En<em> In Vitro</em> Dormancy Modell av østrogen-sensitive brystkreft i benmargen: Et verktøy for molekylære mekanismen Studier og Hypotese Generation

Summary

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduction

Brystkreft celler metastaserer til benmargen før sykdommen er detekterbar ^1, så snart små svulster utvikle blodkar ^2,3. Den metastatisk prosessen er rask, men ineffektiv. Celler inn nye blodkar raskt, på millioner per dag ^4, men få overleve turen til fjerne organer ^5. Likevel, noen mikrometastaser overleve i bein og kan bli funnet som enkeltceller eller små celleklumper i beinmargs aspirates fra nydiagnostiserte pasienter ^1. Disse cellene motstå adjuvant kjemoterapi, som administreres for aller formål å eliminere dem ^seks. Denne motstanden er utrustet, vesentlig, etter overlevelse signale initiert av interaksjoner med mikromiljøet i benmargen ^7,8. Mikrometastaser kan bli funnet i omtrent en tredjedel av kvinner med lokalisert brystkreft og representerer en uavhengig indikator på overlevelse ved analyse ved univariate analyse ^9. Noen micrometastases er vekst initiert, men tilbakefall mønstre avhengig av celletype. Pasienter med trippel negativ brystkreft har en tendens til å gjenta seg mellom 1 til 4 år, noe som tyder på dårlig kontroll over sovende tilstand. Andre celletyper, inkludert ER / PR + celler, kan forbli sovende i opptil 20 år, med en jevn, kontinuerlig frekvensen av tilbakefall ^10. Mens forskjellene i dormancy genekspresjonssignaturer mellom ER + og feilbrystcellelinjer og svulster reflekterer ulike dormancy potensialer ^11, interaksjoner med benmargs stroma representerer sannsynligvis et betydelig bidrag til dvalen.

Studiet av dvalen in vivo er svært vanskelig fordi mikrometastaser er sjeldne og blir overmannet av blodkreft cellene med mer enn 10 ⁶ fold. Derfor må relevante modeller bli generert som gir in vitro data som kan foreslå mekanismer og generere testbare hypoteser in vivo. En rekke av dvalen modeller, inkludert mathetisk modeller ^12,13, in vitro modeller ^7,8,14,15, in vivo xenograft modeller ^16, kombinasjoner av in vitro og xenograft modeller ^17,18 og spontane tumor og metastase modellene ^19, har gitt en viss innsikt i kreftcelle dvalen ²⁰ . Hver av disse har sine egne begrensninger, og holder seg først og fremst nyttig for å generere hypoteser angående molekylsignalering og interaksjoner som styrer uvirksom som skal testes i flere biologisk relevante modeller.

Med det overordnede målet om å definere de molekylære mekanismene for dvalen, samhandlingene med mikromiljøet som resulterer i syklus arrest, redifferentiation og terapeutisk motstand og mekanismer som fører til tilbakefall i ER + celler, utviklet vi en in vitro modell som gir valgt relevante deler av stromal mikromiljøet ^7. Denne modellen, mens relativt sparsom i sin componenter er tilstrekkelig robust til å tillate søkere til å utlede spesifikke molekylære mekanismer som påvirker vesentlige funksjonene til uvirksom. Disse eksperimentene generere hypoteser som kan være direkte testet in vivo. Modellen bygger på noen viktige elementer som vi demonstrert å være relevant i dvalen. De omfatter bruken av østrogenavhengig brystcancerceller, kultur av celler i et klonogene tetthet hvor deres interaksjon er hovedsakelig med underlaget og løselige komponenter i mediet, en fibronektin substrat og tilstedeværelsen av basisk fibroblast vekstfaktor (FGF-2) i mediet.

Vi karakterisert mekanismer som styrer systemet in vitro, inkludert induksjon av cellesyklus-stans av FGF-2 ^21, formidles gjennom TGFfi ^22, overlevelse signalisering gjennom PI3 kinase ^7,8 og ERK ⁸ og morphogenic differensiering til en epitelial fenotype, som var avhengig RhoA inaktivering, inte45; 5β1 oppregulering og ligering av stromal fibronektin for overlevelse ^7,15 (figur 1). De in vitro cellesyklus effekter av FGF-2 på MCF-7 celler begynner ved konsentrasjoner på minst en log under 10 ng / ml ^21,23. Begrunnelsen var basert på tidsmessige kontrollen av FGF-2 uttrykk som regulerer melke duktal morphogenesis, syklisk ekspansjon og resesjon i en rekke pattedyrsystemer ^24-27. Vi demonstrerte at FGF-2 induserer differensiering, inkludert ductal morfogenese i 3D kultur ^28, og at FGF-2 ekspresjon er vanligvis tapt med malign transformasjon av humane tumorer ^29. Uttrykket av FGR1 forble intakt i brystcarsinomer kartlagt ²⁹ og MCF-7 celler fortsette å uttrykke alle 4 FGF-reseptorer ^30. I sammenheng med dvalen, er FGF-2 eksportert av og tungt avsatt på benmargen stroma ^31,32 der den fungerer i bevaring av blodkreft stamceller ^33. Vi demtere at FGF-2 induserer en sovende tilstand i ER + brystkreft celler dyrket på fibronectin undergrunn, også rikelig i margen, der det induserer morphogenic differensiering ^7. I modellen brystkreft celler er veksten hemmes, inaktivere Rho A gjennom RhoGap GRAF, redifferentiate til en epitelial fenotype og re-express inte α5β1 lost med ondartet progresjon. De binder fibronektin gjennom inte α5β1 og aktivere overlevelse signaliserer at gjengi dem resistente mot kjemoterapi ^7,8,15 (figur 1). Hemming av Rho klasse GTPases har blitt demonstrert tidligere å indusere en sovende fenotype ^34.

Her vil vi skissere de spesifikke prosedyrer som vil tillate etterforskere å etablere modellen og studere spesifikke molekylære og cellulære mekanismene som styrer dvalen av ER + brystkreft celler. I forsøkene som er presentert her for å illustrere bruken av modell, Målrettet vi PI3K pathway (figur 1B) med en Akt-inhibitor og et PI3K-inhibitor og alle medlemmer av familien Rho (figur 1B) med en pan-Rho-inhibitor og en Rho-kinase (stein) inhibitor.

Protocol

1. klonogene analysen Forbered en enkelt celle suspensjoner av østrogenavhengige brystkreft cellelinjer MCF-7 og T47D celler ved hjelp av fremgangsmåten nedenfor Aspirer dyrkningsmedium (DMEM / 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum / glutamin og pen / strep) fra et 10 cm vevskulturskål som er ikke mer enn 50% sammenflytende med MCF-7 eller T-47D-celler. Skyll med PBS. Inkuber med trypsin 0,25% / 2,21 mM EDTA oppløst i DMEM høy glukose ved 37 ° C i 1-4 min. Kontroller cellene ved 1 m…

Representative Results

Forsøk ble utført for å rekapitulere analysen. Tidsforløpet av forsøket er vist i figur 2A. Celler ble inkubert ved klonogene tetthet på dag -1, blir FGF-2 i friskt medium tilsatt på dag 0, og cellene blir dyrket inntil dag 6 når de er farget, og koloniene telles. Eventuelle forstyrrelser i systemet administreres på dag 3 i 100 ul volumer på 10x sluttkonsentrasjoner ønsket. Figur 2B viser et typisk utseende av voksende og sovende kolonier. Voksende kolonier inneholder&g…

Discussion

Vår modell består av flere viktige elementer av dvalen i benmargen. Den består av østrogensensitive celler, som er den type som sannsynligvis vil forbli latent i margen i lengre perioder ^10, den består av fibronektin, et sentralt strukturelement av marg, FGF-2, en vekstfaktor rikelig syntetisert ved benmargen stroma og tungt deponert i ekstracellulære matrise av benmargen ^31,32 og inkubasjon av cellene ved klonogene tetthet hvor deres interaksjoner er primært med underlaget. Mens mikromiljø…

Materials

MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931