Summary

缺氧缺糖再给氧作为<em>在体外</em>缺血再灌注损伤模型的研究血脑屏障功能障碍

Published: May 07, 2015
doi:

Summary

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Abstract

缺血 – 再灌注(IR)的损伤是已知显著与缺血性中风的发病率和死亡率。缺血性脑血管意外占80%的中风。 IR损伤的常见原因是流体的以下血液,营养物,氧的急性/慢性闭塞于组织引发的自由基的形成的快速流入。

缺血性中风之后是血 – 脑屏障(BBB)的功能障碍和血管源性脑水肿。在结构上,所述的内皮细胞之间的紧密连接(紧密连接)在保持血 – 脑屏障(BBB)的完整性方面发挥重要作用。 IR损伤是早期继发性损伤导致的非特异性,炎症反应。氧化和代谢应激下炎症引发的继发性脑损害,包括血脑屏障通透性及紧密连接(TJ)的完整性的破坏。

我们的协议提出了一种在体外</ em>的例子对大鼠脑内皮细胞TJ的完整性和应力纤维形成缺氧缺糖复氧(OGD-R)。目前,几个实验的体内模型用于研究IR损伤的影响;然而,它们具有一些局限性,如在执行手术,基因依赖分子影响和困难在研究机械关系的技术挑战。然而, 在体外模型可能有助于克服许多这些限制。所提出的协议可用于研究各种分子机制和机理的关系,以提供潜在的治疗策略。但是, 在体外研究的结果可以不同于标准体内研究和应谨慎解释。

Introduction

缺血-再灌注(IR)的损伤被发现是与中风,心肌梗塞,外伤,周围血管疾病和外伤性脑损伤1,2-相关的各种衰弱的并发症和死亡的常见原因。 IR损伤的脑血管是早期的继发性损伤,导致炎症和水肿3。之一的严重并发症发生的氧化和代谢应激以下炎症的结果是自我平衡,导致自由基的形成,在血脑屏障改变(BBB)的紧密连接(紧密连接)和微血管通透性4,5的损失。

目前用于研究在BBB缺血再灌注损伤的影响体内模型包括大脑中动脉闭塞(缺血),微栓塞,以及转基因或基因敲除动物。然而,每一个都有它的缺点和局限性通过Hossmann 6所讨论的。 MCAO模型被用于研究短跑运动员氧化还原应力的TS,在血脑屏障的交界通信和改变脑和免疫细胞之间的相互作用。然而,它们存在各种技术的挑战,如需要精确显微手术操作和困难在其中。瞬间微栓塞打破了BBB,而利用转基因或基因敲除动物的研究脑缺血可能具有类似基因分子依赖的影响,形成梗塞,改变血管解剖和不同体重6的挑战。因此,缺血的体外模型发现增加近倍,主要由于息其适用性在执行机理研究的药物。但是, 在体外研究的结果可能不完全代表在体内研究,必须谨慎6进行解释。

对血管内皮细胞单层和微血管通透性低氧气浓度的反作用已研究了小川7。大鼠脑微血管内皮细胞(RBMECs)用于开发体外 BBB。氧糖剥夺复氧(OGD-R)技术,该协议提出了改编自苏卢埃塔等人 ,朱等人的研究8,9。我们暴露脑内皮细胞对OGD-R的通过将它们放置在含有0% O 2,5%CO 2和95%N 2和缺氧/缺氧室中。细胞后评估分别采用免疫荧光定位和罗丹明鬼笔标记在TJ的完整性和应力纤维形成的改变。被执行以确定TJ完整性免疫荧光染色为紧密连接-1(ZO-1),如ZO-1是一种重要的脚手架膜结合的TJ蛋白。罗丹明鬼笔环肽标记决定了肌动蛋白丝状(F肌动蛋白)的细胞骨架,是肌动蛋白应力纤维形成的血管内皮细胞的明确指示。

<P类=“jove_content”>该方法的目标是提供洞察显影OGD-R作为体外的IR模型用于研究血脑屏障内皮细胞的TJ完整性和F-肌动蛋白应力纤维形成。研究结果将提供TJ蛋白的命运的消息,ZO-1和应力纤维形成以下OGD-R。了解这些关系将提供一个机会,以确定被触发以下OGD-R潜在的分子机制,并开发潜在的治疗策略,以提高血脑屏障破坏OGD如下-R处理。

Protocol

1.播种内皮细胞从成年SD大鼠获得RBMEC的原代培养(或获得这些商业)。 培育在百厘米纤连蛋白(50微克/毫升)使用大鼠脑内皮细胞生长介质涂覆培养皿RBMECs。改变介质每两天,直到汇合为止。 在达到80-90%汇合,轻轻涡旋洗细胞在5ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。然后将细胞通过暴露至1毫升温的0.25%胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)溶液,平衡至37℃的脱离。 孵育细胞在37?…

Representative Results

细胞纤连蛋白预涂Nunc公司II腔室玻片中培养通过放置在一个Biospherix ProOx模型110室中进行OGD-R上。使细胞对OGD-R的后,将它们控制的细 ​​胞是处理用于使用免疫荧光技术ZO-1交界染色, 如图2和细胞骨架组装表示使用若丹明鬼笔环肽染色标签F-肌动蛋白应力纤维形成, 如图3。未进行OGD-R的显示持续交界的完整性,同时进行OGD-R的内皮细胞表现出不连续的路口,指示TJ完整性<s…

Discussion

OGD-R作为体外模型缺血再灌注损伤已经确立为研究神经元10,11。也有研究显示,OGD对脑血管内皮细胞和变更在渗透性和TJ完整性9的效果。然而,我们的研究显示,OGD的效果以及复氧,它是缺血再灌注损伤的发生的缺血性中风的体内条件下仔细表示。

缺氧缺血性条件是已知的诱发炎症在中枢神经系统中,导致通过增加细胞旁渗透性和血管性水肿

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们承认斯科特和怀特医院研究资助计划提供财政支持和得克萨斯州A&M大学健康科学中心大学的医学影像学综合实验室,利用激光共聚焦显微镜。我们承认格伦克莱尔先生的帮助,稿件编辑。

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Proox model 110 Biospherix Model 110
DMEM, no glucose Gibco, Life technologies 11966-025
Rhodamine Phalloidin Life technologies R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody Life technologies 617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides  Thermo scientific 177402
FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody  Santa cruz sc-2090
DPBS 1X Thermo scientific SH 30028.03 Any other PBS available can be used

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Alluri, H., Anasooya Shaji, C., Davis, M. L., Tharakan, B. Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction. J. Vis. Exp. (99), e52699, doi:10.3791/52699 (2015).

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