Produktion, karakterisering og potentielle anvendelse af en 3D-Tissue-manipuleret humant Esophageal Mucosal Model

Summary

Dette manuskript beskriver produktion, karakterisering og potentielle anvendelser af et manipuleret væv 3D esophageal konstruktion fremstillet af normal primære humane esophageal fibroblast og pladeepitelceller podet i en de-cellularized porcint stillads. Resultaterne demonstrerer dannelsen af ​​et modent stratificeret epitel ligner den normale menneskelige spiserøret.

Abstract

Forekomsten af ​​både esophageal adenocarcinom og dens forløber, Barretts Metaplasi, stiger hurtigt i den vestlige verden. Endvidere esophageal adenocarcinom har generelt en dårlig prognose, med en lille forbedring i overlevelsesrater i de senere år. Det er vanskelige betingelser for at studere, og der har været en mangel på egnede eksperimentelle platforme til at undersøge sygdomme i esophageal slimhinde.

En model af den menneskelige esophageal mucosa er blevet udviklet i MacNeil laboratorium, som i modsætning til konventionelle 2D cellekultursystemer, rekapitulerer celle-celle og celle-matrix-interaktioner stede in vivo og danner en moden, stratificeret epitel ligner den normale menneskelige spiserøret. Kort fortalt modellen udnytter ikke-transformerede normale primære humane esophageal fibroblaster og epitelceller dyrket i et porcin-afledt acellulær esophageal stillads. Immunhistokemisk karakterisering af denne modelaf CK4, CK14, Ki67 og involucrin farvning demonstrerer passende sammenfatning af histologi af den normale menneskelige esophageal slimhinde.

Denne model giver en robust, biologisk relevant eksperimentel model af den menneskelige esophageal mucosa. Det kan nemt manipuleres til at undersøge en række forskningsspørgsmål, herunder effektiviteten af ​​farmakologiske midler og virkningen af ​​udsættelse for miljøfaktorer såsom alkohol, toksiner, høj temperatur eller mave-esophageal refluxate komponenter. Modellen letter også forlængede kultur perioder ikke opnåelige med konventionel 2D cellekultur, så bl.a. undersøgelsen af virkningen af gentagen eksponering af en moden epitel til agenten af interesse i op til 20 dage. Desuden er en række forskellige cellelinjer, såsom de afledt af esophageal tumorer eller Barretts Metaplasi, kan inkorporeres i modellen til at undersøge processer såsom tumorinvasion og drug responsiveness i en mere biologisk relevant miljø.

Introduction

Esophageal mucosa omfatter en stratificeret, pladeepitel over et lag af bindevæv, lamina propria, og er en af ​​de første sider for at støde indtagne miljømæssige stressfaktorer. Udsættelse for diætetiske toksiner er impliceret i udviklingen af ​​esophageal pladecarcinom, mens duodenogastro-esophageal reflux er en kritisk faktor i patogenesen af ​​Barretts Metaplasi, som er forbundet med øget risiko for progression til esophageal adenocarcinom. Esophageal karcinomer er den ^8. mest almindelige ondartet svulst i britiske mænd og esophageal adenocarcinom er hastigt stigende i den vestlige verden ^1. Desuden har der været en lille forbedring i sygdommen prognose, med en samlet 5-års overlevelse på omkring 15%. Derfor er der behov for eksperimentelle platforme for at undersøge virkningen af ​​eksponering for miljømæssige stressfaktorer på denne esophageal epitel og deres potentielle engagement i udvikpment af metaplasi eller neoplasi.

Skønt immortaliserede eller tumorcellelinier tillader forskerne at studere respons af epitelceller til disse stressfaktorer in vitro, forbliver de proliferative og undlader at differentiere til de modne epitelceller findes på de øverste lag af esophageal mucosa. Endvidere kan cellelinier, som allerede gennemgået tumorigenese giver kun begrænset information om de indledende reaktioner af normale celler i epitel miljøfaktorer; og dette er den fase, hvor potentialet for terapeutisk intervention kan være højest. Endelig konventionelle cellekultursystemer undlader at indfange de potentielt vigtige vekselvirkninger mellem epitel- og mesenchymale celler og mellem disse celler og den omgivende matrix, der forekommer inden væv in vivo.

Dyremodeller giver et mere realistisk mikromiljø for at studere svarene fra esophageal epithelium og kan optage den kunstige induktion af gastro-øsofageal reflukssygdom ^2. Men det kan være mere udfordrende at manipulere de miljømæssige stressfaktorer i disse modeller, og de kan ikke fuldt ud repræsentere svar inden for den menneskelige spiserøret.

Andre eksperimentelle humane esophageal modeller er blevet udviklet, som anvender primære celler, udødeliggjorte celler eller tumorcellelinier på et collagen, eller kombineret kollagen / Matrigel, stillads indeholdende fibroblaster ^3,4. Det er mindre arbejdskrævende at generere disse scaffolds end acellulær esophageal stillads beskrevet i dette manuskript, og disse organotypiske modeller giver et nyttigt redskab, især i studiet af tumorinvasion ^5,6, hvor tumorcelle infiltration i kollagen gel kan let observeret. Men disse kollagengeler har ikke-indfødte mekaniske egenskaber og mangler visse funktioner i det oprindelige væv, herunder en specifik basalmembran og appropriate overflade topografi. Dette kan påvirke adfærden hos celler, hvilket resulterer i, for eksempel, dårligere vedhæftning mellem epitelet og stillads ved brug af en kollagengel stillads ^7. Som følge heraf acellulær porcin esophageal stillads blev udviklet, med den fordel, at en mere biologisk realistisk stillads og således mere egnet til anvendelse som en eksperimentel platform. Det har også vist sig, at det er bedre at inkorporere primære celler i esophageal konstruktioner end immortaliserede esophageal epiteliale cellelinjer, såsom Het-1A, da disse celler danner en flerlaget epitel, men undlader at stratificere eller differentiere ^4,7,8 .

Derfor har denne protokol blevet tilpasset fra en metode, der allerede er i brug i MacNeil laboratoriet for at gøre manipuleret væv hud og mundslimhinden ^9,10 og indeholder en de-cellularized porcint esophageal stillads kombineret med primære humane øsofageale epitelceller og fibroblaster. This protokol producerer et modent, stratificeret epitel, svarende til den i det normale humane esophagus som påvist af CK4, CK14, Ki67 og involucrin farvning. Den resulterende model giver en eksperimentel platform til at studere reaktioner på miljømæssige stressfaktorer, og har været brugt effektivt til at undersøge ændringer i genekspression i esophageal epitel svar på refluxate komponenter ^11.

Protocol

Humane øsofageale celler opnås fra patienter, der undergår gastrisk eller esophageal kirurgi. Informeret samtykke opnås for det væv, der skal bruges til forskningsformål, og vævet anvendes anonymt under de relevante etiske godkendelser (SSREC 165/03, Human Research Tissue Bank Licence 12179). 1. Isolering af humane Esophageal epitelceller Arbejde i en laminar strømning vævskultur hætte og under anvendelse af steril teknik forberede epitel dyrkningsmedium ved blanding Dulbeccos modificerede E…

Representative Results

Dette håndskrift beskriver processen krævede, vist i skematisk form i figur 1, til kultur 3D-modeller af det menneskelige esophageal epitel med succes. For at bekræfte egnetheden af ​​modellen som en eksperimentel platform histologiske og immunhistokemiske undersøgelser er blevet gennemført sammenligne de dyrkede væv med humant normalt esophageal skællede slimhinde. Histologisk vurdering af epitelet fremstillet ved den beskrevne fremgangsmåde viser en moden, fler…

Discussion

Dette manuskript beskriver fremstilling og karakterisering af en biologisk relevant menneskelig esophageal slimhinde model egnet til anvendelse som en eksperimentel platform for at studere virkningen af ​​eksponering for miljømæssige stressfaktorer på esophageal epitel.

De mest kritiske trin for vellykket produktion af en human esophageal mucosal model er: at sikre, at størstedelen af ​​de epiteliale celler forbliver proliferative og ikke allerede begyndt at differentiere før s?…

Materials

Trypsin	BD Biosciences	215240	Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use
DMEM	Labtech	LM-D1112	Warm in 37°C water bath before use
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37°C water bath before use
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Epidermal Growth Factor	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare stock solution in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Brand name Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidone-iodine solution	Ecolab	10830E	Brand name Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
NaCl	Sigma-Aldrich	433209	Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Newborn calf serum	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use
O-phosphorylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
ITS (insulin, transferrin, selenium)	Lonza	17-838Z	Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37°C water bath before use
EDTA 0.02% solution	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37°C water bath before use
T75 culture flask	VWR	734-2313
50 ml centrifuge tube	Fisher	11819650
15 ml universal tube	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petri dish	SLS	150350
6 well plate	VWR	734-2323
stainless steel rings			Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids			Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1 Use at 1:100
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10 Use at 1:200
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002 Use at 1:200
Involucrin	Novocastra	INV	Clone  SY5 Use at 1:100
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts	ATCC-LGC	CRL-1658	previously growth arrested by irradiation (60 Gy)