Abstract
虚血再灌流（IR）傷害は、虚血性脳卒中に関連する罹患率および死亡率に大きく寄与することが知られています。虚血性脳血管障害は、すべてのストロークの80％を占めています。 IR傷害の一般的な原因は、血液の急性/慢性閉塞次流体、栄養素、フリーラジカルの形成を誘発する組織への酸素の迅速な流入です。
虚血性脳卒中は、血液脳関門（BBB）機能不全および血管原性脳浮腫が続きます。構造的には、内皮細胞間のタイトジャンクション（のTJ）は、血液脳関門（BBB）の完全性を維持する上で重要な役割を果たしています。 IR傷害は、非特異的、炎症反応を引き起こす早期二次損傷です。炎症次酸化および代謝ストレスがBBBの透過性とタイトジャンクション（TJ）の完全性の破壊などの二次的脳損傷を誘発します。
我々のプロトコルは、in vitroでの提示します</ em>のラット脳内皮細胞TJの整合性とストレスファイバー形成の酸素 - グルコース欠乏と再酸素化（OGD-R）の例。現在、in vivoモデルでいくつかの実験は、IR傷害の影響を研究するために使用されます。しかしそれらは、手術、遺伝子依存性分子の影響とメカニズムの関係を研究することの困難を行う際に技術的な問題など、いくつかの制限があります。しかし、in vitroモデルは、これらの制限の多くを克服するのを助けることができます。提示されたプロトコルは、潜在的な治療戦略を提供するために、様々な分子機構と機械的な関係を研究するために使用することができます。しかし、in vitro試験の結果は、in vivo試験で 、標準と異なる場合があり、注意して解釈されるべきです。
Introduction
虚血再灌流（IR）傷害は、脳卒中、心筋梗塞、外傷、末梢血管疾患および外傷性脳損傷1,2に関連する様々な衰弱性の合併症や死亡の頻繁な原因であることが見出されています。脳血管のIR傷害は、炎症および浮腫3につながる初期の二次的損傷です。酸化および炎症次代謝ストレスの結果として生じる重篤な合併症の一つは、恒常的なフリーラジカル形成をもたらすバランス、血液脳関門の変化（BBB）タイトジャンクション（のTJ）と微小血管透過性4,5の損失です。
現在、BBBにおけるIR傷害の影響を研究するために使用される生体内モデルにおいて 、中大脳動脈閉塞（MCAO）、微小塞栓、およびトランスジェニックまたはノックアウト動物を含みます。 Hossmann 6で説明したようにしかし、それぞれがその欠点と制限があります。 MCAOモデルはeffecを研究するために使用されますレドックスストレスのTS、BBBの接合部コミュニケーションの変化と脳と免疫細胞間の相互作用。しかし、彼らはその中に正確な顕微手順や困難の必要性など、様々な技術的な課題を提示します。脳虚血を研究するためのトランスジェニックまたはノックアウト動物の使用は、梗塞形成上の遺伝子に依存する分子の影響、血管構造の変化と変化させ、体重6のような課題を持っているかもしれないが微小塞栓は、瞬時にBBBを分解します。したがって、虚血のin vitroモデルは、薬物のための機構研究を行う際にその適用に起因する主に最近の関心を増大させる発見しました。しかし、in vitro試験の結果が完全にin vivo試験を表していない場合があり、注意6と解釈されなければなりません。
内皮細胞単層および微小血管透過性の低酸素濃度の反作用効果がありました小川7によって研究。ラット脳微小血管内皮細胞（RBMECs）はインビトロ BBBを開発するために使用されました。このプロトコルで提示酸素-グルコース欠乏と再酸素化（OGD-R）技術はスルエタらと朱ら 8,9によって研究から適応されています。我々は、0％O 2、5％CO 2及び95％N 2を含む、低酸素/無酸素チャンバー中に置くことにより、OGD-Rの脳内皮細胞を曝露しました。細胞は、後にそれぞれの免疫蛍光局在化およびローダミンファロイジンラベルを使用して、TJの整合性とストレスファイバー形成の変化について評価しました。閉鎖帯-1（ZO-1）についての免疫蛍光染色は、ZO-1と、TJの完全性を決定するために実行されることTJタンパク質に結合した重要な足場膜です。ローダミンファロイジン標識が細胞骨格に繊維状アクチン（Fアクチン ）を決定し、内皮細胞におけるアクチンストレスファイバー形成の明確な指標です。
<Pクラス= "jove_contentは">この方法の目的は、BBB内皮細胞TJの整合性とF-アクチンストレスファイバー形成を研究するためのin vitroでの IRモデルとしてOGD-Rの開発に洞察力を提供することにあります。結果は、TJタンパク質の運命についての情報を提供し、ZO-1およびOGD-R次のストレスファイバー形成します。これらの関係を理解することはOGD-R以下のトリガされる根底にある分子メカニズムを決定し、OGD-R処理後のBBB破壊を増強する潜在的な治療戦略を開発する機会を提供します。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
内皮細胞の1播種
- 大人のSDラットからRBMEC年代の初代培養物を得る（または商業的にそれらを得ます）。
- 100センチメートルフィブロネクチン（50μg/ mlの）ラット脳内皮細胞増殖培地を用いて被覆されたペトリ皿でRBMECs育成。密集度に到達するまで、2日ごとに培地を変更します。
- 80〜90％コンフルエントに達すると、穏やかに旋回を5 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。次いで、細胞を37℃に平衡化した温かい0.25％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液1ml、それらを暴露することによって分離されます。
- 細胞が剥離して分散されるまで2〜5分間、37℃で細胞をインキュベートします。
注：細胞を剥離するために培養皿をタップします。顕微鏡下で見る細胞が皿の表面から細胞を完全に剥離を確認しました。 - トリプシンを中和するためにペトリ皿に5ミリリットル完全培地を追加します。剥離した細胞を含む培地をピペット15mLの遠心分離管にそれを収集します。 。
- 遠心分離媒体を5分間220×gでの内皮細胞を含みます。
- 上清を吸引した後、自動細胞カウンターまたは血球計数器を用いてカウントされるピペット細胞で軽くそれを混合することにより、およびダウン3〜5ミリリットルの新鮮なラット脳内皮細胞増殖培地中にcells.Suspendにペレットを含むペレットを保存します。
- ウェルあたり10,000〜15,000細胞の間の範囲の播種密度で8ウェル滅菌チャンバースライドシステム0.7 cm 2で/ウェルをプレコートフィブロネクチンへの細胞懸濁液（50μg/ ml）を転送します。コンフルエンスが達成されるまで37℃で細胞を増殖させます
注：実験によって要求されるようにウェスタンブロットまたは他の実験を行うために、細胞を10cmの細胞培養皿または特殊皿で増殖させることができます。
2.酸素およびインビトロでのグルコース欠乏、再酸素化モデル
注：以下のプロトコルをスルエタらから適応されています。 1997;朱H ら。2012 8,9。
- （ 図1参照）でRBMECsのOGD-Rの効果を研究するために、低酸素細胞培養システムを使用してください。セットアップし、製造業者の指示に従って、実験を開始する前に、低酸素細胞培養系を較正します。
- 37℃のインキュベーターからコンフルエントチャンバースライド（ステップ1.8）を取り外します。 OGD状態を表すために、37℃で2時間、脱酸素とチャンバースライドで完全培地、無グルコース、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および95％の低酸素チャンバーに入れ、N 2及び5％CO 2を交換します。
- 37℃で95％O 2、5％CO 2インキュベーターで逆に細胞を移動させ、新鮮なラット脳内皮細胞の完全な媒体を備え、37℃でさらに1時間インキュベートします。
注：このステップは、再酸素化の状況を表しています。 - 免疫蛍光局在化およびローダミンファロイジン標識のためチャンバースライドを使用します（セクション3を参照）。
3.免疫ZO-1の局在とローダミンファロイジンを使用したFアクチンラベリング
- OPTI-MEM /低血清培地/ウェルの1時間の100μlにRBMEC単層を含むチャンバースライドを公開します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pHが7.0〜7.2）100μlのチャンバースライドを3回洗浄します。
- 15分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（pHは7.0〜7.2）の100μLを使用して細胞を固定し、PBSで3回（pHは7.0〜7.2）のためのチャンバースライドを洗浄します。
- さらに15分間、PBS中0.5％トリトンX-100100μlの、（pHが7.0〜7.2）を用いて細胞を透過性。時間、PBS中の2％ウシ血清アルブミン（BSA）100μlでブロックします。 ZO-1またはF-アクチンのためのこのステップのいずれかで染色/ラベル細胞のいずれかの後に。
- 免疫STA用ining 1にZO-1に対する抗ウサギ一次抗体で細胞をインキュベートする：150、Oのために/ N 4℃にて2％BSA-PBS中で調製しました。細胞をPBS中で3回、（pHは7.0〜7.2）を洗浄します。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）100μlでインキュベートし、室温で1時間、抗ウサギ二次抗体をタグ付き。
- ローダミンファロイジン標識のために、ブロッキングに続いて、20分間、2％BSA-PBS中で調製し、1：50希釈でローダミンファロイジンの100μlに細胞を公開します。
- （pHは7.0〜7.2）、PBS中の免疫蛍光染色およびローダミンファロイジン標識から細胞を洗浄します。 DAPIと退色防止試薬を含むマウント培地を用いてチャンバをマウントします。
- 60 Xの水浸レンズを用いて細胞を視覚化し、細胞を共焦点顕微鏡下で単一の光学面に走査されます。
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Representative Results
フィブロネクチンプレコートヌンクIIチャンバースライド上で培養した細胞はBiospherix ProOxモデル110チャンバー内に配置することにより、OGD-Rに供しました。ローダミンファロイジン染色ラベルを使用して、Fアクチンストレスファイバーの形成を示す図2及び細胞骨格の組み立てに示すように、図3に示すように、OGD-Rの細胞を施した後、それらは、免疫蛍光技術を使用してZO-1接合部染色のために処理した。あった対照細胞をOGD-Rに供内皮細胞がTJインテグリティ図2の消失を示し、不連続な接合を示したOGD-Rを受けないで継続的な接合部の完全性を示さなかった。OGD-R処理を行わなかった対照細胞は、全くまたは最小限のFアクチンストレスファイバーを示しました。形成OGD-Rにかけた内皮細胞は、アクチン細胞骨格の組み立て図3の変化を示す増加Fアクチンストレスファイバー形成を実証している間、代表リファレンス＃13からの許可を得てRINT
低酸素システムProOxモデル110の図1.標準的な構成 。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図タイトジャンクションタンパク質（TJP）RBMECsでOGD-Rを以下のタイトジャンクションのZO-1実証破壊の2免疫蛍光局在化、白矢印で示すように、スケールバー=10μmである。 これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。
白矢印で示すようRBMECsでOGD-Rに続いて細胞骨格アセンブリの変化を実証するFアクチンストレスファイバー形成、図3.ローダミンファロイジンラベリング。スケールバー=10μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
虚血再灌流障害のためのin vitroモデルとしてOGD-Rはよくニューロン10,11を研究するために設立されました。透過性及びTJの整合9における脳内皮細胞および変更のOGDの影響を示す研究もあります。しかし、我々の研究は、虚血性脳卒中後の発生のインビボ条件における虚血再灌流障害の近い表現である、OGDの影響だけでなく、再酸素化を示しています。
低酸素性虚血性の条件は、傍細胞透過性および血管原性浮腫4を増加させることによって、破壊をBBBに至る、中枢神経系の炎症を誘発することが知られています。再灌流障害は、過剰な活性酸素種の生成がである、非常に複雑で動的なプロセスであるATP枯渇、細胞外カリウム、興奮性神経伝達物質の放出、内皮細胞および神経細胞の腫脹、免疫細胞活性化の上昇します。このターンCでBBBの完全性5,12の破壊につながる、さまざまなカスパーゼを活性化することが示されているすべてのそれらのausesの種々の炎症性経路の活性化、サイトカイン産生につながる、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼの誘導、浮腫をもたらします。内皮細胞は、ミトコンドリアの多数の存在に起因する虚血性損傷を特に受けやすいです。隣接する内皮細胞は、タイトジャンクションタンパク質によって維持さ密着結合によって互いに連結されています。
ZO-1は、他のタイトジャンクションタンパク質との相互作用によってTJの完全性を維持する上で重要な役割を果たすことが示されて アクチン細胞骨格アセンブリ。また、アクチン細胞骨格の正確な調節は、細胞 - 細胞接着を含む多くの発達および生理学的プロセスに必須です。内皮細胞において、アクチンストレスファイバーの形成は、バリア機能障害および透過性亢進13,14と関連することが見出されています。ローダミンphalloiF-アクチンストレスファイバーの形成を観察するために、本研究で用いた標識法はDINは、エンドポイント試験です。ドゲットとブレスリン15で示すようにしかし、ストレスファイバー形成の動的ライブイメージングを行うこともできます。
現在の研究はすぎなかっBBBタイトジャンクションの完全性に向かってZO-1の貢献を強調しています。ただし、クローディン5、オクルディン、接合部接着分子（JAM）のような他のタイトジャンクション分子などが、またOGD-R以下BBBタイトジャンクションの完全性を研究するためのマーカーとして使用することができます。本研究では、タイトジャンクションの完全性を決定するための定性的な手法として免疫蛍光局在化およびF-アクチンの標識を使用しました。しかし、我々はまた、蛍光マーカーおよび経内皮電気抵抗（TEER）を使用して、透過性の定量的測定のようなBBBの他の重要な特性を学ぶことができます。
OGD-R技術は、使用して、この研究で提示しましたBiospherixシステムは、酸素のみの固定濃度で、低酸素/無酸素の研究のために使用することができます。しかし、我々は、内皮細胞上での酸素濃度の変化の影響を研究するため、このシステムを使用することができません。内皮細胞上の酸素の濃度を変化させ効果を研究するために私達は目的に適した他の利用可能なモデルを採用する必要があります。
この技術は、BBBの透過性亢進及びTJの整合性を調節する種々の細胞および分子事象の間の機械的な関係を研究するために使用することができます。それらを理解することは、BBB破壊および微小血管透過性を減衰させるために様々な分子戦略を開発するための洞察を提供します。
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Acknowledgments
我々は、共焦点レーザー顕微鏡を使用するための財政支援と医療の統合イメージング研究所のテキサスA＆M健康科学センター大学のためにスコットと白病院研究費補助金プログラムを認めます。私たちは、原稿編集のヘルプ氏グレンクライヤーを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
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