우리는 에스트로겐에 민감한 유방암 세포에 대한 골수의 휴면에 대한 체외 모델을 개발했습니다. 이 프로토콜의 목표는 휴면 상태의 분자 및 세포 생물학 연구와 생체 내 후속 테스트를 위한 가설 생성을 위한 모델 사용을 입증하는 것입니다.
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이 논문에서
요약
초록
골수에서의 유방암 휴면에 대한 연구는 휴면 세포와 미세 환경의 상호 작용의 복잡성, 희귀성 및 조혈 세포의 압도적인 과잉으로 인해 매우 어려운 작업입니다. 이를 위해 우리는 골수에서 에스트로겐에 민감한 유방암 세포의 휴면에 대한 체외 2D 클론 생성 모델을 개발했습니다. 이 모델은 휴면에 필요한 몇 가지 핵심 요소로 구성됩니다. 여기에는 1) 장기간 휴면 상태로 유지될 가능성이 있는 유형인 에스트로겐에 민감한 유방암 세포의 사용, 2) 각 세포의 구조적 상호 작용이 주로 하층과 이루어지는 클론 생성 밀도의 세포 배양, 3) 골수의 주요 구조 요소인 피브로넥틴, 4) 골수 기질 세포에 의해 풍부하게 합성되어 세포 외 기질에 많이 축적된 성장 인자인 FGF-2가 포함됩니다. FGF-2로 배양된 세포는 6일 후 휴면 클론을 형성하며, 이는 뚜렷하게 평평한 모양을 가진 12개 이하의 세포로 구성되며 성장하는 세포보다 훨씬 더 크고 더 퍼져 있으며 세포질 대 핵 비율이 큽니다. 대조적으로, FGF-2 없이 배양된 세포는 주로 >30개의 비교적 작은 세포로 구성된 성장 콜로니를 형성합니다. 배양 후 3일째에 항체, 억제제, 펩타이드 또는 핵산으로 인한 시스템의 교란은 6일째에 휴면 세포의 다양한 표현형 및 분자 측면에 상당한 영향을 미칠 수 있으며 휴면 상태 또는 휴면 세포의 생존에 대한 막 국소 또는 세포 내 분자, 요인 또는 신호 경로의 역할을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 분석법의 시험관 내 특성을 인식하는 동시에 휴면 세포의 형성 및 생존에 필요한 분자 메커니즘에 대한 중요한 정보를 수집하는 데 매우 유용한 도구로 기능할 수 있습니다. 이 데이터는 생체 내 모델을 테스트할 가설을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
질병 빨리 작은 종양 혈관 2,3- 개발로, 검출 한 전에 유방암 세포는 골수 전이. 전이 과정은 신속한하지만 비효율적이다. 세포는 하루 4 당 수백만, 빠르게 새로운 혈관을 입력하지만 몇 원격 장기 (5)에 여행을 생존. 그럼에도 불구하고, 일부 미세 전이는 뼈에서 생존 및 단일 세포 또는 새로 진단 된 환자 1에서 골수 흡인 작은 세포 덩어리로 찾을 수 있습니다. 이러한 세포들을 6을 제거 할 목적으로 아주 반트 투여되는 화학 요법 레지스트. 이 저항은 골수 미세 환경 7,8과의 상호 작용에 의해 개시 시그널링 생존하여, 실질적으로 부여된다. 미세 전이는 지역화 된 유방암 여성의 약 1/3에서 찾을 수 있으며, 단 변량 분석 (9)에 의해 분석 할 때 생존의 독립적 인 지표를 나타낼 수 있습니다. 일부 micrometastases 성장 시작하지만 재발의 패턴은 세포 유형에 따라 달라집니다. 트리플 부정적인 유방암 환자는 휴면 상태를 통해 가난한 제어를 제안, 1~4년 사이에 재발하는 경향이있다. ER / PR + 세포를 포함한 다른 세포 유형은 재발 (10)의 안정, 지속적인 속도, 최대 20 년 동안 휴면 남아....
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프로토콜
1. 클론 원성 분석
- 단계를 이용하여 MCF-7 및 T47D 세포는 아래 설명 에스트로겐 의존성 유방암 세포주의 단일 세포 현탁액을 준비
- MCF-7, T-47D 세포를 더 이상 50 % 합류하지 10cm 조직 배양 접시에서 배양 배지 (DMEM / 10 % 열 비활성화 우태 혈청 / 글루타민 및 펜 / 패 혈성)를 대기음. PBS로 씻어. 1-4 분 동안 37 ° C에서 0.25 % / 2.21 mM의 EDTA는 DMEM 높은 포도당에 용해 된 트립신 품어.
- 단일 세포 분포를 보장하기 위해 위상차 현미경 하에서 1 분 간격으로 세포를 확인한다. 거의 불변, 단일 세포 상태를 달성하기 위해 세포 - 세포 접촉을 방해하는 여러 번까지 피펫 팅에 의해 아래로 2 mL를 피펫으로 세포를 재현 탁.
- 당신이 배양의 2 분 후 세포의 덩어리를 관찰하는 경우 최대 4 분 동안 37 ° C에서 트립신에서 세포를 배양 계속합니다. 그들은 전자에 부착 남아 있으면 클론 원성 연구에 대한 이러한 세포를 사용하지 마십시오트립신의 4 분 후에 다른 ACH는 오류가 콜로니 번호 수율로 도입 될 것이기 때문에.
주 : 세포가 응집되어있는 경우, 콜로니의 수가 배양 세포 수보다 적은 수의 제품을 반영 할 것이다. 세포를 트립신 처리 지나....
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결과
실험은 분석 요점을 되풀이하기 위해 실시 하였다. 실험의 시간 코스는도 2a에 도시되어있다. 세포가 하루 -1에 클론 원성 밀도로 배양, FGF-2 새로운 배지에서 하루 0에 추가되고 그들이 염색하고 식민지가 계산 될 때 세포는 6 일까지 배양. 시스템에 대한 교란이 10 배 최종 농도 100 μL 볼륨에서 3 일에 투여 원하는. 그림 (b)는 성장과 휴면 식민지의 전형적인 모습을 보여줍니다. 성장 식민지> 30 세포를 포함하고 휴면 식민지가 큰 세포질 / 핵 비율로 세포를 성장보다 더 많은 배 12 이하 세포가 포함되어 있습니다. 그림 (c) 4 번씩 실시 전형적인 실험 결과를 보여줍니다. , FGF-2의 존재하에, 클론의 대부분이 휴면 상태 FGF-2를 첨가하지 않은 세포의 우세한 분포 성장 클론에 의해 표현된다.
> 그림 3 교란 에이전트가 날 3. 그림에 추가 된 실험의 .......액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
우리의 모델은 골수에서 휴면 여러 주요 요소로 구성된다. 그것은 피브로넥틴, 골수의 주요 구성 요소, FGF-2, 성장 인자가 풍부 골수 기질 합성 이루어져 에스트로겐 장시간 10 골수에서 휴면 가능성 유형 감수성 세포를 이루어져 무겁게 상호 작용은 주로 하층 아르 클론 원성 세포의 밀도에서 골수 31,32 배양의 세포 외 매트릭스에 침착. 골수 미세 환경을 훨씬 더 복잡하지만 특정 기계론 질문을 필요에 따라, 이러한 단순한 시스템은 많은 복잡성으로 구축 될 수있다.
모델은 다수의 방식으로 세포의 성장 세포 생물학 기술, 기술 및 생체 분자 기법을 포함한 수면과 비교하기 위해 사용될 수있다. 세포 표현형을 다시 복제, 운동에 의해 분석 될 수있다과 침략 부착되지 종양이 특정 차단 항체 또는 펩티드 7을 사용하여 미세 환경과의 상호 작용에 대한 기능성 연구를 소 구체 형성 (36.......
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공개 사항
국방 보조금 DAMD17-01-C-0343 계열 DAMD17-03-1-0524, 뉴저지 주위원회 암 연구에 02-1140-CCR-E0 및 암 연구 루스 에스 트린 골드버그 기념관 (RW) 지원
감사의 글
저자가 공개하는 게 없다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| MCF-7 세포 | ATCC | HTB-22 | |
| T47D 세포 | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC 처리 멀티웰 플레이트 | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 인간 피브로넥틴의 균일한 적용을 위한 Glass Coverslip | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| 열 비활성화, 소 태아 혈 | 청 혈청 Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% 트립신/2.21mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-글루타민, 100X, 액체 | Corning | 25-005-CI | |
| 재조합 인간 FGF 기본 | R & D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt 억제제 (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K 억제제 |
| C3 전이효소 | 세포골격 | CTO3 | RhoA, RhoB, RhoC를 억제하지만, Cdc42 또는 Rac1 |
| Y-27632 디하이드로클로라이드 | 산타크루즈 생명공학 | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (녹색) | 분자 프로브 | B607 | 플루오로크롬 피브릴라 액틴 염색 |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (빨간색) | 분자 프로브 | R415 | 플루오로크롬 섬유질 액틴 염색 |
| Alexa Fluor 488 당나귀 안티-마우스 IgG 항체, ReadyProbes 시약 | 분자 프로브 | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | 분자 프로브 | P-36931 |
참고문헌
- Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
- Benoy, I. H., et al.
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재인쇄 및 허가
