Introduction
Células de cáncer de mama metástasis en la médula ósea antes de la enfermedad es detectable 1, tan pronto como los tumores se desarrollan pequeños vasos sanguíneos 2,3. El proceso metastásico es rápida pero ineficiente. Las células entran en los vasos sanguíneos nuevos rápidamente, en millones por día 4 pero pocos sobreviven el viaje a órganos distantes 5. Sin embargo, algunos micrometástasis sobrevivir en el hueso y se pueden encontrar como células individuales o grupos de células pequeñas en aspirados de médula ósea de los pacientes recién diagnosticados 1. Estas células resisten a la quimioterapia adyuvante, que es administrado con el propósito de eliminarlas 6. Esta resistencia está dotado, sustancialmente, por la supervivencia de señalización iniciada por la interacción con el microambiente de la médula ósea 7,8. Las micrometástasis se pueden encontrar en aproximadamente un tercio de las mujeres con cáncer de mama localizado y representan un indicador independiente de la supervivencia cuando se analizaron por análisis univariado 9. Algunos micrometastases son el crecimiento iniciado, pero los patrones de recurrencia dependen del tipo de célula. Los pacientes con cáncer de mama triple negativo tienden a repetirse entre 1 a 4 años, lo que sugiere un mal control sobre el estado de latencia. Otros tipos de células, incluyendo las células ER / PR +, pueden permanecer latentes durante un máximo de 20 años, con un ritmo constante y continua de recurrencia 10. Mientras que las diferencias en la latencia firmas de expresión génica entre ER + y ER- líneas celulares de mama y tumores reflejan diferentes potenciales de latencia 11, las interacciones con estroma de la médula ósea probablemente representan una contribución significativa a la latencia.
El estudio de la latencia in vivo es excepcionalmente difícil debido a micrometástasis son raros y son superados en número por las células hematopoyéticas en más de un 10 6 -fold. Por lo tanto, los modelos relevantes se deben generar que proporcionan datos in vitro que puede sugerir mecanismos y generar hipótesis comprobables en vivo. Un número de modelos de latencia, incluyendo mathemodelos matemá- 12,13, en modelos in vitro, in vivo 7,8,14,15 modelos de xenoinjerto 16, combinaciones de in vitro y modelos de xenoinjerto 17,18 y tumoral y la metástasis modelos espontáneos 19, han producido una cierta penetración en la latencia de células de cáncer 20 . Cada uno de estos modelos tienen sus propias limitaciones y son en sí mismos principalmente útil para generar hipótesis sobre la señalización molecular y las interacciones que rigen la latencia a ensayar en modelos más biológicamente relevantes.
Con el objetivo general de la definición de los mecanismos moleculares de la inactividad, las interacciones con el microambiente que da lugar a la detención del ciclo, rediferenciación y resistencia terapéutica y mecanismos que dan lugar a la recurrencia en las células ER +, hemos desarrollado un modelo in vitro que proporciona selecciona los elementos pertinentes de la estroma microambiente 7. Este modelo, si bien es relativamente escasa en su componentes, es suficientemente robusto para permitir a los investigadores a derivar mecanismos moleculares específicos que afectan a las funciones significativas de latencia. Estos experimentos generan hipótesis que se pueden probar directamente in vivo. El modelo se basa en una serie de elementos clave que hemos demostrado ser relevante en la latencia. Estos incluyen el uso de células de cáncer de mama dependientes de estrógenos, cultivo de células a una densidad clonogénico donde su interacción es principalmente con el sustrato y los componentes solubles del medio, un sustrato de fibronectina y la presencia de factor de crecimiento básico de fibroblastos (FGF-2) en el medio.
Hemos caracterizado los mecanismos que gobiernan el sistema in vitro, incluyendo la inducción de la detención del ciclo celular por FGF-2 21, mediada a través de TGF 22, la supervivencia de señalización a través de PI3 quinasa ERK 7,8 y 8 y la diferenciación morfogénica a un fenotipo epitelial, que dependía de RhoA inactivación, la integrina45; 5β1 upregulation y la ligadura de la fibronectina del estroma para la supervivencia 7,15 (Figura 1). Los efectos del ciclo celular in vitro de FGF-2 en células MCF-7 células comienzan a concentraciones al menos un log por debajo de 10 ng / ml 21,23. La razón se basa en el control temporal de FGF-2 expresión que rige la morfogénesis ductal mamario, la expansión cíclica y la recesión en un número de sistemas de mamíferos 24-27. Hemos demostrado que el FGF-2 induce la diferenciación, incluyendo la morfogénesis ductal en la cultura 3D 28, y que el FGF-2 de expresión se pierden generalmente con la transformación maligna de los tumores humanos 29. La expresión de FGR1 permaneció intacta en los carcinomas de mama encuestados 29 y MCF-7 células continúan para expresar todos los 4 receptores de FGF 30. En el contexto de la latencia, FGF-2 se exporta por y fuertemente deposita sobre estroma de médula ósea 31,32 donde funciona en la preservación de las células madre hematopoyéticas 33. Nos demonstrated que FGF-2 induce un estado latente en cáncer de mama ER + células cultivadas sobre sustratos de fibronectina, también abundante en la médula ósea, donde se induce la diferenciación morfogénica 7. En el modelo, las células de cáncer de mama son el crecimiento inhibido, inactivar Rho A través de la RhoGAP GRAF, redifferentiate a un fenotipo epitelial y re-expresa lost integrinas α5β1 con la progresión maligna. Ellos se unen a través de fibronectina α5β1 integrina y activan la supervivencia de señalización que hacerlos resistentes a la terapia citotóxica 7,8,15 (Figura 1). La inhibición de la Rho GTPasas de clase se ha demostrado previamente para inducir un fenotipo inactivo 34.
Aquí vamos a esbozar los procedimientos específicos que permitan a los investigadores a establecer el modelo y estudiar los mecanismos moleculares y celulares específicas que regulan la latencia de las células de cáncer de mama ER +. En los experimentos presentados aquí para ilustrar el uso del modelo, Nos centramos en la vía PI3K (Figura 1B) con un inhibidor de Akt y un inhibidor de PI3K y todos los miembros de la familia Rho (Figura 1B) con un inhibidor pan-Rho y un (ROCK) inhibidor de Rho quinasa.
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Protocol
1. Ensayo clonogénico
- Preparar un solo suspensiones de células de líneas celulares de cáncer de mama estrógeno-dependientes células MCF-7 y T47D utilizando los pasos descritos a continuación
- Aspirar el medio de cultivo (DMEM / 10% inactivado por calor suero fetal de ternera / glutamina y penicilina / estreptomicina) a partir de una placa de cultivo de tejido de 10 cm que es no confluente más de 50% con las células T-47D MCF-7 o. Enjuague con PBS. Incubar con tripsina 0,25% / EDTA 2,21 mM disuelto en DMEM de alta glucosa a 37 ° C durante 1-4 min.
- Compruebe células a intervalos de 1 min bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar una distribución de una sola célula. Resuspender las células con una pipeta 2 ml pipeteando arriba y abajo varias veces para interrumpir el contacto célula-célula para lograr una, el estado de célula única casi invariable.
- Continuar incubar células en tripsina a 37 ° C durante un máximo de 4 minutos si observa grupos de células después de sólo 2 minutos de incubación. No utilizar estas células para estudios clonogénicos si permanecen adheridos al correoach otra después de 4 minutos de tripsinización porque el error se introducirá en el rendimiento número de colonias.
NOTA: Si se agrupan las células, el número de colonias formadas reflejará el producto de menor número de células que el número se incubaron. Si las células se tratan con tripsina en exceso, su potencial clonogénico puede verse disminuida. - Preparar una suspensión de células de 1.500 células / ml de medio de cultivo para placas de 24 pocillos, o menos, (+ 500 células / ml, dependiendo del tipo de célula o número de pases), mediante diluciones en serie en un tubo maestro que contienen todo el volumen necesario para todas las variables en el experimento.
NOTA: El objetivo es una densidad final de células de 800 células / cm 2 (rango de aproximadamente 500 a 1100 células / cm 2). El objetivo es producir aproximadamente 100 + 50 colonias, que permite relativamente fácil de contar, evita el hacinamiento y permite colonias suficientes para dar lugar a diferencias estadísticas significativas cuando las colonias se aumentan o disminuyen por perturba experimentalciones.
- Se incuban las células en Clonigénicas densidad utilizando pasos descritos a continuación
- Se incuban las células en pocillos por cuadruplicado en 24 placas recubiertas de fibronectina pocillos a una densidad clonogénico de 1500 células / pocillo de un tubo de suspensión de células individuales maestro de 1500 células / ml. Se tritura el medio que contiene células con una pipeta 5 ml mediante la elaboración de 3 ml y dispensación de 1 ml de medio en cada uno de 2 pozos.
NOTA: recubiertos de fibronectina placas se deben comprar pre-recubierto de un proveedor comercial. Placas de revestimiento fuera de una calidad controlada, los resultados de proceso automatizado en una superficie desigual inadecuado para este ensayo. - Mezclar la suspensión pipeteando arriba y abajo con una pipeta de 5 ml, elaborar 3 ml de suspensión celular y llenar 2 pozos con 1 ml cada una. Llenar sólo 2 pozos en un momento dado de una pipeta. Devuelva el volumen restante en la pipeta a la suspensión de células en el tubo principal, volver a suspender las células de nuevo pipeteando arriba y abajo y elaborar otros 3 ml para llenar otro 2 wells con 1 ml cada uno.
NOTA: La mezcla continua del tubo principal es necesaria porque las células se sedimentar continuamente. La elaboración de un volumen suficiente para llenar sólo 2 pozos es necesario añadir el número de células similares a cada pocillo porque las células sedimentan en la pipeta también. - Trabajar rápidamente para distribuir los grandes volúmenes de células porque las células permitiendo a los sientan en suspensión a temperatura ambiente y CO 2 concentración modulará sus clonogénicas potenciales (observaciones no publicadas).
- Optimizar la distribución espacial de las células durante el acto de pipeteado ellos en pocillos para ensayos de colonias. Hacerlo pipeteando lentamente la suspensión que contiene la concentración final de células en el medio de la bien. No exponga la placa para promover el movimiento antes de las células depositan en el fondo. No girar el plato porque mezcla circular centrifugar efectivamente las células al perímetro de las así creando altas densidades de células y colonias confluentes incontables a los 6 días.
NOTA: No mezcle menos que sea necesario ya que esto es menos deseable que ninguna mezcla en absoluto después de la introducción del volumen con las células en suspensión. Si es necesario mezclar las células, hacerlo moviendo la placa hacia atrás y adelante en direcciones perpendiculares mientras descansa sobre una superficie plana. - Se incuban las células a 37 ° C 5% de CO 2 sin cambio de medio durante 6 días. El pequeño número de células en un pozo después de 6 días no impactará significativamente la composición de nutrientes o de citoquinas ni el pH del medio original.
- Diseñar el curso de tiempo del ensayo como sigue: Se incuban las células en la fibronectina recubierto de sustratos en el día 1. Reemplazar medio existente con 1 ml de medio fresco o medio fresco que contiene 10 ng / ml en el día 0. células mancha en día 6 como debajo de 2 FGF- en 1.4). Realizar cualquier perturbaciones experimentales en el día 3, ya continuación en 1.3).
- Se incuban las células en pocillos por cuadruplicado en 24 placas recubiertas de fibronectina pocillos a una densidad clonogénico de 1500 células / pocillo de un tubo de suspensión de células individuales maestro de 1500 células / ml. Se tritura el medio que contiene células con una pipeta 5 ml mediante la elaboración de 3 ml y dispensación de 1 ml de medio en cada uno de 2 pozos.
- Configurar perturbaciones experimentales de Molecular Signaling o moléculas de adhesión
- El día 3, añadir 10056; l de una solución que contiene 10 veces más de la concentración deseada final del agente perturbador al medio de 1 ml en los pocillos. No mezclar. Continuar incubar las células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante otros 3 días.
NOTA: agentes Perturbar puede incluir una variedad de inhibidores y agentes de bloqueo de moléculas de adhesión, receptores u otras proteínas de superficie, inhibidores de las vías de señalización intracelulares, moléculas, factores, cofactores o proteínas estructurales, que pueden jugar un papel en el apoyo al estado latente. - Colonias de la mancha en el día 6, de la siguiente manera.
- El día 3, añadir 10056; l de una solución que contiene 10 veces más de la concentración deseada final del agente perturbador al medio de 1 ml en los pocillos. No mezclar. Continuar incubar las células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante otros 3 días.
- Las colonias de la mancha
- Stain células después de 6 días de cultivo con un 0,1% de cristal violeta recién hecho en 2% de etanol / borato de sodio 10 mM (pH 9,0) solución. Medios Aspirar y añadir solución de cristal violeta uno ml a cada pocillo durante 20 min.
- Lavar platos sumergiéndolos con las aberturas así mirando hacia abajo en un ángulo agudo en un cubo de hielo que desborda con grifo abierto de forma continuaagua en el fregadero. Incline la placa a un ángulo horizontal una vez bajo el agua, así la apertura hacia abajo, y luego inclinarlo de nuevo a un ángulo agudo al retirar en un movimiento que fluye suave.
- Repita la inmersión 2 o 3 veces hasta que el agua en el fondo de los pozos ya no es de color azul. Lavados vigorosos pueden eliminar las células o colonias que son menos adherente debido a la intervención experimental, añadiendo de manera significativa al error en el conteo y los datos.
- Placas secas durante la noche colocándolos boca abajo sobre toallas en la mesa de trabajo junto a sus correspondientes tapas marcadas.
- Cuente Colonias
- Contar el número de colonias que crecen y latentes en cada pocillo después de 6 días de incubación, la tinción y el secado. Recuento de las colonias de manera óptima a 40 aumentos en un microscopio de contraste de fase invertida. Contar las colonias de> 30 células como crecer y colonias de 12 o menos células, con la apariencia morfológica de gran tamaño en comparación con el cultivo de células, amplio expacitoplasma nded con gran citoplasma al núcleo proporciones, mostradas en la Figura 1 7,15.
NOTA: Los racimos de 13-29 células normalmente no se cuentan como no son muy frecuentes en los ensayos de inactividad sencillas. Ellos se pueden contar si las perturbaciones desplazan el potencial de crecimiento de cualquiera de las células en crecimiento o latentes. Estos resultados entonces necesitará estar correlacionado con importancia biológica.
- Contar el número de colonias que crecen y latentes en cada pocillo después de 6 días de incubación, la tinción y el secado. Recuento de las colonias de manera óptima a 40 aumentos en un microscopio de contraste de fase invertida. Contar las colonias de> 30 células como crecer y colonias de 12 o menos células, con la apariencia morfológica de gran tamaño en comparación con el cultivo de células, amplio expacitoplasma nded con gran citoplasma al núcleo proporciones, mostradas en la Figura 1 7,15.
2. Clonigénicas Incubación de Estudios de inmunofluorescencia
- Ajustar el número de células a aproximadamente 7,500-8,000 células / pocillo en placas de 6 pocillos, para corresponder a la celda / números de área de superficie análoga a 24 experimentos bien.
- Coloque una ronda,, cubierta de resbalón fibronectina recubierto estéril en cada base pocillo de placas de 6 pocillos para los estudios de imagen antes de la adición de células. Células de pipeta en 3 ml volúmenes en cada pocillo 2 pozos en un momento en concentraciones describen, como se describe para los experimentos clonogénicas más arriba en 1.2).
- Se incuban las célulasdurante 6 días, como anteriormente en 1.2.4 y 1.2.5. Añadir factores perturbadores en días 3 a 10x concentraciones en 300 volúmenes mu l, como se describe en los procedimientos de ensayo colonia en 1.3).
- Células mancha en día 6 con anticuerpos para moléculas de adhesión celular tales como integrinas α4, α5, α6, β1, β3, por ejemplo, de adhesión focal moléculas complejas FAK, paxillin y vinculina, por ejemplo, proteínas implicadas en la motilidad tales como α-tubulina, por ejemplo, los miembros de la vía de señalización tales como fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, por ejemplo, o cualquier otra proteína que es el objetivo de la investigación por su papel en la latencia, utilizando técnicas estándar para directo o indirecto la tinción de inmunofluorescencia.
- Eliminar diapositivas con fórceps día 6. Fijar en acetona / metanol 1: 1 a -20 ° C durante 20 min y secar al aire. Un fijador alternativo, tal como paraformaldehído, se puede utilizar, si es necesario. Permeabilizar las células con 0,1% Triton X-100, 0,1% de citrato de sodio para 2 min fo la detección de antígenos intracelulares. Lavar las células con PBS.
- Para la tinción immunofluorecence indirecto, las diapositivas de bloque para 1 hr a temperatura ambiente con 5% de BSA o con 10% de suero preinmune de la especie en la que se generó el anticuerpo secundario.
- Incubar durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios a la célula moléculas de adhesión, moléculas complejas focales, señalización de los miembros de la vía o cualquier otra proteína que es el objetivo de la investigación por su papel en la latencia diluido a diluciones específicas recomendadas por el fabricante en PBS 0,1% de Triton X -100.
- Lavar 3 veces con PBS. Incubar cubreobjetos con anticuerpos-fluoróforo conjugado a temperatura ambiente durante 2 hr. Como un ejemplo, Alexa Fluor 488 burro anti-IgG de ratón de anticuerpos puede ser utilizado para detectar anticuerpos primarios monoclonales murinos. Monte cubreobjetos células hacia abajo sobre portaobjetos de vidrio utilizando un agente antifade con DAPI. Selle los perímetros con esmalte de uñas.
- Por inmunofluorescencia directa, llevar a cabo la BSAbloqueo como anteriormente en 2.4.2), incubar con el anticuerpo primario-fluoróforo conjugado durante la noche a 4 ° C. Lavar 3 veces con PBS. Incubar los portaobjetos con un agente antifade y Dapi y sello con el esmalte de uñas.
- Bandejas deslizantes cubierta con papel de aluminio y se almacena a 4 ° C para formación de imágenes y la fotografía en cualquier momento hasta varias semanas más tarde. Ver y fotografiar las células utilizando cualquier sistema de formación de imágenes microscópicas de fluorescencia equipado con una cámara en 1.000 x magnificación.
- Para la tinción de actina fibrilar, diapositivas de bloque en 1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 30 min y se incuban en BODIPY FL-Phallacidin (verde) o rodamina faloidina (rojo) a temperatura ambiente durante 20 min. Añadir un agente antifade y sellar el anterior.
3. Clonigénicas Incubación de Estudios Moleculares
- Transferencias Western
- Incubar cáncer de mama ER + células MCF-7 o T47D a densidades clonogénicos de 20.000 células / 60 mm plato y 50.000 células / placa de 100 mm en fibroneclata-revestido placas a 37 ° C en 5% de CO 2.
- Se incuban las células a densidades ligeramente más altos de 75.000 células / placa de 100 mm para los estudios moleculares que requieren cantidades mg de proteína de lisados. Utilice un máximo de diez planchas por punto experimental para recoger suficientes proteínas para los estudios moleculares utilizando transferencias Western o para el aislamiento de ARN para transferencias Northern.
- El número de células de carga de gel con base es un complemento necesario para la comparación de la expresión de proteínas de muy diferentes tamaños células de cultivo y latentes. Recoger las células por tripsinización y contar una parte alícuota en un hemocitómetro en 0,2% de azul de tripano para la preparación de lisados para transferencias de Western en lugar de raspado de las células con una sola pala de borde.
- Centrifugar las células a 10.000 xg durante 2 min, eliminar los medios por aspiración, añadir 200 l de tampón de lisis, sonicar las células en tampón de lisis y determinar la concentración de proteína.
- Calcular la cantidad de proteína por célula dividiendo el rendimiento de proteína por el número de célulasque genera esa cantidad. Cargar el lisado en cada pocillo de geles de poliacrilamida separadas que representa tanto una) cantidades equivalentes de proteína y b) las cantidades de proteínas que representan el número de células equivalentes. Al menos 25 g de proteína debe ser cargado en cada pocillo.
NOTA: Esto permitirá comparaciones entre crecimiento y latentes células, que son significativamente diferentes en tamaño y contenido de proteína (Figura 1).
- Citometría De Flujo
- Recoger las células de placas de 100 mm por tripsinización, como en 3.1 y analizar por células activadas por fluorescencia estándar (FACS) utilizando protocolos de tinción de inmunofluorescencia primaria o secundaria, ya sea para antígenos intracelulares o extracelulares, como se indica en 2.4.
NOTA: Separación de células a partir de placas de cultivo de tejidos por tripsinización no afecta a la concentración de proteínas de membrana como se determina mediante el etiquetado de anticuerpos.
- Recoger las células de placas de 100 mm por tripsinización, como en 3.1 y analizar por células activadas por fluorescencia estándar (FACS) utilizando protocolos de tinción de inmunofluorescencia primaria o secundaria, ya sea para antígenos intracelulares o extracelulares, como se indica en 2.4.
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Representative Results
Se realizaron experimentos para recapitular el ensayo. El curso de tiempo del experimento se muestra en la Figura 2A. Las células se incubaron a densidad clonogénico en el día -1, se añade FGF-2 en medio fresco en días 0 y las células se cultivan hasta el día 6 cuando se tiñen y se cuentan las colonias. Cualquier perturbaciones en el sistema se administran en el día 3 en 100 volúmenes mu l a 10x concentraciones finales deseadas. La Figura 2B muestra la apariencia típica de las colonias que crecen y latentes. Colonias en crecimiento contienen> 30 células y colonias inactivas contienen 12 o menos células que son muchas veces más grandes que el cultivo de células con grandes proporciones citoplasma / núcleo. Figura 2C muestra un resultado típico experimental llevado a cabo por cuadruplicado. La distribución predominante de células sin la adición de FGF-2 está representada por clones que crecen mientras que, en presencia de FGF-2, la gran mayoría de los clones son latente.
ONTENIDO "> Figura 3 es un ejemplo de un experimento en el que se añadieron los agentes perturbadores en el día 3. La figura representa la inhibición dependiente de la dosis de clones inactivos por la inhibición de la familia Rho de GTPasas Rho por un pan-transferasa C3 y un inhibidor Rho cinasa (ROCK) inhibidor Y27632. El ensayo puede evaluar la ED 50 de inhibidores añadidos en clones latentes, así como clones en crecimiento. En este experimento, el efecto sobre clones que crecen no se determinó, ya que sólo se presentan para ilustrar la metodología.Las Figuras 4 y 5 demuestran que el ensayo puede usarse para evaluar los efectos combinados de los inhibidores sobre la supervivencia de clones latentes. Nuestros estudios previos han demostrado que la vía PI3K se somete a una activación sostenida en las células latentes en este modelo y la inhibición de tanto PI3K y Akt inhibe parcialmente la supervivencia de clones latentes 7. Aquí, las observaciones preliminares, demostró tsombrero de inhibición no específica de la familia Rho de pequeñas GTPasas también inhibe parcialmente la supervivencia de clones latentes. Los datos presentados en las Figuras 4 y 5 demuestran que la combinación de la inhibición de PI3K y uno de sus efectores aguas abajo, AKT, con la inhibición de la familia Rho con transferasa C3 y un inhibidor de la roca puede eliminar casi completamente la supervivencia de clones latentes en algunas circunstancias. Hemos demostrado anteriormente que los clones inactivos sobrevivir a la inhibición de PI3K pero no de Akt se componen de células que ya no presentan el fenotipo inactivo, sino más bien aparecerá mesenquimales y angustiado 7. Las células de los clones latentes en el que la familia Rho ha sido ampliamente inhibida por C3 transferasa y el inhibidor ROCA también pierden la apariencia típica latente, asumir las apariencias fibrolastoid y membranas de volantes y también aparecen angustiado (Figura 6). Estos experimentos demuestran un modelo que se puede consultar en muy broad manera para lograr una comprensión de los elementos que gobiernan la latencia y resistencia a la terapia.
Figura 1: mecanismos que gobiernan nuestro modelo de latencia in vitro (A) Cultivo y latentes MCF-7 clones después de la incubación de 6 días en densidad clonogénico en placas recubiertas de fibronectina con y sin FGF2 10 ng / ml 7 (aumento de 100X).. Esquema (B) Resumen delineando los datos que FGFR y la integrina α5β1 se requiere la señalización de estado estacionario paralelo para activar y mantener la latencia 7. FGF-2 upregulates inhibidores de quinasas dependientes de ciclina que resulta en arresto G1 21, activa ERK 8 y PI3 quinasa 7 que initiatesurvival señalización y upregulate integrina α5β1 7, que alcanza el estado de equilibrio después de varios días. Throug doble señalizaciónh FGFR a través de PI3K y de forma independiente a través de la ligadura de la integrina α5β1 por fibronectina se requiere para la activación de FAK y localización de la membrana y la activación de RhoA el GAP GRAF 15. Esto resulta en la inactivación de RhoA y un estado estable permisivo para el reordenamiento cortical F-actina (microfotografía phalloidin manchados), epiteliales re-diferenciación y latencia 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Elementos de la latencia de ensayo in vitro (A) Esquema de los componentes temporales de la ensayo de latencia.. Las células se incubaron en placas de cultivo de tejidos recubiertos de fibronectina en la densidad clonogénico, a una densidad máxima de 1.500 células / pocillo de una placa de 24 pocillos en un incubator a 37 ° C y 5% de CO 2 en el día 1. El medio se sustituye en el día 0 con medio fresco o medio fresco que contiene FGF-2 10 ng / ml y las células se volvieron a incubar. Las células se tiñeron con solución de cristal violeta, como se describe, en el día 6. Los inhibidores o agentes de perturbación se añaden en el día 3 en 100 volúmenes mu l a 10x concentraciones deseadas y las células se re-incubaron hasta el día 6. (B) El aspecto de manchado creciente y latentes MCF-7 colonias. Colonias en crecimiento contienen> 30 células y colonias inactivas contienen 12 o menos células. Células inactivas tienen forma de panqueque, muchas veces más grande que el cultivo de células con grandes proporciones citoplasma / núcleo. (Aumento de 100X). (C) Gráfico que demuestra el potencial clonogénico de 1500 células MCF-7 de cáncer de mama humanos incubados con y sin FGF-2 10 ng / ml en placas de 24 pocillos recubiertas de fibronectina. Sin FGF-2, la distribución predominante de células está representado por clones que crecen mientras que en presencia de FGF- 2 la gran mayoría de los clones son latente. Los experimentos se realizaron por cuadruplicado. (Barras de error son + SD)
Figura 3: la inhibición dependiente de la dosis de clones inactivos por Pan-Rho familia inhibidores de transferasa C3 y el Y27632 inhibidor ROCA células T-47D se incubaron a la densidad clonogénico de 1000 células por pocillo en placas de 24 pocillos recubiertas de fibronectina con FGF-2. 10 ng / ml durante 6 días. Media, C3 transferasa 3 o 5 g / ml, y el inhibidor de ROCA Y27632 0,1, 1 o 10 mg / ml estaban en días 3 y clones latentes se contaron en el día 6. El gráfico demuestra una inhibición dependiente de la dosis de clones latentes manchadas en día 6. El ED 50 de C3 fue de aproximadamente 3 mg / ml, mientras que la del inhibidor de roca fue entre 1 y 10 M en este ensayo. Los experimentos se realizaron por cuadruplicado. (Barras de error son + SD)
Figura 4:. Combinado efectos de pan-Rho inhibidor de la familia C3 con un inhibidor de Akt o con un inhibidor de PI3 quinasa en la supervivencia de los inactivos clones T-47D células T-47D se incubaron a la densidad clonogénica de 1000 células por pocillo en 24 y fibronectina placas recubiertas con FGF-2 10 ng / ml durante 6 días. Los medios de comunicación, C3 transferasa 5 g / ml, Akt inhibidor 25 M y 20 M LY294002 se añadieron individualmente o en combinación en el día 3 y clones latentes se contaron en el día 6. Los efectos combinados de C3 y el inhibidor de AKT parecen ser aditivos en estos concentraciones, pero los efectos combinados de C3 y el inhibidor de PI3K parecen ser sinérgicos en estos experimentos sobre la inhibición de la supervivencia clon inactivo. Los experimentos se realizaron por cuadruplicado. (Barras de error son + SD)
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Figura 5:. Combinado efectos de Y27632 inhibidor de roca con un inhibidor de Akt o con un inhibidor de PI3 quinasa en la supervivencia de los inactivos clones T-47D células T-47D se incubaron a la densidad clonogénica de 1000 células por pocillo en placas de 24 pocillos recubiertas de fibronectina- con FGF-2 10 ng / ml durante 6 días. Media, inhibidor ROCA Y27632 3 g / ml, inhibidor de Akt 25 M y 20 M LY294002 se añadieron individualmente o en combinación en el día 3 y clones latentes se contaron en el día 6. Los efectos combinados de Y27632 y el inhibidor de AKT no parecen ser aditivo a estas concentraciones, pero los efectos combinados de Y27632 y el inhibidor de PI3K parece ser más que aditivo en estos experimentos sobre la inhibición de la supervivencia clon inactivo. Los experimentos se realizaron por cuadruplicado. (Barras de error son + SD)
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Figura 6:. La aparición de sobrevivir latentes clones T-47D después del tratamiento con transferasa C3 y Y27632 inhibidor ROCA ensayos de colonias se establecieron por cuadruplicado en 24 placas de cultivo tisular bien fibronectina recubierto a 1000 células / pocillo con FGF-2, como se describe, inhibidores se añadieron en el día 3 a las concentraciones que se muestran, las células se tiñeron y se fotografiaron en el día 6. Las células tratadas con inhibidores de la familia pan-Rho perdió su aspecto diferencial, se convirtió en pequeño, dendríticas y parecía angustiado. (Aumento de 100X).
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Discussion
Nuestro modelo se compone de varios elementos clave de la latencia en la médula ósea. Se compone de células sensibles a estrógenos, que son el tipo propensos a permanecer en estado latente en la médula ósea durante períodos prolongados 10, se compone de fibronectina, un elemento estructural clave de la médula ósea, FGF-2, un factor de crecimiento abundantemente sintetizado por el estroma de la médula ósea y fuertemente depositado en la matriz extracelular de la médula ósea 31,32 y la incubación de las células a una densidad clonogénico donde sus interacciones son principalmente con el sustrato. Mientras que el microambiente de la médula ósea es mucho más compleja, este simple sistema puede ser construido con la complejidad como mucho añadido según sea necesario para hacer preguntas mecanicistas específicos.
El modelo puede ser utilizado para comparar latente con el crecimiento de células en un número de maneras, incluyendo técnicas de biología de células, las técnicas moleculares y en técnicas in vivo. Fenotipos celulares pueden ensayarse por volver a la clonación, la motilidady la invasión estudia 35, tumor no adherente iniciando la formación de spherule 36 o por estudios funcionales para la interacción con el microambiente usando anticuerpos o péptidos 7 bloqueantes específicos.
La salida principal del ensayo clonogénico es un recuento numérico de colonias, ya sea creciendo o latente, lo que se traduce a la creciente o latente potencial clonogénico de las células. Como indica anteriormente, un gran número de variables tienen el potencial de afectar a este resultado, todos los cuales deben ser controlado de manera tan estricta como sea posible para producir resultados reproducibles. Estos incluyen la fuente de células, el número total de paso, la técnica de la crioconservación y la calidad de los cultivos celulares que fueron crioconservados, el número de pasajes desde la descongelación, la confluencia de culturas de las que se obtuvieron las preparaciones de células individuales, la fuente y la calidad de la suero de ternero fetal, las duraciones de tripsinización y su reproducibilidad, la duraciónde las células dejaron a temperatura ambiente, la destreza de pipetear el número de células equivalentes en cada pocillo, la destreza o la distribución de las células a través de toda el área de superficie de un pozo de manera uniforme, el número de veces que una placa se retira de la incubadora para la observación, entre decenas de otros. Además de representar a los controles de calidad de cultivo de tejidos generalmente aceptadas, estas variables afectan el potencial clonogénico latente de experimento a experimento. La variabilidad intra-experimental es típicamente menos de 8 a 10%, sin embargo, lo que resulta en cambios porcentuales de experimento a experimento que son altamente reproducible. Típicamente, la varianza de los datos comienza a disminuir con una correlación directa del aumento de la experiencia del experimentador con el sistema y el tiempo de la realización de este ensayo.
La expresión génica en células latentes y en crecimiento puede ser evaluada por RT PCR, transferencia de Northern, Western blot, inmunoprecipitación / Western y funcional complejo de precipitación / Western, Inmunofluorescencia o inmunohistoquímica, multiplexación por microfluídica, la espectroscopia Raman, citometría de flujo y otras técnicas. Estas técnicas se pueden utilizar para determinar las funciones de los receptores específicos, otras proteínas de membrana, las vías de señalización, factores de transcripción, modificadores de histonas, orgánulos y las proteínas mitocondriales, las vías metabólicas y utilización de la energía, la tensión y la fuerza y la interacción con el microambiente de innumerables maneras en la papel de latencia.
Nuestros estudios previos han demostrado papeles significativos para las vías PI3K en supervivencia de clones latentes 7, así como en el mantenimiento del fenotipo inactivo con la distribución epitelial de la actina cortical 15. Se demostró además que RhoA específicamente, debe inhibirse para que el fenotipo inactivo para ser activado. Esto está en contraste con los datos presentados aquí, donde la inactivación de la familia Rho con inhibidores de pan disminuye la supervivencia de clones latentes. Tsus subrayado el peligro de usar inhibidores químicos para diseccionar los mecanismos y la necesidad de utilizar enfoques genéticos para inhibir o activar las vías específicas. Con este fin, la metodología se presta a la manipulación genética de las células, ya sea por transfección permanente o transducción o por transfección transitoria 15, siRNA o nanopartículas. Dado que el ensayo es de 6 días de duración, la expresión génica transitoria o interferencia con el resultado será efectos fenotípicos significativas a los 6 días que se pueden medir.
Reconociendo su potencial para el estudio de los mecanismos de entrar y salir de la inactividad, actualmente estamos investigando los mecanismos de estas células para escapar de latencia. Mientras introduce latencia no se conoce bien, una comprensión de los mecanismos que regulan la salida del estado latente es aún más difícil de alcanzar. Nos han informado de las observaciones preliminares que las respuestas inflamatorias por estroma lesionada pueden contribuir a la despertar de dormant MCF-7 células por medio de este modelo 37. El modelo se puede aplicar a T-47 células, así, otro de mama ER + línea celular de cáncer. Mientras que las células ER- no se conviertan en estado latente en respuesta a FGF-2, puede ser posible adaptar la metodología a otros tipos celulares de cáncer con diferentes agentes de diferenciación en futuras investigaciones.
A pesar de ser una técnica muy útil para identificar mecanismo clave implicada en la latencia, sigue siendo un modelo in vitro. Sin embargo, las células que se han sometido a la latencia o manipulación in vitro pueden ser probados para la formación de tumor de xenoinjerto de capacidad. El principal beneficio potencial del sistema, sin embargo, es la identificación de mecanismos que permitan el desarrollo de una hipótesis que puede ser probado en modelos de latencia alta complejidad en vivo.
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Disclosures
Apoyado por el Departamento de Becas de Defensa DAMD17-01-C-0343 y DAMD17-03-1-0524, la Comisión Estatal de New Jersey para la Investigación del Cáncer 02-1140-CCR-E0 y Ruth Estrin Goldberg Memorial para la Investigación del Cáncer (RW)
Acknowledgments
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cells | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Liquid | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitor |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (green) | Molecular Probes | B607 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red) | Molecular Probes | R415 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
References
- Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
- Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
- Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
- Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
- Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
- Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
- Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
- Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
- Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
- Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).
- Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
- Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
- Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914 (2011).
- Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
- Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
- Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
- Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
- Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
- Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
- Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
- Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
- Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
- Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
- Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
- Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
- Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
- Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
- Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
- Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
- Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
- Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).
