Introduction
Brystkreft celler metastaserer til benmargen før sykdommen er detekterbar 1, så snart små svulster utvikle blodkar 2,3. Den metastatisk prosessen er rask, men ineffektiv. Celler inn nye blodkar raskt, på millioner per dag 4, men få overleve turen til fjerne organer 5. Likevel, noen mikrometastaser overleve i bein og kan bli funnet som enkeltceller eller små celleklumper i beinmargs aspirates fra nydiagnostiserte pasienter 1. Disse cellene motstå adjuvant kjemoterapi, som administreres for aller formål å eliminere dem seks. Denne motstanden er utrustet, vesentlig, etter overlevelse signale initiert av interaksjoner med mikromiljøet i benmargen 7,8. Mikrometastaser kan bli funnet i omtrent en tredjedel av kvinner med lokalisert brystkreft og representerer en uavhengig indikator på overlevelse ved analyse ved univariate analyse 9. Noen micrometastases er vekst initiert, men tilbakefall mønstre avhengig av celletype. Pasienter med trippel negativ brystkreft har en tendens til å gjenta seg mellom 1 til 4 år, noe som tyder på dårlig kontroll over sovende tilstand. Andre celletyper, inkludert ER / PR + celler, kan forbli sovende i opptil 20 år, med en jevn, kontinuerlig frekvensen av tilbakefall 10. Mens forskjellene i dormancy genekspresjonssignaturer mellom ER + og feilbrystcellelinjer og svulster reflekterer ulike dormancy potensialer 11, interaksjoner med benmargs stroma representerer sannsynligvis et betydelig bidrag til dvalen.
Studiet av dvalen in vivo er svært vanskelig fordi mikrometastaser er sjeldne og blir overmannet av blodkreft cellene med mer enn 10 6 fold. Derfor må relevante modeller bli generert som gir in vitro data som kan foreslå mekanismer og generere testbare hypoteser in vivo. En rekke av dvalen modeller, inkludert mathetisk modeller 12,13, in vitro modeller 7,8,14,15, in vivo xenograft modeller 16, kombinasjoner av in vitro og xenograft modeller 17,18 og spontane tumor og metastase modellene 19, har gitt en viss innsikt i kreftcelle dvalen 20 . Hver av disse har sine egne begrensninger, og holder seg først og fremst nyttig for å generere hypoteser angående molekylsignalering og interaksjoner som styrer uvirksom som skal testes i flere biologisk relevante modeller.
Med det overordnede målet om å definere de molekylære mekanismene for dvalen, samhandlingene med mikromiljøet som resulterer i syklus arrest, redifferentiation og terapeutisk motstand og mekanismer som fører til tilbakefall i ER + celler, utviklet vi en in vitro modell som gir valgt relevante deler av stromal mikromiljøet 7. Denne modellen, mens relativt sparsom i sin componenter er tilstrekkelig robust til å tillate søkere til å utlede spesifikke molekylære mekanismer som påvirker vesentlige funksjonene til uvirksom. Disse eksperimentene generere hypoteser som kan være direkte testet in vivo. Modellen bygger på noen viktige elementer som vi demonstrert å være relevant i dvalen. De omfatter bruken av østrogenavhengig brystcancerceller, kultur av celler i et klonogene tetthet hvor deres interaksjon er hovedsakelig med underlaget og løselige komponenter i mediet, en fibronektin substrat og tilstedeværelsen av basisk fibroblast vekstfaktor (FGF-2) i mediet.
Vi karakterisert mekanismer som styrer systemet in vitro, inkludert induksjon av cellesyklus-stans av FGF-2 21, formidles gjennom TGFfi 22, overlevelse signalisering gjennom PI3 kinase 7,8 og ERK 8 og morphogenic differensiering til en epitelial fenotype, som var avhengig RhoA inaktivering, inte45; 5β1 oppregulering og ligering av stromal fibronektin for overlevelse 7,15 (figur 1). De in vitro cellesyklus effekter av FGF-2 på MCF-7 celler begynner ved konsentrasjoner på minst en log under 10 ng / ml 21,23. Begrunnelsen var basert på tidsmessige kontrollen av FGF-2 uttrykk som regulerer melke duktal morphogenesis, syklisk ekspansjon og resesjon i en rekke pattedyrsystemer 24-27. Vi demonstrerte at FGF-2 induserer differensiering, inkludert ductal morfogenese i 3D kultur 28, og at FGF-2 ekspresjon er vanligvis tapt med malign transformasjon av humane tumorer 29. Uttrykket av FGR1 forble intakt i brystcarsinomer kartlagt 29 og MCF-7 celler fortsette å uttrykke alle 4 FGF-reseptorer 30. I sammenheng med dvalen, er FGF-2 eksportert av og tungt avsatt på benmargen stroma 31,32 der den fungerer i bevaring av blodkreft stamceller 33. Vi demtere at FGF-2 induserer en sovende tilstand i ER + brystkreft celler dyrket på fibronectin undergrunn, også rikelig i margen, der det induserer morphogenic differensiering 7. I modellen brystkreft celler er veksten hemmes, inaktivere Rho A gjennom RhoGap GRAF, redifferentiate til en epitelial fenotype og re-express inte α5β1 lost med ondartet progresjon. De binder fibronektin gjennom inte α5β1 og aktivere overlevelse signaliserer at gjengi dem resistente mot kjemoterapi 7,8,15 (figur 1). Hemming av Rho klasse GTPases har blitt demonstrert tidligere å indusere en sovende fenotype 34.
Her vil vi skissere de spesifikke prosedyrer som vil tillate etterforskere å etablere modellen og studere spesifikke molekylære og cellulære mekanismene som styrer dvalen av ER + brystkreft celler. I forsøkene som er presentert her for å illustrere bruken av modell, Målrettet vi PI3K pathway (figur 1B) med en Akt-inhibitor og et PI3K-inhibitor og alle medlemmer av familien Rho (figur 1B) med en pan-Rho-inhibitor og en Rho-kinase (stein) inhibitor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klonogene analysen
- Forbered en enkelt celle suspensjoner av østrogenavhengige brystkreft cellelinjer MCF-7 og T47D celler ved hjelp av fremgangsmåten nedenfor
- Aspirer dyrkningsmedium (DMEM / 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum / glutamin og pen / strep) fra et 10 cm vevskulturskål som er ikke mer enn 50% sammenflytende med MCF-7 eller T-47D-celler. Skyll med PBS. Inkuber med trypsin 0,25% / 2,21 mM EDTA oppløst i DMEM høy glukose ved 37 ° C i 1-4 min.
- Kontroller cellene ved 1 minutts intervaller i henhold til et fasekontrastmikroskop for å sikre en enkelt celle fordeling. Resuspender cellene med en 2 ml pipette ved å pipettere opp og ned flere ganger for å forstyrre celle-celle-kontakt for å oppnå en nesten ufravikelig, enkelt celle status.
- Fortsett å inkubere cellene i trypsin ved 37 ° C i opp til 4 minutter hvis man observerer klumper av celler etter bare 2 min med inkubasjon. Ikke bruk disse cellene for klonogene studier hvis de forblir tilhenger til each andre etter 4 min av trypsinization fordi feilen vil bli innført i kolonien nummer yield.
MERK: Hvis cellene er klumpet seg, vil antallet kolonier dannet reflektere produktet av færre celler enn antallet inkubert. Hvis cellene er overdrevent trypsinisert, kan deres klonogene potensial bli redusert. - Tilbered en enkelt cellesuspensjon av 1500 celler / ml kultur medium i 24-brønners plater, eller mindre, (+ 500 celler / ml, avhengig av celletype eller passasje nummer), med seriefortynninger på en master-rør inneholdende hele volumet som er nødvendig for alle variablene i forsøket.
MERK: Målet er en endelig celletetthet på 800 celler / cm 2 (rekkevidde på ca 500 til 1100 celler / cm 2). Målet er å gi ca 100 + 50 kolonier, som tillater relativt enkel telling, hindrer trengsel og tillater tilstrekkelig kolonier å resultere i betydelige statistiske forskjeller når kolonier økt eller redusert med eksperimentell perturbasjoner.
- Inkuber cellene på klonogene Density Bruke stegene skissert nedenfor
- Inkuber cellene i fire brønner på 24 brønners fibronektin-belagte plater ved en tetthet på 1500 klonogene celler / brønn fra en hoved enkelt cellesuspensjon rør av 1500 celler / ml. Triturer medium som inneholder celler med en 5 ml pipette ved å tegne opp 3 ml og utlevering 1 ml medium i hver av to brønner.
MERK: Fibronektin-belagte plater bør kjøpes pre-belagt fra en kommersiell leverandør. Belegg plater utenfor et kvalitetskontrollert, automatisert prosess resulterer i en ujevn overflate uegnet for denne analysen. - Bland suspensjonen ved å pipettere opp og ned med en 5 ml pipette, utarbeide 3 ml cellesuspensjon, og fylle to brønner med 1 ml hver. Fyll bare to brønner til enhver tid fra en pipette. Returnere den gjenværende volum i pipetten til cellesuspensjonen i master tube, resuspender celler igjen ved å pipettere opp og ned og utarbeide en annen 3 ml for å fylle en annen to wells med 1 ml hver.
MERK: Kontinuerlig blanding av master røret er nødvendig fordi cellene vil kontinuerlig sedimentere. Utarbeidelse tilstrekkelig volum til å fylle bare 2 brønner er nødvendig å legge tilsvarende celle tall til hver brønn fordi cellene sedimentere i pipetten også. - Arbeide hurtig for å fordele de store volumer av celler fordi tillater celler å sitte i suspensjon ved romtemperatur og CO 2 konsentrasjon vil modulere deres klonogene potensial (upubliserte observasjoner).
- Optimalisere den romlige fordelingen av celler under loven av pipettering dem i brønner for koloni analyser. Gjør det ved langsomt å pipettere suspensjonen inneholdende det endelige cellekonsentrasjon i midten av brønnen. Ikke utsett platen for å fremme bevegelse før celler bosette til bunnen. Ikke virvle plate fordi sirkulære blandings vil effektivt sentrifuger cellene til omkretsen av de godt skaper høy celletetthet og utallige sammenflytende kolonier på seks dager.
MERK: Ikke bland mindre det er nødvendig siden dette er mindre ønskelig enn ingen blanding i det hele tatt etter innføring volumet med celler i suspensjon. Dersom det er nødvendig å blande cellene, gjøre dette ved å bevege platen frem og tilbake i perpendikulære retninger, mens den hviler på en flat overflate. - Inkuber cellene ved 37 ° C 5% CO2 uten endring av medium i 6 dager. Det lille antall celler i en brønn etter 6 dager, vil ikke vesentlig påvirke næringsstoff eller cytokin sammensetning eller pH-verdien i det opprinnelige medium.
- Utforme tidsforløpet av analysen som følger: Inkuber cellene på fibronectin belagt substratet på dag 1. Skift eksisterende medium med 1 ml friskt medium eller ferskt medium inneholdende FGF-2 10 ng / ml på dag 0. Beis cellene på dag 6 som nedenfor i 1.4). Gjennomføre noen eksperimentelle forstyrrelser på dag 3, som nedenfor i 1.3).
- Inkuber cellene i fire brønner på 24 brønners fibronektin-belagte plater ved en tetthet på 1500 klonogene celler / brønn fra en hoved enkelt cellesuspensjon rør av 1500 celler / ml. Triturer medium som inneholder celler med en 5 ml pipette ved å tegne opp 3 ml og utlevering 1 ml medium i hver av to brønner.
- Sett opp Eksperimentelle forstyrrelser av Molecular Signa eller adhesjonsmolekyler
- På dag 3, tilsett 10056; l av en oppløsning inneholdende 10 x av den endelige tilsiktede konsentrasjon av perturbing midlet til 1 ml medium i brønnene. Ikke bland. Fortsett å ruge cellene ved 37 ° C, 5% CO 2 for ytterligere 3 dager.
MERK: perturbere midler kan omfatte en rekke forskjellige inhibitorer og blokkerende midler adhesjonsmolekyler, reseptorer eller andre overflateproteiner, inhibitorer av intracellulære signalveier, molekyler, faktorer, kofaktorer eller strukturelle proteiner, som kan spille roller i å støtte den sovende tilstand. - Flekk kolonier på dag 6, som følger.
- På dag 3, tilsett 10056; l av en oppløsning inneholdende 10 x av den endelige tilsiktede konsentrasjon av perturbing midlet til 1 ml medium i brønnene. Ikke bland. Fortsett å ruge cellene ved 37 ° C, 5% CO 2 for ytterligere 3 dager.
- Stain Colonies
- Flekke celler etter seks dager i kultur med en rykende fersk 0,1% krystallfiolett i 2% etanol / 10 mM natriumborat (pH 9,0) løsning. Sug media og legge en ml krystallfiolett løsning til hver brønn for 20 min.
- Vask plater ved å dyppe dem med brønn åpningene vendt ned i en spiss vinkel i en is bøtte fylte med kontinuerlig rennende vannvann i vasken. Vipp plate til en horisontal vinkel gang under vann, godt åpne ned, og deretter vippe tilbake til en spiss vinkel når du tar på en skånsom flytende bevegelse.
- Gjenta nedsenking 2 eller 3 ganger inntil vannet i bunnen av brønnene er ikke lenger blå. Energisk vaskinger å fjerne celler eller kolonier som er mindre klebende på grunn av eksperimentelle inngrep, og legger betydelig til feil i tellingen, og dataene.
- Tørre plater over natten ved å plassere dem opp ned på håndklær på benken toppen tilknytning til deres tilsvarende merket dekker.
- Telle Colonies
- Telle antall voksende og sovende kolonier i hvert godt etter seks dagers inkubasjon, farging og tørking. Telle kolonier optimalt på 40X forstørrelse i en omvendt fase kontrast mikroskop. Telle kolonier av> 30 celler som vokser og kolonier av 12 eller færre celler, med den morfologiske utseende svært stor størrelse i forhold til voksende celler, stor expanded cytoplasma med stor cytoplasma til kjernen forholdstall, vist i figur 1 7,15.
MERK: Klynger av 13-29 celler blir normalt ikke regnet som de er ikke veldig ofte i enkle dormancy analyser. De kan telles dersom forstyrrelsene skifte vekstpotensialet av enten vokser eller sovende celler. Disse resultatene må da være korrelert med biologisk betydning.
- Telle antall voksende og sovende kolonier i hvert godt etter seks dagers inkubasjon, farging og tørking. Telle kolonier optimalt på 40X forstørrelse i en omvendt fase kontrast mikroskop. Telle kolonier av> 30 celler som vokser og kolonier av 12 eller færre celler, med den morfologiske utseende svært stor størrelse i forhold til voksende celler, stor expanded cytoplasma med stor cytoplasma til kjernen forholdstall, vist i figur 1 7,15.
2. klonogene Inkubasjon for Immunofluorescence Studies
- Juster celletall på ca. 7,500-8,000 celler / brønn på 6-brønners plater, for å svare til celle tall / overflateareal som er analog med 24 brønn eksperimenter.
- Plasser en runde, steril, fibronektin-belagt dekkglass i hver brønn base av 6 brønners plater for imaging studier før celle tillegg. Pipettes celler i 3 ml volumer til hver brønn, to brønner av gangen i konsentrasjoner beskrevet, som beskrevet for de klonogene eksperimentene ovenfor i 1.2).
- Inkuber cellenefor 6 dager, som ovenfor i 1.2.4 og 1.2.5. Legg forstyrrende faktorer på dag 3 ved 10x konsentrasjoner i 300 ul volumer, slik som beskrevet i kolonien prøveprosedyrer i 1.3).
- Beis cellene på dag 6 med antistoffer til celle adhesjonsmolekyler slik som integriner α4, α5, α6, β1, β3, for eksempel, fokal adhesjon komplekse molekyler FAK, paxillin og vinculin, for eksempel proteiner som er involvert i motilitet som α-tubulin, for eksempel signalveien medlemmer som fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, for eksempel, eller en hvilken som helst annet protein som er målet for undersøkelsen for sin rolle i uvirksom, ved bruk av standard teknikker for direkte eller indirekte immunfluorescens farging.
- Fjern lysbilder med pinsett dag 6. Fix i aceton / metanol 1: 1 ved -20 ° C i 20 minutter og lufttørk. En alternativ fikseringsmiddel, slik som paraformaldehyd, kan benyttes om nødvendig. Permeabilisere cellene med 0,1% Triton X-100, 0,1% natrium-citrat i 2 min feller påvisning av intracellulære antigener. Vask cellene med PBS.
- For indirekte immunofluorecence farging, blokk slides i 1 time ved romtemperatur med 5% BSA eller med 10% preimmunserum fra de arter som det sekundære antistoff ble generert.
- Inkuber over natten ved 4 ° C med primære antistoffer mot celleadhesjonsmolekyler, fokal komplekse molekyler, signale medlemmer spredningsveier eller andre proteiner som er gjenstand for undersøkelse for sin rolle i uvirksom fortynnet til spesifikke fortynninger anbefalt av produsenten i PBS 0,1% Triton X -100.
- Vask 3 ganger med PBS. Inkuber dekkglass med fluorofor-konjugert antistoff ved romtemperatur i 2 timer. Som et eksempel, kan Alexa Fluor 488 Esel-anti-muse-IgG-antistoff anvendes for å påvise murine monoklonale primære antistoffer. Mount Dekk celle side ned på objektglass ved hjelp av en antifade agent med Dapi. Forsegle utkant med neglelakk.
- For direkte immunfluorescens, utføre BSAblokkering som ovenfor i 2.4.2), inkuberes med fluorofor-konjugert primært antistoff over natten ved 4 ° C. Vask 3 ganger med PBS. Inkuber lysbilder med en antifade agent og Dapi og tetning med neglelakk.
- Cover lysbilde skuffer med aluminiumsfolie og oppbevar ved 4 ° C for bildebehandling og fotografering når som helst opptil flere uker senere. Se og fotografere celler ved hjelp av noen fluorescens mikroskopiske bildesystemer er utstyrt med et kamera på 1,000x forstørrelse.
- For fibrillær aktin farging, blokk lysbilder i 1% bovint serumalbumin (BSA) i 30 minutter og inkuberes i BODIPY FL-Phallacidin (grønt) eller rhodamin phalloidin (rødt) ved romtemperatur i 20 min. Legg en antifade agent og forsegle som ovenfor.
3. klonogene Inkubasjon for Molecular Studies
- Western Blot
- Inkuber ER + brystkreftceller MCF-7 eller T47D ved klonogene tettheter på 20 000 celler / 60 mm plate og 50 000 celler / 100 mm plate på fibronectinn-belagte plater ved 37 ° C i 5% CO2.
- Inkuber celler på litt høyere tettheter av 75 000 celler / 100 mm plate for molekylære studier som krever mg beløp for protein fra lysatene. Bruk opptil ti plater per eksperimentell poeng å samle tilstrekkelig protein for molekylære studier med Western blot eller for RNA isolering for Northern blot.
- Celle nummer basert gel lasting er et nødvendig supplement for å sammenligne protein uttrykk i svært ulike størrelse voksende og sovende celler. Samle celler ved trypsinizing og telle en porsjon i et hemocytometer i 0,2% trypanblått for fremstilling av lysater for Western blot i stedet for avskraping av cellene med en enkelt kant blad.
- Sentrifuger cellene ved 10 000 xg i 2 minutter, fjern mediet ved aspirasjon, tilsett 200 ul lyseringsbuffer, sonikere cellene i lyseringsbuffer og bestemme proteinkonsentrasjonen.
- Beregne mengden av protein per celle ved å dividere proteinutbytte med antall cellersom genererte dette beløpet. Installering av lysatet i hver brønn av separate polyakrylamidgeler som representerer både a) ekvivalente mengder av protein og B) proteinmengder som representerer tilsvarende celle tall. Minst 25 ug protein bør legges inn i hver brønn.
MERK: Dette vil tillate sammenligninger mellom økende og sovende celler, som er vesentlig forskjellige i størrelse og proteininnhold (figur 1).
- Flowcytometrisystemer
- Samle celler fra 100 mm plater ved trypsinering, som i 3.1 og analysere ved standard fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) protokoller ved hjelp av primær eller sekundær immunofluorescens farging for enten intracellulære eller ekstracellulære antigener, som beskrevet i 2.4.
MERK: Demontering celler fra vevskulturplater ved trypsinering ikke påvirker konsentrasjonen av membranproteiner som bestemt ved antistoffmerking.
- Samle celler fra 100 mm plater ved trypsinering, som i 3.1 og analysere ved standard fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) protokoller ved hjelp av primær eller sekundær immunofluorescens farging for enten intracellulære eller ekstracellulære antigener, som beskrevet i 2.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forsøk ble utført for å rekapitulere analysen. Tidsforløpet av forsøket er vist i figur 2A. Celler ble inkubert ved klonogene tetthet på dag -1, blir FGF-2 i friskt medium tilsatt på dag 0, og cellene blir dyrket inntil dag 6 når de er farget, og koloniene telles. Eventuelle forstyrrelser i systemet administreres på dag 3 i 100 ul volumer på 10x sluttkonsentrasjoner ønsket. Figur 2B viser et typisk utseende av voksende og sovende kolonier. Voksende kolonier inneholder> 30 celler og sovende kolonier inneholde 12 eller færre celler som er mange ganger større enn voksende celler med store cytoplasma / nucleus forholdstall. Figur 2C viser en typisk eksperimentelle resultat gjennomført i fire eksemplarer. Den dominerende fordelingen av celler uten tilsetning av FGF-2 er representert ved voksende kloner, mens det i nærvær av FGF-2, de aller fleste kloner er sovende.
ontent "> Figur 3 er et eksempel på et forsøk hvor perturbere midler ble tilsatt på dag 3. Figuren viser den doseavhengige inhibering av hvilende kloner ved inhibering av Rho familien av GTPases av en pan-Rho-inhibitor og en C3 transferase Rho-kinase (ROCK) inhibitor Y27632. Analysen kan vurdere ED 50 av tilsatte inhibitorer på hvilende kloner samt voksende kloner. I dette eksperimentet ble effekten av vekst kloner ikke bestemt, da det bare ble presentert for å illustrere metoden.Figurene 4 og 5 viser at analysen kan brukes til å vurdere de kombinerte effektene av inhibitorer på overlevelse av hvilende kloner. Våre tidligere undersøkelser har vist at PI3K veien undergår en varig aktivering i hvilende celler i denne modellen, og hemming av både PI3K og Akt delvis hemmer overlevelsen av hvilende kloner 7. Her foreløpige observasjoner, demonstrerte tlue ikke-spesifikk inhibering av Rho familie av små GTPases også delvis hemmer overlevelse av hvilende kloner. Data presentert i figur 4 og 5 viser at ved å kombinere hemming av PI3K og en av dens nedstrøms effektorer, AKT, med inhibering av Rho familie med C3 transferase og ROCK-inhibitor kan nesten fullstendig eliminere overlevelsen av sovende kloner i enkelte tilfeller. Vi har tidligere demonstrert at hvil Kloner som overlevde ved inhibering av PI3K, men ikke av Akt består av celler som ikke lenger oppviser den sovende fenotype, men snarere synes mesenchymale og Used 7. Celler i sovende kloner der Rho familien har vært bredt hemmet av C3 transferase og ROCK hemmer også miste den typiske sovende utseende, antar fibrolastoid opptredener og ruffled membraner og også vises distressed (figur 6). Disse eksperimentene viser en modell som kan undersøkes i en meget broad måte å oppnå en forståelse av elementene som styrer dvalen og motstand mot terapi.
Figur 1: mekanismer som styrer våre in vitro uvirksom modellen (A) Dyrking og hvil MCF-7 kloner etter 6 dagers inkubasjon ved klonogene tetthet på fibronektin-belagte plater med og uten FGF2 10 ng / ml 7 (100X forstørrelse).. (B) Oppsummering skjema som beskriver dataene som FGFR og inte α5β1 parallelt steady state signalering er nødvendig for å aktivere og opprettholde dvalen 7. FGF-2 oppregulerer cyklinavhengige kinaseinhibitorer resulterer i G1 arrest 21, aktiverer ERK 8 og PI3 kinase 7 som initiatesurvival signalering og oppregulere grin α5β1 7, som når stabil tilstand etter flere dager. Dual signale through FGFR gjennom PI3K og uavhengig gjennom ligation av inte α5β1 av fibronektin kreves for aktivering av FAK og membran lokalisering og aktivering av RhoA GAP GRAF 15. Dette resulterer i inaktivering av RhoA og en ettergivende steady state for cortical omorganisering av F-aktin (phalloidin-farget mikrofotografi), epitelial re-differensiering og dvalen 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Elementer av in vitro-assay uvirksom (A)-skjema av de tidsmessige komponenter i uvirksom analysen.. Celler blir inkubert på fibronectin belagte vevskulturplater ved klonogene densitet, med en maksimal densitet på 1500 celler / brønn i en 24-brønners plate i en incubator ved 37 ° C og 5% CO 2 på dag 1. Mediet blir erstattet på dag 0 med friskt medium eller ferskt medium inneholdende FGF-2 10 ng / ml og cellene på nytt inkubert. Celler blir farget med krystallfiolett-oppløsning, som beskrevet, på dag 6. Eventuelle inhibitorer eller perturbasjonsteknikker midler blir tilsatt på dag 3 i 100 ul volum ved 10x ønskede konsentrasjon, og cellene blir inkubert inntil dag 6. (B) Utseendet av farget vokser og hvile MCF-7 kolonier. Voksende kolonier inneholder> 30 celler og sovende kolonier inneholde 12 eller færre celler. Sovende celler er pannekake formet, mange ganger større enn voksende celler med store cytoplasma / nucleus forholdstall. (100X forstørrelse). (C) Diagram som viser den klonogene potensialet i 1500 MCF-7 humane brystcancerceller ble inkubert med og uten FGF-2 10 ng / ml på fibronektin-belagte 24-brønners plater. Uten FGF-2, er den dominerende fordelingen av celler representert av voksende kloner, mens i nærvær av FGF- 2 de aller fleste kloner er sovende. Forsøk ble utført i fire paralleller. (Feilfelt er + SD)
Figur 3: Doseavhengig inhibering av hvilende kloner av Pan-Rho familien inhibitorene C3 transferase og ROCK inhibitor Y27632 T-47D-celler ble inkubert ved klonogene tetthet på 1000 celler per brønn i 24-brønners fibronektin-belagte plater med FGF-2. 10 ng / ml for 6 dager. Media, C3 transferase 3 eller 5 ug / ml, og ROCK inhibitor Y27632 0,1, 1 eller 10 pg / ml var på dag 3 og hvilende kloner ble tellet på dag 6. Diagrammet viser en doseavhengig inhibering av farget hvilende på kloner dag 6. ED 50 av C3 var omtrent 3 pg / ml, mens det av den ROCK inhibitor var mellom 1 og 10 mikrometer i denne analysen. Forsøk ble utført i fire paralleller. (Feilfelt er + SD)
Fig. 4: kombinerte effekten av pan-Rho familien inhibitor C3 med en Akt-inhibitor eller med PI3 kinase inhibitor på overlevelse av hvilende T-47D-kloner T-47D-celler ble inkubert ved klonogene tetthet på 1000 celler per brønn i 24-brønners fibronektin -belagte plater med FGF-2 10 ng / ml i 6 dager. Media, C3-transferase 5 ug / ml, Akt inhibitor 25 uM og 20 uM LY294002 ble tilsatt enkeltvis eller i kombinasjon på dag 3 og hvilende kloner ble tellet på dag 6. De kombinerte effekten av C3 og AKT-inhibitor synes å være additive ved disse konsentrasjoner, men den kombinerte effekten av C3 og PI3K inhibitor synes å være synergistisk i disse forsøk med inhibering av sovende klon overlevelse. Forsøk ble utført i fire paralleller. (Feilfelt er + SD)
= "Figur 5" src = "/ files / ftp_upload / 52672 / 52672fig5.jpg" />
Figur 5:. Kombinerte effekter av ROCK-inhibitor Y27632 med en Akt-inhibitor eller med PI3 kinase inhibitor på overlevelse av hvilende T-47D-kloner T-47D-celler ble inkubert ved klonogene tetthet på 1000 celler per brønn i 24-brønners fibronektin-belagte plater med FGF-2 10 ng / ml i 6 dager. Media, ROCK hemmer Y27632 3 ng / ml, Akt hemmer 25 mikrometer og LY294002 20 mikrometer ble lagt enkeltvis eller i kombinasjon på dag 3 og sovende kloner ble telles på dag 6. Den kombinerte effekten av Y27632 og AKT hemmer ikke ut til å være additiv på disse konsentrasjoner, men den kombinerte effekten av Y27632 og PI3K inhibitor synes å være mer enn additiv i disse forsøk med inhibering av sovende klon overlevelse. Forsøk ble utført i fire paralleller. (Feilfelt er + SD)
.jpg "/>
Figur 6:. Utseendet av etterlatte hvilende T-47D kloner etter behandling med C3-transferase og ROCK-inhibitor Y27632 Colony analyser ble etablert i fire i 24 tillegg fibronectin belagte vevskulturplater ved 1000 celler / brønn med FGF-2, slik det er beskrevet, hemmere ble lagt på dag 3 på konsentrasjonene vist, ble cellene farget og fotografert på dag 6. celler behandlet med pan-Rho familie hemmere mistet sin spredning utseende, ble liten, dendrittiske og dukket opp distressed. (100X forstørrelse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår modell består av flere viktige elementer av dvalen i benmargen. Den består av østrogensensitive celler, som er den type som sannsynligvis vil forbli latent i margen i lengre perioder 10, den består av fibronektin, et sentralt strukturelement av marg, FGF-2, en vekstfaktor rikelig syntetisert ved benmargen stroma og tungt deponert i ekstracellulære matrise av benmargen 31,32 og inkubasjon av cellene ved klonogene tetthet hvor deres interaksjoner er primært med underlaget. Mens mikromiljøet i benmargen er langt mer komplekse, kan dette enkle systemet bygges opp med så mye ekstra kompleksitet som nødvendig for å stille konkrete mekanistiske spørsmål.
Modellen kan brukes til å sammenligne sovende med voksende celler i en rekke måter, inkludert cellen biologiske teknikker, molekylære teknikker og in vivo teknikker. Cellulære fenotyper kan analyseres ved å re-kloning, motilitetog invasjon studerer 35, tilfestede svulst initiere spherule dannelse 36 eller ved funksjonelle studier for interaksjon med mikromiljøet ved hjelp av bestemte blokkerer antistoffer eller peptider 7.
Den primære Utgangen av klonogene analysen er en numerisk telling av kolonier, enten økende eller sovende, som kan oversettes til det voksende eller sovende klonogene potensial av cellene. Som antydet ovenfor, et stort antall variabler har potensialet til å påvirke dette utfallet, som alle må styres så strengt som mulig for å gi reproduserbare resultater. Disse inkluderer kilden til cellene, total passasje nummer, kryopreservering teknikk og kvaliteten av cellekulturer som ble oppbevart, antallet passeringer siden tining, sammenløpet av kulturer som enkeltcellepreparater ble oppnådd, kilden og kvaliteten av føtalt kalveserum, varigheten av trypsinering og deres reproduserbarhet, varighetenav celler stå ved romtemperatur, fingerferdighet for å pipettere tilsvarende celletall i hver brønn, fingerferdighet eller jevn fordeling av cellene på tvers av hele arealet av en brønn, hvor mange ganger en plate er fjernet fra inkubatoren for observasjon, blant mange andre. I tillegg til å representere allment aksepterte vev kultur kvalitetskontroller, disse variablene påvirker den sovende klonogene potensial fra eksperiment for å eksperimentere. Intra-eksperimentell variabilitet er typisk mindre enn 8-10%, men for å resultere i prosentvise endringer fra eksperiment eksperiment som er reproduserbar. Vanligvis begynner variansen av data til å avta med en direkte sammenheng med økt opplevelse av experimenter med systemet og tidsbruk å gjennomføre denne analysen.
Genekspresjon i en hvileperiode og voksende celler kan vurderes ved RT PCR, Northern blot, Western blot, immunopresipitering / vest- og funksjonelt kompleks utfelling / Western, Immunfluorescens eller immunhistokjemi, multipleksing av MicroFluidics, Raman-spektroskopi, flowcytometri og andre teknikker. Disse teknikkene kan brukes til å bestemme rollene til spesifikke reseptorer, andre membran proteiner, signalveier, transkripsjonsfaktorer, histone modifikatorer, organeller og mitokondrielle proteiner, metabolske veier og energiutnyttelse, spenning og kraft og samspill med mikromiljøet på utallige måter på rollen av dvalen.
Våre tidligere undersøkelser har vist en betydelig rolle for PI3K baner i overlevelse av hvilende kloner 7, så vel som å opprettholde den sovende fenotype med epithelial fordelingen av kortikale aktin 15. Vi demonstrerte også at RhoA bestemt må være sperret for at sovende fenotype som skal aktiveres. Dette er i motsetning til de data som er presentert her, hvor inaktivering av Rho familie med pan-hemmere avtar overlevelse av hvilende kloner. Thans understreker faren for å bruke kjemiske inhibitorer å dissekere mekanismer og behovet for bruk av genetiske metoder for å hemme eller aktivere bestemte veier. For dette formål, gir metodikk seg til genetisk manipulering av celler, enten ved permanent transfeksjon eller transduksjon eller ved forbigående transfeksjon 15, siRNA eller nanopartikler. Siden analysen er 6 dager i varighet, forbigående genuttrykk eller interferens med det vil resultere i betydelige fenotypiske effekter på 6 dager som kan måles.
Erkjennelsen sitt potensial for å studere mekanismene for å angi samt spennende dvalen, er vi undersøker mekanismer for disse cellene til å flykte dvalen. Når du skriver inn dvalen er dårlig forstått, er en forståelse av mekanismene som styrer exit fra sovende tilstand enda mer unnvikende. Vi har rapportert foreløpige observasjoner som betennelsesreaksjoner etter skadde stroma kan bidra til gjenoppvåkning av dormant MCF-7 celler ved hjelp av denne modellen 37. Modellen kan brukes til T-47-celler, så vel, en annen ER + brystkreft-cellelinje. Mens ER- cellene ikke blir sovende i respons til FGF-2, kan det være mulig å tilpasse metoden til andre kreftcelletyper med forskjellige differensieringsmidler i fremtidige undersøkelser.
Til tross for å være en meget nyttig teknikk for å identifisere tangentmekanisme er involvert i uvirksom, forblir det en in vitro-modell. Imidlertid kan celler som har gjennomgått uvirksom eller in vitro manipulasjon testes for tumor xenograft dannende evne. Den viktigste potensielle nytte av systemet, men er identifisering av mekanismer som vil gjøre det mulig å utvikle en hypotese som kan bli testet i meget komplekse in vivo dormancy modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Støttet av Department of Defense Grants DAMD17-01-C-0343 og DAMD17-03-1-0524, New Jersey State Commission on Cancer Research 02-1140-CCR-E0 og Ruth Estrin Goldberg Memorial for Cancer Research (RW)
Acknowledgments
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cells | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Liquid | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitor |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (green) | Molecular Probes | B607 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red) | Molecular Probes | R415 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
References
- Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
- Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
- Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
- Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
- Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
- Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
- Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
- Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
- Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
- Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).
- Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
- Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
- Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914 (2011).
- Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
- Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
- Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
- Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
- Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
- Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
- Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
- Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
- Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
- Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
- Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
- Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
- Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
- Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
- Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
- Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
- Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
- Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).
