Summary

En<em> In Vitro</em> Dormancy Modell av østrogen-sensitive brystkreft i benmargen: Et verktøy for molekylære mekanismen Studier og Hypotese Generation

Published: June 30, 2015
doi:

Summary

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduction

Brystkreft celler metastaserer til benmargen før sykdommen er detekterbar 1, så snart små svulster utvikle blodkar 2,3. Den metastatisk prosessen er rask, men ineffektiv. Celler inn nye blodkar raskt, på millioner per dag 4, men få overleve turen til fjerne organer 5. Likevel, noen mikrometastaser overleve i bein og kan bli funnet som enkeltceller eller små celleklumper i beinmargs aspirates fra nydiagnostiserte pasienter 1. Disse cellene motstå adjuvant kjemoterapi, som administreres for aller formål å eliminere dem seks. Denne motstanden er utrustet, vesentlig, etter overlevelse signale initiert av interaksjoner med mikromiljøet i benmargen 7,8. Mikrometastaser kan bli funnet i omtrent en tredjedel av kvinner med lokalisert brystkreft og representerer en uavhengig indikator på overlevelse ved analyse ved univariate analyse 9. Noen micrometastases er vekst initiert, men tilbakefall mønstre avhengig av celletype. Pasienter med trippel negativ brystkreft har en tendens til å gjenta seg mellom 1 til 4 år, noe som tyder på dårlig kontroll over sovende tilstand. Andre celletyper, inkludert ER / PR + celler, kan forbli sovende i opptil 20 år, med en jevn, kontinuerlig frekvensen av tilbakefall 10. Mens forskjellene i dormancy genekspresjonssignaturer mellom ER + og feilbrystcellelinjer og svulster reflekterer ulike dormancy potensialer 11, interaksjoner med benmargs stroma representerer sannsynligvis et betydelig bidrag til dvalen.

Studiet av dvalen in vivo er svært vanskelig fordi mikrometastaser er sjeldne og blir overmannet av blodkreft cellene med mer enn 10 6 fold. Derfor må relevante modeller bli generert som gir in vitro data som kan foreslå mekanismer og generere testbare hypoteser in vivo. En rekke av dvalen modeller, inkludert mathetisk modeller 12,13, in vitro modeller 7,8,14,15, in vivo xenograft modeller 16, kombinasjoner av in vitro og xenograft modeller 17,18 og spontane tumor og metastase modellene 19, har gitt en viss innsikt i kreftcelle dvalen 20 . Hver av disse har sine egne begrensninger, og holder seg først og fremst nyttig for å generere hypoteser angående molekylsignalering og interaksjoner som styrer uvirksom som skal testes i flere biologisk relevante modeller.

Med det overordnede målet om å definere de molekylære mekanismene for dvalen, samhandlingene med mikromiljøet som resulterer i syklus arrest, redifferentiation og terapeutisk motstand og mekanismer som fører til tilbakefall i ER + celler, utviklet vi en in vitro modell som gir valgt relevante deler av stromal mikromiljøet 7. Denne modellen, mens relativt sparsom i sin componenter er tilstrekkelig robust til å tillate søkere til å utlede spesifikke molekylære mekanismer som påvirker vesentlige funksjonene til uvirksom. Disse eksperimentene generere hypoteser som kan være direkte testet in vivo. Modellen bygger på noen viktige elementer som vi demonstrert å være relevant i dvalen. De omfatter bruken av østrogenavhengig brystcancerceller, kultur av celler i et klonogene tetthet hvor deres interaksjon er hovedsakelig med underlaget og løselige komponenter i mediet, en fibronektin substrat og tilstedeværelsen av basisk fibroblast vekstfaktor (FGF-2) i mediet.

Vi karakterisert mekanismer som styrer systemet in vitro, inkludert induksjon av cellesyklus-stans av FGF-2 21, formidles gjennom TGFfi 22, overlevelse signalisering gjennom PI3 kinase 7,8 og ERK 8 og morphogenic differensiering til en epitelial fenotype, som var avhengig RhoA inaktivering, inte45; 5β1 oppregulering og ligering av stromal fibronektin for overlevelse 7,15 (figur 1). De in vitro cellesyklus effekter av FGF-2 på MCF-7 celler begynner ved konsentrasjoner på minst en log under 10 ng / ml 21,23. Begrunnelsen var basert på tidsmessige kontrollen av FGF-2 uttrykk som regulerer melke duktal morphogenesis, syklisk ekspansjon og resesjon i en rekke pattedyrsystemer 24-27. Vi demonstrerte at FGF-2 induserer differensiering, inkludert ductal morfogenese i 3D kultur 28, og at FGF-2 ekspresjon er vanligvis tapt med malign transformasjon av humane tumorer 29. Uttrykket av FGR1 forble intakt i brystcarsinomer kartlagt 29 og MCF-7 celler fortsette å uttrykke alle 4 FGF-reseptorer 30. I sammenheng med dvalen, er FGF-2 eksportert av og tungt avsatt på benmargen stroma 31,32 der den fungerer i bevaring av blodkreft stamceller 33. Vi demtere at FGF-2 induserer en sovende tilstand i ER + brystkreft celler dyrket på fibronectin undergrunn, også rikelig i margen, der det induserer morphogenic differensiering 7. I modellen brystkreft celler er veksten hemmes, inaktivere Rho A gjennom RhoGap GRAF, redifferentiate til en epitelial fenotype og re-express inte α5β1 lost med ondartet progresjon. De binder fibronektin gjennom inte α5β1 og aktivere overlevelse signaliserer at gjengi dem resistente mot kjemoterapi 7,8,15 (figur 1). Hemming av Rho klasse GTPases har blitt demonstrert tidligere å indusere en sovende fenotype 34.

Her vil vi skissere de spesifikke prosedyrer som vil tillate etterforskere å etablere modellen og studere spesifikke molekylære og cellulære mekanismene som styrer dvalen av ER + brystkreft celler. I forsøkene som er presentert her for å illustrere bruken av modell, Målrettet vi PI3K pathway (figur 1B) med en Akt-inhibitor og et PI3K-inhibitor og alle medlemmer av familien Rho (figur 1B) med en pan-Rho-inhibitor og en Rho-kinase (stein) inhibitor.

Protocol

1. klonogene analysen Forbered en enkelt celle suspensjoner av østrogenavhengige brystkreft cellelinjer MCF-7 og T47D celler ved hjelp av fremgangsmåten nedenfor Aspirer dyrkningsmedium (DMEM / 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum / glutamin og pen / strep) fra et 10 cm vevskulturskål som er ikke mer enn 50% sammenflytende med MCF-7 eller T-47D-celler. Skyll med PBS. Inkuber med trypsin 0,25% / 2,21 mM EDTA oppløst i DMEM høy glukose ved 37 ° C i 1-4 min. Kontroller cellene ved 1 m…

Representative Results

Forsøk ble utført for å rekapitulere analysen. Tidsforløpet av forsøket er vist i figur 2A. Celler ble inkubert ved klonogene tetthet på dag -1, blir FGF-2 i friskt medium tilsatt på dag 0, og cellene blir dyrket inntil dag 6 når de er farget, og koloniene telles. Eventuelle forstyrrelser i systemet administreres på dag 3 i 100 ul volumer på 10x sluttkonsentrasjoner ønsket. Figur 2B viser et typisk utseende av voksende og sovende kolonier. Voksende kolonier inneholder&g…

Discussion

Vår modell består av flere viktige elementer av dvalen i benmargen. Den består av østrogensensitive celler, som er den type som sannsynligvis vil forbli latent i margen i lengre perioder 10, den består av fibronektin, et sentralt strukturelement av marg, FGF-2, en vekstfaktor rikelig syntetisert ved benmargen stroma og tungt deponert i ekstracellulære matrise av benmargen 31,32 og inkubasjon av cellene ved klonogene tetthet hvor deres interaksjoner er primært med underlaget. Mens mikromiljø…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Materials

MCF-7 cells ATCC HTB-22
T47D cells  ATCC HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate Corning 354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes Corning 354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes Corning 354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin Corning 354088
6 Well tissue culture plate CellTreat 229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder Corning Life Sciences 50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum Serum Source International FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X Corning 30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid Corning 25-005-CI
Recombinant Human FGF basic R&D Systems 234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) CalBiochem 124005
LY294002  CalBiochem 19-142 Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase  Cytoskeleton CTO3 Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride  Santa Cruz Biotechnology 129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)  Molecular Probes B607 Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)  Molecular Probes R415 Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent  Molecular Probes R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI  Molecular Probes P-36931

References

  1. Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
  2. Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
  3. Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
  4. Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
  5. Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
  6. Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
  7. Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
  8. Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
  9. Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
  10. Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
  11. Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).
  12. Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
  13. Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
  14. Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914 (2011).
  15. Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
  16. Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
  17. Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
  18. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  19. Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
  20. Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
  21. Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
  22. Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
  23. Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
  24. Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
  25. Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
  26. Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
  27. Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
  28. Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
  29. Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
  30. Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
  31. Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
  32. Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
  33. Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
  34. Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
  35. Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
  36. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  37. Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , (2014).

Play Video

Cite This Article
Tivari, S., Korah, R., Lindy, M., Wieder, R. An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation. J. Vis. Exp. (100), e52672, doi:10.3791/52672 (2015).

View Video