배지를 씹다.
참고 : 피브로넥틴 코팅 된 플레이트는 사전 코팅 구입해야 상용 공급 업체. 제어 품질의 외부 도장 판은, 요철면의 자동화 된 처리 결과는이 분석을 위해 적합하지. - , 5 ㎖의 피펫와 피펫 팅에 의해 아래로 현탁액을 혼합 세포 현탁액 3 ㎖를 작성하고 1 ml를 각각 2 우물을 입력합니다. 한 피펫에서 한 번에 단지 2 우물을 입력합니다. 아래로 피펫 팅에 의해 다시, 마스터 튜브에 세포 현탁액에 피펫에 재현 탁 세포를 나머지 볼륨을 반환하고 다른 2 WEL을 채우기 위해 다른 3 ㎖를 작성1 ml를 각각 LS.
주 : 세포가 연속적으로 침강하므로 마스터 튜브의 연속 혼합이 필요하다. 단지 2 웰을 채우는 데 충분한 용적을 그리기 세포뿐만 피펫 퇴적물 때문에 각 웰에 유사한 세포 수를 추가 할 필요가있다. - 허용 세포들은 클론 원성 잠재력 (관찰되지 않은)을 변조한다 실온 CO 2 농도로 현탁액에 앉아 있기 때문에 세포의 대량 분배 빠르게 작동.
- 식민지 분석을위한 우물로 피펫 팅의 행위 중에 세포의 공간 분포를 최적화 할 수 있습니다. 천천히 웰의 중앙으로 최종 세포 농도를 함유하는 현탁액을 피펫 팅에 의해 그렇게. 세포가 바닥에 정착하기 전에 운동을 촉진 할 수있는 판을 가하지 마십시오. 원형 혼합 효과적으로 육일에서 잘 만드는 높은 세포 밀도와 셀 수없는 합류 식민지의 주변에 세포를 원심 분리 때문에 판을 소용돌이하지 마십시오.
참고 :이 전혀 현탁액 세포와 볼륨을 도입 한 후 믹싱보다 바람직하기 때문에 필요한 경우가 아니면 함께 사용하지 마십시오. 이 세포를 혼합 할 필요가있는 경우,이 평탄한 표면에 달려있는 동안 수직 방향으로 앞뒤로 이동하여 판 그렇게. - 육일에 대한 미디어의 변화없이 37 ℃, 5 % CO 2에서 세포를 품어. 도 6 일 후 세포의 수는 현저히 작은 영양소 또는 사이토킨 조성물도 원래 배지의 pH에 영향을주지한다.
- 다음과 같이 분석의 시간 코스 디자인 : 1 ml의 새로운 배지 또는 새로운 배지 함유 매체를 기존의 교체 일 1. 피브로넥틴 코팅 하층에 세포를 품어 FGF-2와 아래 하루 6 일 0 얼룩 세포에 10 ng를 / ㎖ 1.4). ) 1.3에서 다음과 같이, 3 일에 모든 실험 섭동을 실시한다.
- 1,500 세포 / ml의 마스터 단일 세포 현탁액 관에서 / 잘 1,500 세포의 클론 원성 밀도에서 24 잘 피브로넥틴 코팅 접시에 사통 우물에서 세포를 품어. 3 ㎖를 그리기 2 각 웰에 1 ml의 배지를 조제하여 5 ml의 피펫 세포를 함유하는 배지를 씹다.
- 분자 신호 전달 또는 접착 분자의 설정 실험 교란
- 3 일에 100를 추가56; 웰에 1 ml의 배지에 섭동 화제의 최종 농도의 10 배의 의도를 함유하는 용액의 리터. 혼합하지 마십시오. 추가로 3 일간 37 ℃, 5 % CO 2에서 세포를 배양하기 위해 계속합니다.
참고 : 에이전트를 교란하는 휴면 상태를 지원하는 역할을 할 수있는 억제제의 종류 및 부착 분자, 수용체 또는 다른 표면 단백질, 세포 내 신호 경로, 분자, 요소, 보조 인자 또는 구조 단백질의 억제제의 차단제를 포함 할 수있다. - 6 일에 얼룩 식민지로는 다음과 같다.
- 3 일에 100를 추가56; 웰에 1 ml의 배지에 섭동 화제의 최종 농도의 10 배의 의도를 함유하는 용액의 리터. 혼합하지 마십시오. 추가로 3 일간 37 ℃, 5 % CO 2에서 세포를 배양하기 위해 계속합니다.
- 얼룩 식민지
- 2 % 에탄올 / 10 MM의 붕산 나트륨의 갓 0.1 % 크리스탈 바이올렛 (PH 9.0) 용액과 문화 6 일 후 얼룩 세포. 기음 미디어와 20 분 동안 각 웰에 하나 ㎖의 크리스탈 바이올렛 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
- 얼음 양동이에 예각으로 아래로 향하게 아니라 구멍이 지속적으로 실행 탭 넘쳐로 몰입하여 판을 씻으십시오싱크대에 물. 한 번 수중 수평 각도 판을 기울 잘 아래로 열고, 한 부드러운 흐르는 움직임에 제거 할 때 다음 예각으로 다시 기울이십시오.
- 웰의 바닥에 물이 더 이상 청색이 될 때까지 침지 2 또는 3 회 반복하지 않는다. 활발한 세척은 계산과 데이터의 오류에 크게 추가로 인해 실험 개입에 덜 부착되어 세포 나 식민지를 제거 할 수 있습니다.
- 거꾸로 대응하는 표지 커버 옆에있는 벤치 위에 수건을 배치하여 밤새 건조 판.
- 식민지 카운트
- 배양, 염색 및 건조의 각 웰 후 6 일 만에 성장과 휴면 콜로니의 수를 계산합니다. 역 위상차 현미경에 최적으로 40 배 배율로 식민지를 계산합니다. 세포 성장, 큰 expa에 비해 매우 큰 사이즈의 형태 학적 외관, 성장과 12 이하 세포의 식민지로> (30) 세포의 콜로니를 계산큰 세포질과 nded 세포질 그림 1 7,15에 표시된 비율을, 핵.
주 :이 간단 휴면 분석에 매우 자주하지로 13-29 세포의 클러스터가 정상적으로 계산되지 않습니다. 섭동 어느 성장 또는 휴면 세포의 성장 잠재력을 이동 한 경우에는 계산 될 수있다. 이러한 결과는 생물학적 중요성과 상관 될 필요가있다.
- 배양, 염색 및 건조의 각 웰 후 6 일 만에 성장과 휴면 콜로니의 수를 계산합니다. 역 위상차 현미경에 최적으로 40 배 배율로 식민지를 계산합니다. 세포 성장, 큰 expa에 비해 매우 큰 사이즈의 형태 학적 외관, 성장과 12 이하 세포의 식민지로> (30) 세포의 콜로니를 계산큰 세포질과 nded 세포질 그림 1 7,15에 표시된 비율을, 핵.
면역 형광 연구 2. 클론 원성 배양
- 숫자 / 24 아니라 실험과 유사한 표면 영역을 셀에 대응, 6 웰 플레이트에 / 웰 약 7,500-8,000 세포에 세포 수를 조정합니다.
- 세포 또한 이전 이미징 연구를위한 6 웰 플레이트의 각 웰 기본으로 라운드, 멸균, 피브로넥틴 코팅 커버 슬립을 놓습니다. 1.2)에서 상기 클론 원성 실험 한 바와 같이 각 웰에 3 ㎖의 부피 피펫 세포 농도에서 한번에 2 웰은 설명했다.
- 세포를 품어위와 1.2.4과 1.2.5 6 일합니다. 1.3의 식민지 분석 절차에 설명 된대로), 300 μL 볼륨에서 10 배 농도에서 3 일에 섭동 요소를 추가합니다.
- 항체 6 일째 얼룩 세포는, 예를 들면 인테그린의 α4, α5, α6, β1, β3, 예를 들면, 국소 유착 복잡한 분자 FAK, paxillin 및 vinculin 같은 부착 분자를 셀에 같은 α-tubulin에 같은 운동성에 관여하는 단백질, 예를 들면, 인산화 된 Akt, 인산화 ERK, 포스 P38, 포스 JNK, 예를 들면, 또는 휴면에서의 역할에 대한 연구의 대상이 직접 또는 간접적으로 표준 기술을 이용하여, 임의의 다른 단백질로서 시그널링 경로 부재 면역 형광 염색법.
- 아세톤에 집게 하루 6. 수정을 슬라이드 / 제거 메탄올 1 : 1 -20 20 분 공기 건조를 위해 C를 °. 대안 정착액 필요할 경우 파라 포름 알데히드와 같은, 사용될 수있다. 2 분 F 0.1 % 트리톤 X-100, 0.1 % 시트르산 나트륨으로 세포 Permeabilize 하시려면세포 내 항원 또는 검출. PBS로 세포를 씻으십시오.
- 간접 immunofluorecence 염색, 5 % BSA와 함께 실온에서 1 시간 동안 또는 이차 항체가 생성 된 종으로부터의 10 % 혈청 preimmune 블록 슬라이드.
- 경로 구성원이나 PBS에 제조업체에서 권장하는 특정 희석에 희석 수면에서의 역할에 대한 조사의 대상은 다른 단백질 신호, 부착 분자, 초점 복잡한 분자를 셀에 차 항체를 4 ℃에서 하룻밤 품어 0.1 % 트리톤 X -100.
- PBS로 3 회 반복한다. 실온에서 2 시간 동안 형광체 공역 항체 커버 슬립을 부화. 예로서, 형석 알렉사 488 당나귀 항 - 마우스 IgG 항체는 뮤린 모노클 일차 항체를 검출하는데 사용될 수있다. 마운트 DAPI와 antifade 에이전트를 이용한 유리 슬라이드에 내려 셀측을 커버 슬립. 매니큐어와 둘레를 밀봉합니다.
- 직접 면역 형광의 경우, BSA을 수행위와 2.4.2에서) 차단, 4 ℃에서 하룻밤 형광체 - 복합 일차 항체에 품어. PBS로 3 회 반복한다. 매니큐어와 antifade 에이전트와 DAPI와 물개와 슬라이드를 품어.
- 4에서 알루미늄 호일 및 저장과 커버 슬라이드 트레이 영상 및 사진에 대해 언제까지 몇 주 이상으로 C를 °. 1000 배 확대 한 카메라가 장착 임의 형광 현미경 영상 시스템을 이용하여 조회 및 사진 셀.
- 근모 액틴 염색, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 슬라이드 블록을 30 분 동안 및 실온에서 20 분 동안 BODIPY FL-Phallacidin (녹색) 또는 로다 민 팔로이 딘 (적색)에서 배양. antifade 에이전트를 추가하고 위와 같이 밀봉.
분자 연구 3. 클론 원성 배양
- 서양 오 점
- fibronec에 20,000 세포 / 60mm 판과 50,000 세포 / 100mm 판의 클론 원성 밀도에서 ER + 유방암 세포 MCF-7 또는 T47D을 품어주석 도금, 5 % CO 2에서 37 ℃에서 플레이트.
- 해물에서 단백질 mg의 양을 필요로하는 분자 연구에 75,000 세포 / 100mm 판의 약간 높은 밀도에서 세포를 품어. 서양 말을 사용하여 분자 연구 또는 북부 말에 대한 RNA 분리에 대한 충분한 단백질을 수집하는 실험 포인트 당 열 플레이트까지 사용할 수 있습니다.
- 휴대폰 번호를 기반으로 젤 로딩은 매우 다른 크기의 성장과 휴면 세포에서 단백질 발현을 비교하기위한 필요한 부가입니다. trypsinizing에 의해 세포를 수집하고 대신 하나의 에지 블레이드 세포를 긁어 서양 말에 대한 해물의 준비를 위해 0.2 % 트리 판 블루에서 혈구에서 나누어지는을 계산합니다.
- 원심 셀 2 분 동안 10,000 XG에서, 흡인 매체를 제거 200 μL 용해 완충액을 추가 용해 완충액에 세포를 초음파 처리하고, 단백질 농도를 결정한다.
- 셀의 개수에 의해 단백질 수율 나누어 세포 당 단백질의 양을 계산그 금액을 생성합니다. 동등한 세포 수를 나타내는 단백질의) 상응하는 금액과 B) 단백질의 양을 모두 나타내는 별도의 폴리 아크릴 아마이드 겔의 각 웰에 해물을 넣습니다. 적어도 25 μg의 단백질은 물론 각에로드해야합니다.
참고 :이 크기와 단백질 함량 (그림 1)에서 유의 한 차이가있는 성장과 휴면 세포 사이의 비교를 허용합니다.
- 유동 세포 계측법
- 3.1에서와 같이, 트립신에 의해 100mm 판에서 세포를 수집하고 2.4에 설명 된대로, 세포 내 또는 세포 외 항원 중 하나에 대한 기본 또는 보조 면역 형광 염색법을 사용하여 (FACS) 프로토콜을 정렬 기준 형광 활성 세포에 의해 분석한다.
주 : 항체 표지에 의해 결정되는 트립신에 의해 조직 배양 플레이트로부터 세포를 분리하는 막 단백질의 농도에 영향을 미치지 않는다.
- 3.1에서와 같이, 트립신에 의해 100mm 판에서 세포를 수집하고 2.4에 설명 된대로, 세포 내 또는 세포 외 항원 중 하나에 대한 기본 또는 보조 면역 형광 염색법을 사용하여 (FACS) 프로토콜을 정렬 기준 형광 활성 세포에 의해 분석한다.
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Representative Results
실험은 분석 요점을 되풀이하기 위해 실시 하였다. 실험의 시간 코스는도 2a에 도시되어있다. 세포가 하루 -1에 클론 원성 밀도로 배양, FGF-2 새로운 배지에서 하루 0에 추가되고 그들이 염색하고 식민지가 계산 될 때 세포는 6 일까지 배양. 시스템에 대한 교란이 10 배 최종 농도 100 μL 볼륨에서 3 일에 투여 원하는. 그림 (b)는 성장과 휴면 식민지의 전형적인 모습을 보여줍니다. 성장 식민지> 30 세포를 포함하고 휴면 식민지가 큰 세포질 / 핵 비율로 세포를 성장보다 더 많은 배 12 이하 세포가 포함되어 있습니다. 그림 (c) 4 번씩 실시 전형적인 실험 결과를 보여줍니다. , FGF-2의 존재하에, 클론의 대부분이 휴면 상태 FGF-2를 첨가하지 않은 세포의 우세한 분포 성장 클론에 의해 표현된다.
> 그림 3 교란 에이전트가 날 3. 그림에 추가 된 실험의 예입니다 "ontent는 팬의 Rho 억제제 (C3)의 전이와에 의해 GTP 아제의의 Rho 가족의 억제에 의해 휴면 클론의 용량 의존적 억제를 나타냅니다 이 유일한 방법을 설명하기 위해 제시 한 이후 분석 휴면 클론뿐만 아니라 성장하는 클론에 첨가 억제제의 ED 50를 평가할 수 억제제 Y27632. Rho 키나아제 (락).이 실험에서는 성장하는 클론에 대한 효과가 측정되지 않았다.도 4 및도 5는 분석 휴면 클론의 생존율에 대한 억제제의 결합 된 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있음을 입증한다. 우리의 이전 연구는 PI3K 통로가 부분적으로 휴면 클론 (7)의 생존을 억제 PI3K 및 Akt의 모두의 모델과 억제에 휴면 세포의 지속적인 활성화를 겪는 것을 증명하고있다. 여기에, 예비 관찰, 증명 T작은 GTP 아제의의 Rho 가족의 모자 비특이적 억제는 부분적으로 휴면 클론의 생존을 억제한다. 도 4 및도 5에 제시된 데이터는 C3 트랜스퍼와 ROCK 억제제의 Rho 가족의 억제와, PI3K 억제 및 하류 이펙터, AKT 중 하나를 조합하는 것은 거의 완전히 일부 상황에서 휴면 클론의 생존을 제거 할 수 있음을 입증한다. 우리는 이전에 휴면 클론 PI3K 억제 생존 아니지만 된 Akt의 더 이상 나타나지 오히려 중간 엽 및 고민 7 휴면 표현형을 나타낼 없지만 세포로 구성되어 있음을 증명하고있다. 휴면 클론의 셀은의 Rho 가족은 크게 C3 전이에 의해 억제되었으며 ROCK 억제제는 또한, 전형적인 휴지 모양을 잃게 fibrolastoid 모습과 프릴 세포막을 가정하고 또한 (그림 6) 고민 나타납니다. 이러한 실험은 매우 BR에 조회 할 수있는 모델을 보여OAD 방식은 치료에 휴면 및 저항을 제어하는 요소의 이해를 달성하기 위해.
그림 1 :. 메커니즘이 (가) 우리의 체외 휴면 모델을 관리와 FGF2 10 NG / ㎖ 7 (100X 배율)없이 피브로넥틴 코팅 된 플레이트에 클론 원성 밀도 육일 배양 후 성장과 휴면 MCF-7 클론. (B) 요약 스키마는 데이터의 개요 그 FGFR 및 α5β1 평행 정상 상태 신호가 활성화하고 휴면 (7)을 유지하기 위해 요구되는 인테그린. FGF-2는 신호 initiatesurvival 몇 일 후 정상 상태에 도달 인테그린 α5β1 (7), 상향 조절 ERK 8 및 PI3 키나제 (7) 활성화, G1의 체포 (21)의 결과 사이클린 의존성 키나제 억제제를 상향 조절. 듀얼 신호 통해 서PI3K를 통해 독립적으로 피브로넥틴으로 인테그린 α5β1의 결찰을 통해 시간 FGFR은에서 RhoA GAP 그라프 (15)의 FAK의 활성화 및 막 지역화 및 활성화가 필요합니다. 이것은에서 RhoA와 F - 굴지 (팔로이 딘 염색 현미경), 상피 다시 분화 및 휴면 15의 대뇌 피질의 재 배열을위한 허용 정상 상태의 불 활성화가 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 : 시험 관내 휴면 분석 요소 휴면 분석의 시각 성분 (A) 스키마.. 세포는 INC에서 24 웰 판 / 웰 1500 세포의 최대 밀도에서, 클론 원성 밀도 피브로넥틴 코팅 조직 배양 플레이트에 배양배지를 신선한 배지 또는 포함하는 신선한 배지로 0 일에 교체 1 일에 37 ° C에서 ubator 5 % CO 2 FGF-2 10 NG / ml의 세포를 다시 배양 하였다. 염색의 모양 세포를 10 배, 원하는 농도에서 100 ㎕의 부피에서 제 3 일에 추가되는 일 제 저해제 또는 섭동 에이전트에 기술 된 바와 같이, 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색되어 세포 일 6. (B)까지 다시 인큐베이션 성장과 휴면 MCF-7 식민지. 성장 식민지> 30 세포를 포함하고 휴면 식민지는 12 이하 세포가 포함되어 있습니다. 휴면 세포는 큰 세포질 / 핵 비율로 세포를 성장보다 팬케이크 모양, 여러 번 더 크다. (100X 배율). (C) 그래프와 FGF-2 (10)는 피브로넥틴 - 코팅 된 24 웰 플레이트 상 / ㎖ 겨없이 인큐베이션 1500 MCF-7 인간 유방암 세포의 클론 원성 잠재력을 증명. FGF-2없이 세포의 분포가 우세한 반면 FGF-의 존재하에 성장하는 클론로 표시되는 클론의 2 대부분 휴면 있습니다. 실험 4 번씩 시행 하였다. (오차 막대는 SD를 +됩니다)
그림 3 : 팬의 Rho 가족에 의해 휴면 클론의 용량 의존적 억제는 C3 전이와 바위 억제제 Y27632 저해제 인 T-47D 세포가 FGF-2도에서 24도 피브로넥틴 코팅 된 플레이트 1,000 세포의 클론 원성 밀도로 배양 하였다. 육일 10 ng를 / ㎖. 미디어, C3 전이 3 또는 5 μg의 / ㎖, 등 록 억제제 Y27632 0.1, 1, 10 μg의 / ㎖가 3 일에 있었고, 휴면 클론 하루 6. 그래프를에 계수 하였다는 스테인드 휴면 클론의 용량 의존적 억제를 보여줍니다 바위 억제제의이 분석에서 1 ~ 10 μm의 동안 하루 6 (C3)의 ED (50)는 약 3 ㎍ / mL로했다. 실험 4 번씩 시행 하였다. (오차 막대는 SD를 +됩니다)
그림 4 :.의 Akt 억제제 또는 휴면 T-47D 클론의 생존에 PI3 키나제 억제제와 팬의 Rho 가족 억제제 (C3)의 결합 효과 T-47D 세포는 잘 피브로넥틴 (24)에 잘 1,000 세포의 클론 원성 밀도로 배양 하였다 육일에 대한 FGF-2 10 NG / ㎖으로 코팅 된 플레이트. (C3) 및 AKT 억제제의 결합 효과는 이들에 첨가제 것으로 보인다 미디어, C3 전이 5 μg의 / ㎖가 된 Akt는 25 μm의 억제제 및 LY294002 20 μm의 하루 6. 계수 하였다 개별적으로 또는 하루 3 휴면 클론에 함께 추가 된 하지만 농도 (C3) 및 PI3K 억제제의 결합 된 효과는 휴면 복제 생존의 억제에이 실험에서 시너지 효과로 나타납니다. 실험 4 번씩 시행 하였다. (오차 막대는 SD를 +됩니다)
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그림 5 :.의 Akt 억제제 또는 휴면 T-47D 클론의 생존에 PI3 키나제 억제제와 바위 억제제 Y27632의 결합 효과 T-47D 세포는 24도 피브로넥틴 코팅 된 플레이트에 잘 1,000 세포의 클론 원성 밀도로 배양 하였다 육일에 대한 FGF-2 10 NG / ㎖와. 미디어, 록 억제제 Y27632 3 μg의 / ㎖, Akt의 25 μm의 억제제 및 LY294002 20 μm의 개별적 또는 3 일 및 휴면 클론에 함께 추가 된 하루 6 Y27632의 결합 된 효과로 나타나지 않습니다 AKT 억제제에 계수 하였다 이러한 농도하지만 Y27632 및 PI3K 억제제의 결합 효과에 첨가제는 휴면 복제 생존의 억제에이 실험에서 첨가제보다 더 많은 것으로 나타납니다. 실험 4 번씩 시행 하였다. (오차 막대는 SD를 +됩니다)
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그림 6 :. 한 바와 같이 C3 전이과 바위 억제제 Y27632 치료 후 휴면 T-47D 클론 생존의 모양 식민지 분석은, FGF-2 / 잘 1,000 세포에서 24도 피브로넥틴 코팅 조직 배양 플레이트에 4 번씩 설립되었다, 억제제 표시된 농도에서 3 일에 추가 된, 세포가 팬의 Rho 가족 억제제로 치료 6. 세포를 염색 날에 촬영 된 것은, 그들의 확산 모양을 분실, 작은 돌기가되었고, 고민 나타났다. (100X 배율).
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Discussion
우리의 모델은 골수에서 휴면 여러 주요 요소로 구성된다. 그것은 피브로넥틴, 골수의 주요 구성 요소, FGF-2, 성장 인자가 풍부 골수 기질 합성 이루어져 에스트로겐 장시간 10 골수에서 휴면 가능성 유형 감수성 세포를 이루어져 무겁게 상호 작용은 주로 하층 아르 클론 원성 세포의 밀도에서 골수 31,32 배양의 세포 외 매트릭스에 침착. 골수 미세 환경을 훨씬 더 복잡하지만 특정 기계론 질문을 필요에 따라, 이러한 단순한 시스템은 많은 복잡성으로 구축 될 수있다.
모델은 다수의 방식으로 세포의 성장 세포 생물학 기술, 기술 및 생체 분자 기법을 포함한 수면과 비교하기 위해 사용될 수있다. 세포 표현형을 다시 복제, 운동에 의해 분석 될 수있다과 침략 부착되지 종양이 특정 차단 항체 또는 펩티드 7을 사용하여 미세 환경과의 상호 작용에 대한 기능성 연구를 소 구체 형성 (36)을 시작하거나하여, 35을 연구.
클론 원성 분석의 기본 출력은 세포의 성장 또는 휴면 클론 원성 전위로 변환하는 하나 또는 휴면 성장, 콜로니의 숫자 카운트이다. 위에서 암시 된 바와 같이, 변수의 다수의 재현 가능한 결과를 수득하기 위해 가능한 한 엄격하게 제어되어야한다 모두이 결과, 영향의 가능성을 가지고있다. 이러한 셀들의 소스, 전체 통로 번호, 동결 보존 기술 및 동결 보존했다 세포 배양의 품질, 해동 보낸 통로 번호를, 단일 세포 제제를 얻었다되는 배양의 합류,의 공급원과 질 소 태아 혈청, 트립신 처리의 기간 및 그 재현성 지속실온에서 방치 세포, 각 웰 기용으로 동등한 세포 수를 피펫 팅하거나 균등 웰의 표면 전체 영역에 걸쳐 세포를 분산 손재주는 횟수 플레이트 수십 중에서 관찰 용 인큐베이터에서 제거 다른 사람. 일반적으로 수용되는 조직 배양 품질 제어를 나타내는 외에, 이러한 변수는 실험 실험에서 휴지 전위 클론 원성에 영향을 준다. 내 실험 변동성 그러나, 실험에서 비율 변경을 초래하는 것은 매우 재현되는 실험, 일반적으로보다 8~10%입니다. 통상적으로, 데이터의 분산은 시스템이 분석을 수행 소요 시간 실험자의 증가 경험 직접적인 상관 관계에 따라 감소하기 시작한다.
휴면 성장 세포에서 유전자 발현을 RT PCR, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, 면역 / 서양과 기능성 복합 침전 / 서양에 의해 평가 될 수있다, 면역 형광 또는 면역 조직 화학, 미세 유체에 의해 다중화, 라만 분광법은 유동 세포 계측법 및 기타 기술. 이러한 기법은 특정 수용체, 다른 막 단백질, 신호 전달 경로, 전사 인자, 히스톤 변형 제, 세포 소기관 및 미토콘드리아 단백질, 대사 경로 및 에너지 활용, 무수한 방법으로 미세와 장력의 힘과의 상호 작용의 역할을 결정하기 위해 사용될 수있다 수면의 역할.
우리의 이전 연구는 휴면 클론 (7)의 생존뿐만 아니라 대뇌 피질 굴지 (15)의 상피 분포 휴면 표현형을 유지 PI3K 경로에 대한 중요한 역할을 증명하고있다. 또한 휴면 표현형이 활성화되기 위해서는에서 RhoA 구체적 순서대로 억제되어야한다는 것을 보여 주었다. 이것은 팬 억제제의 Rho 가족 불활 휴면 클론의 생존을 감소 여기에 제시된 데이터는 대조적이다. 티그의 밑줄 메커니즘을 해부 화학적 억제제 사용의 위험 및 억제 또는 특정 경로를 활성화 유전자 접근법을 사용하는 필요가있다. 이를 위해, 방법론은 영구 형질 전환 또는 전달하거나 과도 형질 15의 siRNA 또는 나노 입자에 의해 하나, 세포의 유전자 조작에 빌려 준다. 그것을 측정 할 수 육일에 상당한 표현형 효과가 발생합니다와 분석은 기간, 일시적인 유전자 발현이나 간섭 6 일입니다.
입력의 메커니즘을 공부뿐만 아니라 수면 상태에서 빠져 나오기위한 잠재력을 인식, 우리는 현재 이러한 세포가 휴면를 탈출하기위한 메커니즘을 조사하고 있습니다. 휴면를 입력하면 제대로 이해하는 동안 휴면 상태에서 출구를 지배하는 메커니즘의 이해는 훨씬 더 어려운 것입니다. 우리는 부상 기질에 의한 염증 반응이 DOR의 각성에 기여 할 수있는 예비 관측을보고있다녀 mant MCF-7이 모델 (37)를 사용하여 세포. 모델뿐만 아니라, T-47 세포에 다른 ER + 유방암 세포주를 적용 할 수있다. ER- 세포 FGF-2에 응답하여 휴면 상태가되지 않는 반면, 장래의 연구에서 상이한 분화 제제와 다른 암세포 유형의 방법을 적용하는 것이 가능할 수있다.
휴면 관련된 키를 식별하기위한 메커니즘이 매우 유용한 기술 임에도 불구하고, 그것은 시험 관내 모델이 유지된다. 그러나, 휴면 또는 시험 관내에서 조작을 거친 세포의 이종 이식 종양을 형성하는 능력에 대해 시험 할 수있다. 시스템의 주요 이점은 잠재적 그러나, 매우 복잡한 생체 휴면 모델에서 테스트 할 수있는 가설의 개발을 허용한다 메커니즘의 식별이다.
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Disclosures
국방 보조금 DAMD17-01-C-0343 계열 DAMD17-03-1-0524, 뉴저지 주위원회 암 연구에 02-1140-CCR-E0 및 암 연구 루스 에스 트린 골드버그 기념관 (RW) 지원
Acknowledgments
저자가 공개하는 게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cells | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Liquid | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitor |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (green) | Molecular Probes | B607 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red) | Molecular Probes | R415 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
References
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