Dit manuscript beschrijft de productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een tissue engineered 3D-oesofageale construct bereid uit normale primaire menselijke slokdarm fibroblast en squameuze epitheelcellen gezaaid binnen een de-cellularized varkens schavot. De resultaten tonen de vorming van een volwassen gelaagd epitheel gelijk aan de normale menselijke esophagus.
De incidentie van zowel esophageal adenocarcinoom en haar voorloper, Barrett's Metaplasie, snel stijgen in de westerse wereld. Verder esophageal adenocarcinoom in het algemeen een slechte prognose, met weinig verbetering in overleving afgelopen jaren. Dit zijn moeilijke omstandigheden te bestuderen en er is een gebrek aan geschikte experimentele platformen om aandoeningen van de slokdarm slijmvlies onderzoeken geweest.
Een model van de menselijke slokdarm slijmvlies is in de MacNeil laboratorium dat, in tegenstelling tot conventionele 2D celkweek systemen, recapituleert de cel-cel en cel-matrix interacties die in vivo en produceert een volwassen gestratificeerde epitheel vergelijkbaar met die van de normale menselijke ontwikkeling slokdarm. In het kort, het model maakt gebruik van niet-getransformeerde normale primaire menselijke esophagus fibroblasten en epitheelcellen gekweekt bij een-varken afgeleide acellulaire esophageal scaffold. Immunohistochemische karakterisering van dit modeldoor CK4, CK14, Ki67 en involucrine vlekken toont juiste herhaling van de histologie van het normale menselijke slokdarm slijmvlies.
Dit model verschaft een robuuste, biologisch relevant testmodel van het menselijke oesofageale slijmvlies. Het kan gemakkelijk worden gemanipuleerd om een aantal research vragen waarbij de effectiviteit van farmacologische middelen en het effect van blootstelling aan milieufactoren zoals alcohol, toxinen, hoge temperatuur of gastro-oesofageale refluxaat componenten onderzoeken. Het model maakt ook langere kweek niet worden bereikt met conventionele 2D celkweek, waardoor onder meer de studie van de effecten van herhaalde blootstelling van een volwassen epitheel aan het agens van belang tot 20 dagen. Verder zijn diverse cellijnen, zoals die afgeleid van oesofageale tumoren of Barrett's metaplasie kan worden in het model opgenomen processen als tumorinvasie en drugs responsivene onderzoekenss in een biologisch relevante omgeving.
Het oesofageale slijmvlies omvat een gelaagd, plaveiselepitheel boven een laag van bindweefsel, de lamina propria, en is één van de eerste locaties aan geconsumeerde milieustressoren tegenkomen. Blootstelling aan voedingstoxines is betrokken bij het ontstaan van slokdarmkanker squameus carcinoom, terwijl duodenogastro-oesofageale reflux is een kritische factor in de pathogenese van Barrett's metaplasie die is geassocieerd met een verhoogd risico om esophageal adenocarcinoom. Oesofageale carcinomen zijn de 8e meest voorkomende kwaadaardige tumor in het Verenigd Koninkrijk mannen en slokdarmkanker adenocarcinoom neemt snel toe in de westerse wereld 1. Verder is er weinig verbetering in ziekteprognose, met een totale 5-jaars overlevingspercentage van ongeveer 15% geweest. Er is daarom behoefte experimenteerplatforms het effect van blootstelling aan milieustressoren deze esophagus epithelium en hun mogelijke betrokkenheid bij de ontwikke onderzoekenpment van metaplasia of neoplasie.
Hoewel geïmmortaliseerde of tumorcellijnen kunnen onderzoekers om de respons van epitheelcellen deze stressoren in vitro bestuderen, blijven ze proliferatieve en niet te differentiëren in de rijpe epitheelcellen op de bovenste lagen van de oesofageale slijmvlies. Voorts kunnen cellijnen die al tumorigenese hebben ondergaan slechts beperkte informatie over de eerste reacties van normale cellen in het epitheel milieufactoren verschaffen; en dit is de fase waarin de mogelijkheden voor therapeutische interventie hoogst kunnen zijn. Tenslotte conventionele celkweek systemen niet de potentieel belangrijke interacties tussen epitheliale en mesenchymale cellen en tussen cellen en de omringende matrix die binnen de weefsels in vivo te vangen.
Diermodellen een meer realistische micro-omgeving voor het bestuderen van de reacties van de slokdarm epithelium en kan de kunstmatige inductie van gastro-oesofageale refluxziekte 2 op te nemen. Het kan echter een grotere uitdaging om de milieu stressoren in deze modellen te manipuleren zijn en ze kunnen niet volledig de reactie binnen het menselijke slokdarm vertegenwoordigen.
Andere experimentele menselijke esophagus modellen ontwikkeld dat primaire cellen, geïmmortaliseerde cellen of tumorcellijnen gebruik op een collageen of gecombineerde collageen / Matrigel, scaffold met fibroblasten 3,4. Het is minder arbeidsintensief deze scaffolds dan acellulaire esophageal scaffold in dit manuscript beschreven genereren en deze organotypische modellen verschaffen een nuttig hulpmiddel, met name in de studie van tumorinvasie 5,6, waarbij tumorcelinfiltratie in de collageengel gemakkelijk kan worden waargenomen. Maar deze collageen gels hebben niet-inheemse mechanische eigenschappen en gebrek aan bepaalde kenmerken van het oorspronkelijke weefsel, met inbegrip van een specifiek basaal membraan en de appropriate oppervlaktetopografie. Dit kan het gedrag van cellen resulterend in beïnvloeden, bijvoorbeeld slechtere hechting tussen epitheel en scaffold bij gebruik van een collageengel scaffold 7. Bijgevolg zijn de acellulaire varkens esophageal scaffold ontwikkeld met het voordeel dat een biologisch realistische scaffold en dus meer geschikt voor gebruik als experimenteel platform. Ook is gebleken dat het beter is om primaire cellen nemen in de esophagus constructen dan geïmmortaliseerde slokdarm epitheliale cellijnen zoals Het-1A, aangezien deze cellen vormen een gelaagd epitheel maar niet om stratificeren en differentiëren 4,7,8 .
Bijgevolg is dit protocol werd aangepast van een methode die al in gebruik in de MacNeil laboratorium voor het maken van tissue engineered huid en het mondslijmvlies 9,10 en bevat een de-cellularized varkens slokdarm steiger in combinatie met primaire menselijke slokdarm epitheliale cellen en fibroblasten. This protocol vormt een volwassen gestratificeerde epitheel, vergelijkbaar met die van de normale menselijke esophagus zoals blijkt uit CK4, CK14, Ki67 en involucrine kleuring. Het resulterende model biedt een experimenteel platform voor reacties op milieustressoren studeren, en daadwerkelijk is gebruikt om veranderingen in genexpressie te onderzoeken in de slokdarm epitheel in reactie op de onderdelen 11 refluxaat.
Dit manuscript beschrijft de productie en karakterisering van een biologisch relevante menselijke esophagus mucosale model geschikt voor gebruik als een experimenteel platform om het effect van blootstelling aan milieustressoren op de esophagus epithelium bestuderen.
De belangrijkste stappen voor de succesvolle productie van een humaan oesofageale slijmvlies model zijn: ervoor zorgen dat de meeste epitheelcellen proliferatieve blijven zitten en nog niet begonnen te differentiëren voordat ze…
The authors have nothing to disclose.
We zijn dankbaar dat de heer Roger Ackroyd, de heer Andrew Wyman en de heer Chris Stoddard, Consultant Chirurgen op Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, voor hun hulp bij het verwerven van slokdarmkanker weefselmonsters en hun steun aan ons werk. Wij danken Ashraful Haque voor zijn hulp opnemen tumorcellijnen in het model. Wij erkennen dankbaar financiële steun voor deze studie door subsidies van de Bardhan Research en Education Trust (BRET) en Yorkshire Cancer Research (YCR).
Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use |
DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37°C water bath before use |
Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37°C water bath before use |
Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use |
Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise |
Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 433209 | Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use |
O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37°C water bath before use |
EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37°C water bath before use |
T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
Petri dish | SLS | 150350 | |
6 well plate | VWR | 734-2323 | |
stainless steel rings | Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
steel mesh grids | Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1 Use at 1:100 |
CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10 Use at 1:200 |
CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002 Use at 1:200 |
Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5 Use at 1:100 |
OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |