Oxygen-Glukose deprivasjon og reoksygenering som en<em> In Vitro</em> Iskemi-reperfusjonskade modell for å studere blod-hjernebarrieren Dysfunction
Summary
Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Abstract
Iskemi-Reperfusjon (IR) skade er kjent for å bidra betydelig til sykelighet og dødelighet assosiert med iskemisk slag. Iskemiske cerebrovaskulære hendelser står for 80% av alle slag. En vanlig årsak til IR skade er den hurtige innstrømningen av fluider etter en akutt / kronisk okklusjon av blod, næringsstoffer, oksygen til vevet utløser dannelsen av frie radikaler.
Hjerneinfarkt følges av blod-hjerne-barrieren (BBB) dysfunksjon og vasogenic hjerneødem. Strukturelt tett veikryss (TJS) mellom endotelcellene spiller en viktig rolle i å opprettholde integriteten av blod-hjerne-barrieren (BBB). IR skade er en tidlig sekundær skade som fører til en ikke-spesifikk, inflammatorisk respons. Oksidativt og metabolsk stress følgende betennelse utløser sekundær hjerneskade inkludert BBB permeabilitet og forstyrrelse av tett kobling (TJ) integritet.
Vår protokoll presenterer en in vitro </ Em> eksempel på oksygen-glukose deprivasjon og reoksygenering (OGD-R) på rottehjerne endotelceller TJ integritet og stress fiberdannelse. Foreløpig er flere eksperimentelle in vivo modeller brukes til å studere effekter av IR skade; men de har flere begrensninger, for eksempel de tekniske utfordringene med å utføre operasjoner, Gene avhengige molekylære påvirkninger og vanskeligheter med å studere mekanistiske relasjoner. Imidlertid kan in vitro-modeller hjelpe til med å overvinne mange av de begrensninger. Den presenterte protokollen kan brukes til å studere de forskjellige molekylære mekanismer og mekanistiske forhold for å gi potensielle terapeutiske strategier. Imidlertid kan resultatene av in vitro studier skiller seg fra standard in vivo studier og bør tolkes med forsiktighet.
Introduction
Iskemi reperfusjon (IR) skade er funnet å være den hyppigste årsaken til forskjellige ødeleggende komplikasjoner og dødsfall i forbindelse med slag, myokardialt infarkt, traume, perifer vaskulær sykdom og traumatisk hjerneskade 1,2. IR skade i cerebrale kar er en tidlig sekundærskader som fører til inflammasjon og ødem 3. En av de alvorlige komplikasjoner som oppstår som et resultat av oksidativ og metabolsk stress følgende inflammasjon er tap av homeostatisk balanse som fører til dannelse av frie radikaler, endringer i blod-hjerne-barrieren (BBB) tett veikryss (TJS) og mikrovaskulær permeabilitet 4,5.
Foreløpig in vivo modeller som brukes for å studere effekten av IR skade på BBB inkluderer midten cerebral arterie okklusjon (MCAO), microembolism og transgene eller knockout dyr. Imidlertid har hver sine ulemper og begrensninger som diskutert av Hossmann 6. MCAO modellen brukes til å studere effekts av Redox stresset, endringer i synaptiske kommunikasjon av BBB og samspillet mellom hjernen og immunceller. Men presentere de ulike tekniske utfordringer som behovet for presise mikrokirurgisk prosedyrer og vanskelighetene disse. Microembolism bryter umiddelbart ned BBB, mens bruken av transgene eller knockout dyr å studere cerebral iskemi kan ha utfordringer som gen-avhengige molekylære påvirkninger på infarktdannelse, endringer i vaskulær anatomi og ulike kroppsvekter 6. Derfor har in vitro modeller av iskemi funnet økende interesse i nyere tid hovedsakelig på grunn av deres anvendbarhet i å utføre mekanistiske studier for narkotika. Imidlertid kan resultatene av in vitro studier ikke fullt ut representerer en in vivo studier og må tolkes med forsiktighet 6.
Opphevende effekten av lave oksygenkonsentrasjoner på endotelceller cellemonolag og mikrovaskulær permeabilitet har værtstudert av Ogawa 7. Rottehjerne mikrovaskulære endotelceller (RBMECs) ble brukt til å utvikle den in vitro BBB. Oksygen-glukose deprivasjon og reoksygenering (OGD-R) teknikk som presenteres i denne protokollen er tilpasset fra studier av Zulueta et al og Zhu et al 8,9. Vi utsatte hjerne endotelceller til OGD-R ved å plassere dem i en hypoksi / anoksi kammer inneholdende 0% O 2, 5% CO2 og 95% N2. Celler ble senere vurdert for endringer i TJ integritet og stress fiberdannelse ved hjelp av immunfluorescens lokalisering og rhodamin phalloidin merking hhv. Immunfluorescens farging for zonula okkludens-en (ZO-1) blir utført for å bestemme TJ integritet, som ZO-1 er en viktig stillas membranbundet protein TJ. Rhodamine Phalloidin merking bestemmer trådformede aktin (f p-aktin) i cellen cytoskjelettet og er en klar indikasjon av aktin spenning fiberdannelse i endotelceller.
<p class = "jove_content"> Målet med denne fremgangsmåte er å gi innsikt i utviklingen OGD-R som en in vitro modell for å studere IR BBB endotelcelle TJ integritet og F-aktin spenning fiberdannelse. Resultatene vil gi informasjon om skjebnen til TJ protein, ZO-1 og stress fiberdannelse følgende OGD-R. Forstå disse sammenhengene vil gi en mulighet til å bestemme de underliggende molekylære mekanismer som utløses følgende OGD-R og utvikle potensielle terapeutiske strategier for å forbedre BBB avbrudd følgende OGD-R behandling.Protocol
Representative Results
Discussion
OGD-R som en in vitro modell for iskemi-reperfusjonsskade har blitt godt etablert for å studere neuroner 10,11. Det er også undersøkelser som viser effekten av OGD på hjerne endotelceller og endringer i permeabilitet og TJ integritet 9. Imidlertid viser vår studere effekten av OGD samt reoksygenering, som er en nærmere fremstilling av iskemisk reperfusjonsskade i in vivo-betingelser som forekommer etter iskemisk slag.
Hypoksisk-iskemisk …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkjenner Scott and White Hospital Stipend Program for økonomisk støtte og Texas A & M Health Science Center College of Medicine Integrert Imaging Laboratory for bruk av konfokal laser mikroskop. Vi erkjenner Mr. Glen Cryer for å få hjelp med manuskriptet redigering.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
