Summary
ジンクフィンガードメインは、本質的に細胞透過性及び広範囲の哺乳類細胞型へのタンパク質の送達を媒介することができる。ここでは、細胞内タンパク質の送達のためのジンクフィンガーの技術を実施するための詳細なステップバイステップのプロトコルが提供される。
Introduction
高効率と汎用性タンパク質の送達戦略は、多くの基礎研究および治療用途のために重要である。細胞への精製されたタンパク質の直接送達は、これを達成するための最も安全で簡単な方法のいずれかを表す。核酸からの遺伝子発現に依存する戦略とは異なり1,2、3-5タンパク質の送達は、挿入突然変異の危険をもたらすことはないとは無関係である細胞の転写/翻訳機構と即効することができます。しかし、タンパク質上に細胞透過活性の賦与するための簡単で一般化方法の欠如は、日常的に細胞への直接のエントリを混乱させる。細胞内タンパク質の送達を容易にするための現在の方法は、天然6-8または設計された細胞透過性ペプチド、9-12過給導入ドメイン、13,14ナノ粒子15およびリポソーム16ウイルス様粒子17,18発生の使用に基づいている。19残念ながら、これらのアプローチの多くは、低細胞取り込み率、20,21安定性が悪く、22不注意細胞型特異性、23低いエンドソーム脱出特性24と毒性によって妨げられている。さらに、25、多くのタンパク質形質導入技術は、配信するタンパク質の生物活性を減らす。14
キメラ制限がプログラム可能なのCys 2 -His 2ジンクフィンガーDNA結合タンパク質とFokI制限エンドヌクレアーゼ26-28の切断ドメインからなるエンドヌクレアーゼ- -本質的に無細胞である私たちの研究室では、以前ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）のタンパク質があることを実証した透過性。29この驚くべき細胞透過活性はカスタム設計ジンクフィンガードメイン、ターゲットゲノムENのための強力なツールとして浮上しているDNA結合プラットフォーム固有の性質であることが示されたgineering、30-32およびタンパク質表面の6つの正に荷電した残基のコンステレーションの結果であると考えられる。実際、c-Junの及びN-DEKを含むいくつかのDNA結合タンパク質は、細胞膜を通過する先天的能力を有することが示されている。 図33は、さらに最近では、我々の研究室では、これらの結果に展開され、亜鉛の細胞透過活性のことを実証指（ZIF）ドメインは、細胞内のタンパク質送達のために活用することができた。従来の多くの細胞透過性ペプチド送達システムを超えた効率性を取り込むために導いた特定のタンパク質の貨物に一次元または二本指をZIFドメインのどちらかの遺伝子融合。34最も顕著、ZIF媒介送達が融合した、酵素貨物の活性を危うくし、促進しませんでした細胞質ゾルデリバリーの高レベル。まとめると、これらの知見は、タンパク質の効率的かつ容易な送達を促進するためのZIFドメインの可能性を実証し、潜在的により多様な種類のマクロ細胞内への分子、。
ここでは、哺乳動物細胞におけるタンパク質の送達のためのZIF技術を実装する方法の詳細なステップバイステップのプロトコルが提供される。我々は以前に一次元、二次元、三、四速、五起因αヘリックスDNA結合残基のそれぞれの置換を、DNAに結合する能力を欠いている6フィンガーZIFドメインのスイートを構築したが、セル34（ 図1）にタンパク質を送達することができる。二本指ZIFドメインを使用してHeLa細胞にエメラルドGFP（EmGFP）の産生および形質導入が記載されている。このプロトコルは、 大腸菌での可溶性発現が可能なほぼすべてのタンパク質、ほぼ任意の哺乳動物細胞型に拡張可能である。期待される結果を提供し、このシステムのパフォーマンスを最大化するための戦略もまた、議論されている。
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Protocol
1.クローニング
- をpET-28の発現ベクター系にサブクローン化し、要求（PET-2F-ZIF）承りますされてきたアラニン置換二本指ZIFドメインを取得します。34
- PCRはプライマーを用いて、プラスミドエメラルド-のpBADからEmGFPを増幅5 'のXmaI-EmGFP（5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3';太字でXmaIで I部位）および3 'のSacI-EmGFP（5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' ;太字のSacI部位）。
- 蒸留/脱イオン水で構成された残りの容量は100μlの溶液中で鋳型DNA 5ngの、10×ポリメラーゼバッファー、Taq DNAポリメラーゼの1単位（U）、0.2mMの10μlの各dNTP、各プライマー、0.2μMを使用。サイクル条件を使用してください：95℃、5分間。 1分30秒、72℃30秒間、55℃、95℃の30サイクル; 10分間72℃である。ゲルextractiによってPCR産物を精製し上とABS 260×50 / mlの測定分光光度計を用いてDNA濃度を決定する。
- ダイジェストをpET-2F-ZIFおよび1μgのDNAあたりの酵素10 Uを使用して、37℃で3時間のための推奨バッファ内の制限酵素XmaIで IとSacIでEmGFPをコードするインサート。臭化エチジウム等の蛍光インターカレート色素を用いたアガロースゲル電気泳動によりDNAを可視化する。
- ゲル抽出キットによって消化されたDNAを精製し、腹筋260×50 / mlのを測定する分光光度計でDNA濃度を決定する。
- RTで少なくとも1時間のT4 DNAリガーゼの1 Uを用いたPET-2F-ZIFの50-100 NGに精製されたEmGFPをコードするDNAを連結。 1のインサート·ベクターのモル比：最高の結果を得るには、6を使用してライゲーション反応を行う。
- 氷の上の任意の化学的にコンピXL-1ブルー大腸菌細胞50μlを解凍し、連結し、pET-2F-ZIF-EmGFPの10-20 NGで軽く混ぜる。
- 3氷上で保管してください0分。 90秒間、42℃でヒートショックの混合物を、振とうしながら37℃で1時間、異化代謝産物抑制（SOC）とスーパー最適ブロスの2ミリリットルで細胞を回収する。
- 50μg/ mlのカナマイシンを含むLB培地（LB）寒天プレート上に回復培養物100μlを広げ、37℃でO / Nインキュベートする。
- 翌日、スーパーブロス（SB）または50μg/ mlのカナマイシン、37℃でLB寒天プレート培養O / Nから1つのコロニーとを含むLB培地6mlの接種。
注：コロニーPCRプライマー5 'のXmaI-EmGFPおよび3'を用いてのSacI-EmGFPをミニプレップする前に、陽性クローンを同定するために使用することができる。 - ミニプレップによりたpET-2F-ZIF-EmGFPを精製し、T7プロモーターを用いてDNA配列決定によりプラスミドを確認し（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 '）。
2.発現および精製
- 化学的にコンピテントBL21 E.50μlの解凍氷の上で大腸菌の細胞およびPLをpET-2F-ZIF-EmGFP 100ngので軽く混ぜるasmid。ステップ1.7から1.8に記載されているように変換します。
- 翌日、単一コロニーを50μg/ mlのカナマイシンを含むLB培地10mlに接種し、振盪しながら37℃でO / Nを成長させる。
- 翌日、50μg/ mlのカナマイシン、0.2％グルコースおよび100μMのZnCl 2を補充したLB培地1L中にO / N培養物を10mlに希釈。 0.8の600nmで（OD 600）での光学密度に振とうしながら37℃で培養物を成長させ、2 mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いてタンパク質発現を誘導する。 37℃での増殖の6時間後に、4℃で10分間、5000×gでの遠心分離により収穫細胞。
注意：誘導条件は非常に可変であり、発現しているタンパク質の安定性に依存します。 0.8のOD 600に達するまでOD 600を 30分ごとに監視します。 - 溶解緩衝液5ml（50mMトリス-HCl、500mMのNaCl中で細胞ペレットを再懸濁し、100μMのZnCl 2を 、1メートルMジチオスレイトール（DTT）、1mMのMgCl 2、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、および10 mMイミダゾール、pHは8.0）。溶解以下の設定で超音波処理することにより氷上で細胞：/ 10秒オフの間隔で5秒で50％の電力出力、4分の処理時間。ソリューションの過熱を防ぐ。
- 4℃で30分間25000×gで細胞溶解物を遠心分離し、新鮮な収集チューブに上清を移す。最良の結果を得るには、4℃でのすべての次の手順を実行します。
- 平衡化されたNi-NTAスラリーの1ミリリットルで予め充填したカラムに上清を実行します。洗浄緩衝液を20ml（50mMトリス-HCl、500mMのNaCl、100μMのZnCl 2、1mMのDTT、1mMのMgCl 2、30 mMイミダゾール、pH8.0）で樹脂を洗浄する。
- 溶出緩衝液5ml（50mMトリス-HCl、500mMのNaCl、100μMのZnCl 2、1mMのDTT、1mMのMgCl 2、300 mMイミダゾール、pH8.0）でタンパク質を溶出する。
- バッファは、ストレージ·バッファーで溶離したタンパク質（50mMの交換をトリス-HCl、500mMのNaCl、100μMのZnCl 2、1mMのDTT、1mMのMgCl 2、10％グリセロール、pH8.0）で、製造業者の説明書に従って遠心分離によってスピン濃縮器を用いて、少なくとも40μM、タンパク質を濃縮する。
- BCAやBradfordアッセイによりタンパク質濃度を決定します。 、2μlの2×SDS-PAGEローディング色素で精製タンパク質を2μlを混合し、10分間95℃で沸騰した後、タンパク質純度（ 図2）を評価するために、4％-20％トリス-グリシンSDS-PAGE上で解決する。
3.タンパク質貯蔵
- 濃縮タンパク質、-80℃で液体窒素とストア内のフラッシュ凍結アリコート。 EmGFP融合タンパク質については、光からタンパク質を保護するためにアルミホイルでチューブをカバーする。
- タンパク質溶液の凍結融解の繰り返しは避けてください。注意：ZIF融合タンパク質は、少なくとも1ヶ月間、これらの条件下で安定である。不適切または> 4月のストレージがつながる可能性タンパク質沈殿またはEmGFPの光退色に。
4.タンパク質導入
- 10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）および1％抗生物質-抗真菌37℃、5％CO 2に完全に加湿雰囲気中を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHeLa細胞を維持する。
注：細胞は30倍以上のタンパク質導入のために推奨されていません継代した。 - 25℃で30から60分間ポリリジンを50μg/ mlの500μlのプレコート24ウェルプレート。ウェルあたり2×10 5細胞の密度で24ウェルプレート上にシード細胞。播種後24時間で、または細胞に一度80パーセント-90％コンフルエントの間にある、各ウェルから培地を除去し、予め温めておいた無血清DMEM（SFM）を500μlで洗浄する。
- 各ウェルに、ZIF-EmGFPタンパク質及び100μMのZnCl 2の2μMを含むSFMの250μlを添加する。 1時間37℃で細胞をインキュベート。注意：ZIFドメインが細胞に入るPRimarilyエネルギー依存性機構であるマクロピノサイトーシス、34を介して。したがって、細胞は、効率的なタンパク質の内在化のために37℃でインキュベートされなければならない。
- 細胞から培地を除去および0.5mg / mlのヘパリンを補足したカルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝食塩水（DPBS）500μlで3回洗浄する。注：ヘパリン下流分析を複雑にする可能性があり、表面に結合したタンパク質を除去する必要がある。
- 強化された配信のための3回まで（オプション）を繰り返しトリートメント。
- すぐに2分間37℃で、0.05％トリプシン-EDTAを用いて消化することにより洗浄した後、ヘパリン処理した細胞を単離する。 1％FBSを補充したDPBS 0.5mlに剥離した細胞を再懸濁する。
- フルオレセインイソチオシアネート（FITC）チャンネル（ 図3）を用いてフローサイトメトリーにより35を 、各サンプルの蛍光強度を測定する。の人口を配置する前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）を調整異なる特性を持つ集団が相互に解決されることを保証する規模の利息、。
- SFMのみで処置した細胞にZIF-EmGFPで処理したHeLa細胞から36ノーマライズ蛍光を、各サンプル10,000ライブイベントを収集し、フローサイトメトリーデータ分析ソフトウェアを用いてデータを分析する。
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Representative Results
二本指ZIF-EmGFP融合タンパク質はE.で発現させることができる大腸菌 > 95％の均質性及び高収率で（> 25 mg / ml）で（ 図2）。一般的には、1次元と2本指のZIF融合タンパク質は、野生型非修飾タンパク質のものとほぼ同じ量で製造することができる。しかし、いくつかの文脈において、5員環及び6フィンガーZIF融合タンパク質は、下流の用途のために十分に高い収率で製造することができない。
37℃で90分間インキュベートしたHeLa細胞上に二本指ZIF-EmGFPタンパク質の直接適用は、EmGFP蛍光（ 図3A）の用量依存的な増加をもたらす。批判的に、蛍光はZIFドメインの非存在下で観察されない。我々は以前、細胞のほぼ100％が、わずか2μM二指ZIF-EmGFP蛋白質で処理した後、蛍光性であることが観察され、ZIF融合タンパク質で処理したHeLa細胞は、タンパク質濃度でEmGFP蛍光に関して陽性であることを 0.25μM（ 図3B）と低い。
図1.構造とジンクフィンガータンパク質の配列。シングルジンクフィンガー（ZIF）ドメインの（トップ）の結晶構造。 。のZn 2+と調整の保存さCysおよびHis残基の側鎖は、イオンがスティック（PDB ID：2I13）として示しているZIFドメインの37（下）シーケンス。矢印とシリンダはそれぞれ、Βシートおよびαヘリックス二次構造を示している。アラニンで置換されたαヘリックスDNA結合残基はピンクの強調表示されます。正に荷電した残基は、水色をハイライト表示された細胞内在化を媒介すると予測している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
精製された一次元、二次元、三、四指ZIF-EmGFP融合タンパク質の、図2のSDS-PAGEは。ZIF-EmGFP融合タンパク質を大腸菌で発現させた大腸菌およびNi-NTAアガロース樹脂により精製した。溶出したタンパク質を4％~20％Tris-グリシンゲルを用いてSDS-PAGEにより純度を分析した。有意な劣化やZIF-EmGFP融合タンパク質の切断型は認められなかった。
HeLa細胞に、図3 ZIF媒介タンパク質送達。 （A）は 、2つの指ZIF-EmGFPタンパク質の量の増加で処理したHeLa細胞の蛍光強度。 EmGFPタンパク質で処理したHeLa細胞は、単独で、未処理の細胞と完全にオーバーラップする。（B）2μMoを用いて連続的に処理したHeLa細胞の正規化蛍光強度F二本指ZIF-EmGFPタンパク質。蛍光強度は、フローサイトメトリーによって決定した。
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Discussion
ここでは、細胞透過性のジンクフィンガー（ZIF）ドメインを用いてタンパク質送達のためのステップバイステップのプロトコルが提供される。 ZIFドメインは、融合した、酵素貨物34の活性を低下させない。非修飾タンパク質で観察されるものとほぼ同じ収率でのタンパク質の産生および精製を可能にする。そして伝統的な細胞透過性ペプチドまたはタンパク質導入ドメインシステムを超える効率を有する広範囲の細胞型にタンパク質および酵素を輸送することができる。まとめると、これらの知見は、広範囲の用途のための細胞への直接タンパク質送達を媒介するためのZIFドメインの幅広い可能性を示している。
最大のタンパク質の送達は、以前より大きな正電荷を運ぶ3および4フィンガーZIFドメインの配列を延長にもかかわらず、唯一の二本指ZIFドメインを使用して達成された。これらの知見は、ZIF媒介細胞侵入、電荷、株式会社以外の要因によって影響されるかもしれないことを示すタンパク質の安定性または配座剛性をluding。 ZIFドメイン媒介性タンパク質の送達はまた、エネルギー依存性であることが見出され、従って、タンパク質で処置した全ての細胞を37℃でインキュベートされることを必要とした。様々なエンドサイトーシス経路の小分子阻害剤の使用を介して、マクロピノサイトーシス、およびより少ない程度のカベオリン依存性エンドサイトーシスに、ZIF媒介性細胞侵入のための主要な経路であると決定された。34は特に、他のタンパク質伝達システムとは異なり、ZIFドメインである効率的に、溶融高分子カーゴの細胞質ゾルデリバリーの高いレベルを媒介するためにエンドソームのエスケープ強固なタンパク質の送達を達成するためにこれらのドメインの可能性を強調することができる。
我々の経験では、細胞の播種密度は、タンパク質形質導入の高いレベルを達成するための重要なステップである。我々は、彼らが80％〜90％の密集度に達すると、細胞を治療し、以前に観察することをお勧めその> 95％の集密度ショーのサブで播種細胞最適な形質導入能力、細胞は低密度で播種しながら（<50％）のタンパク質によって誘導される毒性の影響を受けやすい。重要なことには、高い剥離傾向を有する細胞型のため、ポリ - リジンでプレコーティング細胞培養プレートを推奨している。ポリリジンは、負に荷電した細胞表面成分との静電相互作用を介して細胞接着を促進する。各ZIFドメインのαヘリックスDNA結合残基は、DNA認識のためのあらゆる可能性を排除するために除去されているが、ΒΒαのZIFドメインの折り畳みを安定させるためのZn 2+イオンとの調整システイン及びヒスチジン残基がそのまま残る。したがって、我々は、任意の記憶バッファは、タンパク質の完全性を維持するためのZnCl 2の少なくとも100μMで補足することをお勧めします。
ZIFドメインは以前に、様々な細胞型にタンパク質および酵素を提供することが示されたが、ZIF送達の効率は、両方のmacromoに依存する可能性があるキュラ貨物タンパク質濃度。例えば、細胞は、2つの指ZIF - ルシフェラーゼ融合タンパク質で処理した細胞は、二本指で処理しながら、より高い濃度で活性低下を、0.5μMタンパク質で処理したときに最大発光を示すことが観察されたEmGFP蛍光の用量依存的増加を示した8.0μMタンパク質まで、連続タンパク質トリートメントの際に強度。したがって、我々は、濃度範囲全体でそれぞれの固有のZIFドメイン融合の細胞透過能力を評価することをお勧めします。
まだ証明されていないが最後に、我々は、ZIFドメインの配信が細胞内に巨大分子の多様な配列を送達することができる、非常に柔軟なプラットフォームであることを期待しています。 DNAとRNAの両方が化学的に加水分解可能なリンカーを介してZIFドメインの表面上に官能化され、または一過ZIFドメインのカプセル化によって細胞にトランスフェクトするために、例えば、それが可能である。さらに、efficiZIFのタンパク質送達のencyはさらに表面電荷の最適化に焦点を当てた合理的な設計の努力によって高めることができる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
この作品は、とShanghaiTech大学、上海、中国（DP1CA174426カルロスF.バルバスへ）（JL）の国立衛生研究所によってサポートされていました。分子グラフィックスはPyMOLをを使用して生成された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
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