Abstract
İskemi-Reperfüzyon (IR) hasarı, iskemik inmelerin ile ilişkili morbidite ve mortalite önemli ölçüde katkıda bilinmektedir. İskemik serebrovasküler kazalar tüm inmelerin% 80'ini oluşturmaktadır. IR yaralanma yaygın bir nedeni serbest radikallerin oluşumunu tetikleyen dokuya kan, besin, oksijen akut / kronik tıkanıklığı sonrası sıvıların hızlı girişi olduğunu.
İskemik inme, kan-beyin bariyerinin (KBB) disfonksiyonu ve vazojenik beyin ödemi takip eder. Yapısal olarak, endotel hücreleri arasında sıkı bağlantıları (TJs), kan-beyin bariyeri (BBB) bütünlüğünü muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. IR hasarı spesifik olmayan, inflamatuar yanıt giden bir erken ikincil yaralanma. Inflamasyon aşağıdaki Oksidatif ve metabolik stres BBB geçirgenliği ve sıkı kavşak (TJ) bütünlüğünün bozulması da dahil olmak üzere ikincil beyin hasarı tetikler.
Bizim protokol bir in vitro sunar </ Em> sıçan beyin endotel hücre TJ bütünlüğü ve stres lif oluşumu üzerine oksijen glikoz mahrumiyet ve reoksijenizasyonun (OGD-R) örneği. Şu anda, in vivo modellerde çeşitli deneysel IR yaralanma etkilerini incelemek için kullanılır; ancak onlar böyle mekanik ilişkileri okuyan ameliyatlar, gen bağımlı moleküler etkileri ve zorluk performans teknik zorluklar gibi çeşitli sınırlamalar var. Bununla birlikte, in vitro modeller bu sınırlamaları birçok üstesinden yardımcı olabilir. sunulan protokol potansiyel terapötik stratejiler sağlamak için çeşitli moleküler mekanizmaları ve mekanik ilişkileri incelemek için kullanılabilir. Ancak, in vitro çalışmaların sonuçları in vivo çalışmalar, standart farklı olabilir ve dikkatle yorumlanmalıdır.
Introduction
İskemi-Reperfüzyon (IR) hasarı, inme, miyokard enfarktüsü, travma, periferik damar hastalığı ve travmatik beyin hasarı 1,2 ile ilişkili çeşitli zayıflatıcı komplikasyon ve ölüm sık nedeni olarak bulunmuştur. Serebral damarlarda IR yaralanma inflamasyon ve ödem 3 giden bir erken ikincil yaralanma. Oksidatif ve enflamasyon, aşağıdaki metabolik stres sonucu ortaya çıkan ciddi komplikasyonların bir homeostatik serbest radikal oluşumuna yol açan bir denge, kan-beyin bariyerinin değişiklikler (BBB) sıkı bağlantıları (TJs) ve mikrovasküler geçirgenliğin 4,5 kaybıdır.
Şu anda, BBB üzerindeki IR yaralanma etkilerini incelemek için kullanılan in vivo modellerde orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO), mikroembolizm ve transgenik veya nakavt hayvanları kapsar. Hossmann 6 tartıştığı Ancak, her biri kendi dezavantajları ve sınırlamaları vardır. MCAO modeli effec incelemek için kullanılırRedoks stres ts, BBB kavşak iletişimde değişiklikler ve beyin ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimler. Ancak, bu tür içinde hassas mikrocerrahi prosedürleri ve zorluklar için ihtiyaç olarak çeşitli teknik sorunlar mevcut. Serebral iskemi incelemek için transgenik ya da nakavt hayvanların kullanımı enfarktüs oluşumu gen bağımlı moleküler etkileri, vasküler anatomi değişiklikler ve değişen vücut ağırlıkları 6 gibi zorlukları olabilir iken mikroembolisinden anında BBB yıkar. Bu nedenle, iskemi in vitro modeller ilaçlar için mekanistik çalışmalar yapmak nedeniyle uygulanabilirlikleri esas olarak son zamanlarda ilgi artmaktadır bulduk. Ancak, in vitro çalışmaların sonuçları tam bir in vivo çalışma temsil etmeyebilir ve dikkatli 6 yorumlanması gerekir.
Endotelyal hücre tek tabakalarında ve mikrovasküler geçirgenliğin düşük oksijen konsantrasyonları gibi karşı etkisi olmuşturOgawa 7 tarafından incelenmiştir. Fare beyni mikrovasküler endotelyal hücreleri (RBMECs), in vitro BBB geliştirmek için kullanılmıştır. Bu protokol sunulan oksijen glikoz mahrumiyet ve reoksijenizasyonun (OGD-R) tekniği Zulueta ark ve Zhu ve ark 8,9 ile çalışmalarda adapte edilmiştir. Biz% 0 O 2,% 5 CO2 ve% 95 N 2 içeren bir hipoksi / anoksi odasına yerleştirerek OGD-R beyin endotel hücrelerini gözler önüne serdi. Hücreler daha sonra sırasıyla immunofloresan lokalizasyonu ve rodamin Phalloidin etiketleme kullanarak TJ bütünlüğü ve stres lif oluşumu değişiklikler açısından değerlendirildi. Zonula okludinler-1 (ZO-1) için immünofloresan boyama ZO-1 gibi, TJ bütünlüğünü saptamak için gerçekleştirilir TJ proteine bağlı önemli bir iskele membrandır. Rodamin Phalloidin etiketleme hücre iskeletinin içinde ipliksi aktin (f-aktin) belirler ve endotel hücreleri aktin stres lif oluşumu açık bir göstergesidir.
<p class = "jove_content"> Bu yöntemin amacı, BBB endotel hücre TJ bütünlüğü ve F-aktin stres lif oluşumu çalışmak için in vitro bir model olarak İR OGD-R geliştirilmesi hakkında fikir temin edilmesidir. Sonuçlar TJ protein kaderi hakkında bilgi vermek, ZO-1 ve OGD-R aşağıdaki stres lif oluşumu olacaktır. Bu ilişkileri anlamak OGD-R aşağıdaki tetiklemeli olan altta yatan moleküler mekanizmaları belirlemek ve OGD-R tedavisi sonrasında BBB kesintileri artırmak için potansiyel terapötik stratejiler geliştirmek için bir fırsat sağlayacaktır.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Endotel Hücreleri 1. Tohum
- Yetişkin Sprague Dawley sıçanların RBMEC en birincil kültürleri elde etmek (ya da ticari bunları elde).
- 100 cm-fibronektin (50 ug / ml), sıçan beyin endotelyal hücre büyüme ortamı kullanılarak kaplanmış petri kaplarına RBMECs geliştirin. Birleşme sağlandığı ulaşılana kadar her iki günde bir ortam değiştirme.
- % 80-90 konfluense ulaştıktan sonra, hafifçe döndürülerek, 5 ml fosfat tamponlu salin (PBS) hücreleri yıkamak. Hücreler daha sonra 37 ° C'ye dengelenmiş sıcak% 0.25 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi, 1 ml, maruz bırakılmasıyla ayrılır.
- Hücreler ayrılmış ve dağılana kadar 2-5 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe hücreleri.
NOT: hücreleri ayırmak için kültür çanak dokunun. Mikroskop altında görüntüle hücreleri tabak yüzeyinden hücrelerin tamamen ayrılmasını teyit etmek için. - Tripsin etkisiz hale getirmek için bir petri 5 ml komple ortam ekleyin.Müstakil hücreleri ihtiva eden ortam üzerinden pipet ve bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne toplayın. .
- 5 dakika boyunca 220 xg'de endotel hücreleri ihtiva eden ortam santrifüjleyin.
- Süpernatantı aspire ve sonra otomatik hücre sayacı veya hemasitometre kullanarak sayılır edilecek pipet Hücreleri yavaşça yukarı karıştırılarak ve aşağı 3-5 ml taze sıçan beyin endotel hücre büyüme ortamına cells.Suspend pelet içeren pelet korumak.
- Oyuk başına 10,000-15,000 hücreler arasında değişen bir çekirdek yoğunluğuna sahip / oyuk, 8 iyi steril oda slayt sistemi önceden kaplanmış fibronektin (50 ug / mi) içine 0.7 cm 2 hücre süspansiyonu aktarın. Kaynaşma elde edilene kadar 37 ° C'de hücreler büyümek
Not: Deney için gerekli olan western blot veya başka deneyler için hücreler 10 cm hücre kültür tabaklarında veya özel yemekler yetiştirilebilir.
2. Oksijen ve In Vitro Glukoz Yoksunluk-reoksijenizasyonModel
Not: Aşağıdaki protokol Zulueta ve ark adapte edilmiştir. 1997; Zhu, H ve ark., 2012 8,9.
- Içinde RBMECs üzerinde OGD-R etkilerini (Şekil 1) incelemek için hipoksi hücre kültür sistemi kullanın. Kurulum ve üreticinin talimatlarına göre, deney başlamadan önce hipoksi hücre kültür sistemi kalibre.
- 37 ° C inkübatör konfluent odası slaytlar (adım 1.8) sökün. Deoksijene ile oda slayt tam orta yerine, glükoz, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), 37 ° C 'de 2 saat süre ile% 95, N2 ve% 5 CO2 ile hipoksi odasına yerleştirilir, OGD durumu temsil ettiği.
- 37 ° C'de% 95 O2,% 5 CO2 ile tekrar inkübatör hücreleri taşı ve taze sıçan beyin endotel hücre komple ortam ile sağlanır ve 37 ° C de bir 1 saat boyunca inkübe edilir.
NOT: Bu adım, bir reoksijenizasyon durumu temsil eder. - Immunofloresan lokalizasyonu ve rodamin Phalloidin etiketleme odası slaytlar kullanın (Bölüm 3).
Rodamin phalloidin kullanma ZO-1 ve f-aktin Etiketleme 3. İmmünofloresan Yerelleştirme
- Iyi 1 saat opti-MEM / azaltılmış serum medya / 100 ul RBMEC mono tabakaları içeren odası slaytlar Açığa. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, pH 7.0-7.2), 100 ul oda slaytlar 3 kez yıkayın.
- (PH 7.0-7.2), 15 dakika boyunca PBS (pH 7.0-7.2)% 4 paraformaldehit 100 ul kullanarak hücreleri saptamak ve PBS içinde 3 kez daha özel oda slaytlar yıkayın.
- Başka bir 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 Triton X-100, 100 ul, (pH 7.0-7.2) kullanılarak hücrelerin geçirgenliği. Bir saat süreyle PBS içinde% 2 sığır serum albümini (BSA) 100 ul ile bloke edin. ZO-1 ya da f-aktin için bu adımda ya da leke / etiket hücrelerden sonra.
- Immunofloresan sta için150, 4 ° C 'de N / O% 2 BSA-PBS içinde hazırlandı: ining 1 ZO-1'e karşı anti-tavşan primer antikor ile hücrelerin inkübe edin. PBS'de hücreleri (pH 7.0-7.2) 3 kez yıkayın. Flüoresein izotiyosiyanatla (FITC), 100 ul ile inkübe oda sıcaklığında 1 saat için bir anti-tavşan ikincil antikoru etiketli.
- Rodamin Phalloidin etiketleme için, bloke sonra, 20 dakika boyunca,% 2 BSA-PBS içinde hazırlanan, 1:50 dilüsyonda rodamin Phalloidin 100 ul hücreleri maruz kalmaktadır.
- Immunofloresan boyama ve PBS rhodamine Phalloidin etiketleme, (pH 7.0-7.2) hücreleri yıkayın. DAPI anti-solmaya reaktif içeren montaj medyayı kullanarak odaları monte edin.
- 60 X suya daldırma lens kullanarak hücrelerin görselleştirmek ve hücreler konfokal mikroskop altında tek bir optik düzlemde taranır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fibronektin önceden kaplanmış Nunc II haznesi slaytlar üzerinde kültürlenmiş hücreler, bir Biospherix ProOx modeli 110 odası içinde yerleştirilmesi ile OGD-R tabi tutuldu. Rodamin falloidin leke etiketi kullanılarak F-aktin stres lif oluşumu gösteren, Şekil 2 ve sitoskeletal montaj gösterildiği gibi, Şekil 3 'de gösterildiği gibi OGD-R hücreleri tabi tutulduktan sonra, bunlar immünofloresan tekniği kullanılarak ZO-1 kavşak boyama için işlemden geçirilirler. Kontrol hücreleri OGD-R tabi endotel hücreleri TJ bütünlüğü Şekil 2'nin kaybı gösteren, süreksiz kavşaklar gösterdi OGD-R tabi sürekli bileşke bütünlüğü göstermiştir. OGD-R işleme tabi olmayan kontrol hücreleri ya hiç ya da çok az f-aktin stres lif gösterdi oluşumu OGD-R tabi endotel hücreleri aktin hücre iskeleti montaj Şekil 3'te değişiklikleri gösteren artmış f-aktin stres lif oluşumunu gösterdi ise; Temsilci Referans # 13 izniyle rint
Hipoksi Sistemi ProOx Model 110 1. Tipik yapılandırması Şekil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Beyaz oklarla gösterildiği gibi sıkı Kavşağı Protein Şekil 2. İmmünofloresan Yerelleştirme (TJP) ZO-1, RBMECs içinde OGD-R aşağıdaki Sıkı Eklemlerinin Disruption gösterilmesi. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız rakam.
Beyaz oklarla gösterildiği gibi RBMECs içinde OGD-R ardından Sitoskeletal Meclisi'nde Değişiklikleri Gösteren f-aktin Stres Fiber Formasyonu için Şekil 3. Rodamin Phalloidin Etiketleme. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Işemi-reperfüzyon yaralanması için bir in vitro model olarak OGD-R de nöronlar 10,11 çalışmak için kurulmuştur. Geçirgenlik ve TJ bütünlük 9 beyin endotel hücreleri ve değişiklikler üzerinde OGD'ye etkisini gösteren çalışmalar da vardır. Ancak, bizim çalışmamız aşağıdaki iskemik inme meydana in vivo koşullarda iskemik reperfüzyon hasarı daha yakından temsilidir OGD'ye etkisi yanı sıra yeniden oksijenasyonunu gösterir.
Hipoksik iskemik durumlar paraselüler geçirgenliği ve ödem vazojenik 4 arttırarak bozulması BBB yol, merkezi sinir sisteminde enflamasyonun neden olduğu bilinmektedir. Reperfüzyon hasarı, hücre dışı potasyum, uyarıcı nörotransmitterlerin, endotelyal ve nöronal şişlik, bağışıklık hücre aktivasyonu serbest yükselmesi, aşırı reaktif oksijen türlerinin üretimi, ATP tükenmesi var olduğu bir çok karmaşık ve dinamik bir süreçtir. Bu, içinde dönüş c, üretim, nükleaz ve proteazlar uyarılmasını sitokin yol açan çeşitli kaspazları aktive etmek için gösterilmiştir, bütün bunlar ödem, giden BBB bütünlüğü 5,12 bozulmasına yol açan çeşitli enflamatuvar yolaklarının aktivasyonunu auses. Endotel hücreleri nedeniyle mitokondri çok sayıda varlığı, iskemik hasarı özellikle yatkındır. Komşu endotel hücreleri sıkı kavşak proteinler tarafından tutulan sıkı kavşaklar ile birbirlerine bağlanmıştır.
ZO-1, diğer sıkı kavşak proteinler ile etkileşimi ile TJ bütünlüğünün korunmasında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir ve aktin hücre iskeleti düzeneği. Ayrıca, aktin hücre iskeletinin doğru düzenlenmesi, hücre-hücre adezyonlar da dahil olmak üzere pek çok gelişimsel ve fizyolojik süreçler için gereklidir. Endotel hücrelerinde, aktin stres lif oluşumu engelleyici işlev bozukluğu ve aşırı geçirgenlik 13,14 ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Rodamin phalloif-aktin stres lif oluşumunu gözlemlemek için bu çalışmada kullanılan etiketleme tekniği din bir uç nokta çalışmasıdır. Doggett'ın ve Breslin 15 ile gösterildiği gibi Ancak, stres lif oluşumu, dinamik ve canlı görüntüleme de gerçekleştirilebilir.
Bu çalışma majorly BBB sıkı kavşak bütünlüğü yolunda ZO-1 katkısını vurguluyor. Bununla birlikte, Claudin-5, occludin, kavşak yapışma molekülleri (JAM) gibi diğer gergin junksiyon molekülleri vb de OGD-R, aşağıdaki BBB sıkı bir bağlantı bütünlüğünü incelemek için markerler olarak kullanılabilir. Bu çalışmada, biz sıkı kavşak bütünlüğünü belirlemek için nitel bir teknik olarak immünofloresan lokalizasyonu ve f-aktin etiketleme kullandı. Ancak, biz de floresan işaretleri ve transendotelyal elektriksel direnç (TEER) kullanarak geçirgenlik kantitatif ölçümü gibi BBB diğer önemli özelliklerini inceleyebiliriz.
OGD-R tekniği kullanarak bu çalışmada sunulanBiospherix sistemi sadece oksijen sabit bir konsantrasyonda hipoksi / anoksi çalışmaları için de kullanılabilir; Ancak, endotel hücreleri üzerinde oksijen çeşitli konsantrasyonlarda etkisini incelemek için bu sistemi kullanan olamaz. Endotel hücreleri üzerinde oksijen değişen konsantrasyonlarının etkisini incelemek için biz amaç için uygun diğer uygun modeller kullanılması gerekir.
Bu teknik, BBB hiperpermeabiliteyi ve TJ bütünlüğü düzenleyen çeşitli hücresel ve moleküler olaylarla arasındaki mekanik ilişkiyi çalışmak için de kullanılabilir. Onları anlamak BBB kesintileri ve mikrovasküler geçirgenliği azaltmak için çeşitli moleküler stratejiler geliştirilmesi için fikir verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz mali destek için Scott Beyaz Hastanesi Araştırma Hibeler Programı kabul ve Texas A & konfokal lazer mikroskobu kullanımı için Tıp Entegre Görüntüleme Laboratuvarı M Sağlık Bilim Merkezi Koleji. Biz el yazması düzenleme ile yardım için Sayın Glen Cryer kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A.
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
