Diese Handschrift beschreibt die Herstellung, Charakterisierung und Anwendungsmöglichkeiten eines mittels Tissue Engineering 3D-Ösophagus-Konstrukt von normalen primären humanen Ösophagus-Fibroblasten und Plattenepithelzellen in einem de-cellularized Schweine Gerüst ausgesät vorbereitet. Die Ergebnisse zeigen die Bildung eines reifen geschichteten Epithel ähnlich dem normalen menschlichen Speiseröhre.
Die Inzidenz von beiden Adenokarzinom des Ösophagus und seine Vorläufer, Barrett-Metaplasie, steigen schnell in der westlichen Welt. Darüber Adenokarzinom des Ösophagus hat in der Regel eine schlechte Prognose, mit wenig Verbesserung der Überlebensraten in den letzten Jahren. Dies sind schwierigen Bedingungen zu untersuchen, und es wurde ein Mangel an geeigneten Versuchsplattformen Störungen der Schleimhaut der Speiseröhre zu untersuchen.
Ein Modell der menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre in der MacNeil Labor, welches im Gegensatz zu herkömmlichen 2D-Zellkultursystemen, fasst die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen in vivo vorhanden ist und erzeugt ein reifes, geschichteten Epithel ähnlich der der normalen menschlichen entwickelt Ösophagus. Kurz gesagt, verwendet das Modell nicht transformierten normalen primären humanen Ösophagus-Fibroblasten und Epithelzellen innerhalb eines Schweine-abgeleiteten acellular Ösophagus-Gerüst gezüchtet. Immunhistochemische Charakterisierung dieses Modellvon CK4, CK14, Ki67 und Involucrin Färbung zeigt entsprechende Wiederholung der Histologie des normalen menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre.
Dieses Modell bietet eine robuste, biologisch relevanten experimentellen Modell der menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre. Es kann leicht verändert werden, um eine Reihe von Forschungsfragen auch auf die Wirksamkeit von pharmakologischen Mitteln und die Auswirkungen der Einwirkung von Umweltfaktoren wie beispielsweise Alkohol, Toxine, hoher Temperatur oder gastroösophagealen refluxate Komponenten zu untersuchen. Das Modell erleichtert auch mit herkömmlichen 2D-Zellkultur, so dass unter anderem erreichbare erweiterte Kulturperioden, die Studie über die Auswirkungen einer wiederholten Exposition eines reifen Epithel an den Agenten von Interesse für die bis zu 20 Tage. Ferner ist eine Vielzahl von Zelllinien, wie die von Speiseröhrentumoren oder Barrett-Metaplasie abgeleitet können in das Modell eingearbeitet, um Prozesse wie Tumorinvasion und Drogen responsivene untersuchenss in einer biologisch relevanten Umfeld.
Die Schleimhaut der Speiseröhre besteht aus einem geschichteten, Plattenepithel über einer Schicht von Bindegewebe, der Lamina propria, und ist eine der ersten Websites, um aufgenommen belastenden Umweltfaktoren zu begegnen. Die Exposition gegenüber Nahrungsgifte ist in der Entwicklung von Ösophagus-Plattenepithel-Karzinom in Verbindung gebracht, während duodenogastro-Reflux ist ein kritischer Faktor in der Pathogenese von Barrett-Metaplasie, die mit einem erhöhten Risiko der Progression zu einem Adenokarzinom der Speiseröhre verbunden ist. Ösophagus-Karzinome sind die häufigste bösartige Tumor 8. in UK Männchen und Adenokarzinom des Ösophagus ist schnell in der westlichen Welt 1 erhöht. Weiterhin hat es eine geringe Verbesserung der Krankheitsprognose mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von etwa 15%. Folglich gibt es einen Bedarf für experimentelle Plattformen um die Auswirkungen der Exposition gegenüber Umweltbelastungen in diesem ösophagealem Epithel und deren mögliche Beteiligung an der develo untersuchenpment der Metaplasie oder Neoplasien.
Obwohl immortalisierte oder Tumorzelllinien können die Forscher die Reaktion der Epithelzellen auf diese Stressfaktoren in vitro zu studieren, bleiben sie proliferative und scheitern in den reifen Epithelzellen auf den obersten Schichten der Schleimhaut der Speiseröhre gefunden zu unterscheiden. Ferner kann Zellinien, die bereits unterzogen worden sind Tumorigenese nur begrenzte Informationen über die ursprünglichen Antworten von normalen Zellen im Epithel von Umweltfaktoren zu liefern; und dies ist die Phase, wenn das Potential für die therapeutische Intervention kann höchsten sind. Schließlich herkömmlichen Zellkultursystemen nicht den potentiell wichtigen Wechselwirkungen zwischen epithelialen und mesenchymalen Zellen und zwischen diesen Zellen und der umgebenden Matrix, die in Geweben in vivo auftreten, zu erfassen.
Tiermodelle bieten ein realistischeres Mikroumgebung für die Untersuchung der Reaktionen des Ösophagus epithelium und kann die künstliche Induktion von Magen-Reflux-Krankheit 2 zu integrieren. Allerdings kann es schwieriger, um die belastenden Umweltfaktoren in diesen Modellen zu manipulieren und sie können nicht vollständig repräsentativ ist die Reaktion innerhalb des menschlichen Speiseröhre.
Andere experimentelle menschlichen Ösophagus Modelle entwickelt worden, die Primärzellen, immortalisierte Zellen oder Tumorzelllinien auf einem Kollagen zu verwenden, oder in Kombination Collagen / Matrigel, Gerüst Fibroblasten enthaltende 3,4. Es ist weniger arbeitsaufwendig, diese Gerüste als die in diesem Manuskript beschrieben azellulären Speiseröhren Gerüst zu erzeugen und diese organotypischen Modelle ein nützliches Mittel, insbesondere bei der Untersuchung von Tumorinvasion 5,6, bei Tumorzellinfiltration in das Kollagengel kann leicht sein, beobachtet. Aber diese Kollagen-Gele besitzen nicht-native mechanischen Eigenschaften und fehlen bestimmte Eigenschaften des ursprünglichen Gewebes, einschließlich einer spezifischen Basalmembran und der appropriate Oberflächentopographie. Dies kann das Verhalten der Zellen, was zu beeinflussen, beispielsweise, eine schlechtere Haftung zwischen dem Epithel und Gerüst bei Verwendung eines Kollagengels Gerüst 7. Als Folge der azellulären Schweinespeiseröhren Gerüst entwickelt, mit dem Vorteil, dass eine biologisch-realistische Gerüst und zur Verwendung als experimentelle Plattform somit besser geeignet. Es wurde auch gezeigt, dass es besser ist, Primärzellen in die Speiseröhre Konstrukte als immortalisierte Speiseröhre epithelialen Zellinien, wie Het-1A integrieren, da diese Zellen bilden einen mehrschichtigen Epithels aber nicht zu schichten oder zu differenzieren 4,7,8 .
Daher hat dieses Protokoll von einer Methode bereits in der MacNeil Labor zur Herstellung von Tissue Engineering Haut und Mundschleimhaut 9,10 angepasst worden und verfügt über eine de-cellularized Schweine Ösophagus-Gerüst verbunden mit primären humanen Ösophagus-Epithelzellen und Fibroblasten. This Protokoll erzeugt eine ausgereifte, geschichteten Epithel, ähnlich zu derjenigen des normalen menschlichen Speiseröhre durch CK4, CK14, Ki67 und Involucrin Färbung nachgewiesen. Das resultierende Modell stellt eine experimentelle Plattform um Reaktionen auf Umweltstressfaktoren zu untersuchen, und wurde effektiv in Reaktion auf die Veränderung der Genexpression in Ösophagusepithel untersuchen, um Bauteile 11 refluxate.
Diese Handschrift beschreibt die Herstellung und Charakterisierung einer biologisch relevanten menschlichen Ösophagus-Schleimhaut-Modell geeignet für den Einsatz als experimentelle Plattform, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber belastenden Umweltfaktoren auf die Ösophagusepithel studieren.
Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Produktion eines menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre Modells sind: Sicherstellung, dass die Mehrheit der Epithelzellen bleibt proliferative…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Herrn Roger Ackroyd, Herr Andrew Wyman und Herrn Chris Stoddard, Berater Chirurgen bei Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, für ihre Hilfe beim Erwerb der Speiseröhre Gewebeproben und ihre Unterstützung unserer Arbeit. Wir danken Ashraful Haque für seine Hilfe Einbeziehung Tumorzelllinien in das Modell. Wir bedanken uns für die finanzielle Unterstützung für diese Studie durch Zuschüsse aus dem Bardhan Research and Education Trust (BRET) und Yorkshire Cancer Research (YCR).
Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use |
DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37°C water bath before use |
Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37°C water bath before use |
Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use |
Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise |
Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 433209 | Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use |
O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37°C water bath before use |
EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37°C water bath before use |
T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
Petri dish | SLS | 150350 | |
6 well plate | VWR | 734-2323 | |
stainless steel rings | Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
steel mesh grids | Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1 Use at 1:100 |
CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10 Use at 1:200 |
CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002 Use at 1:200 |
Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5 Use at 1:100 |
OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |