Solid lipid Nanopartiklar (SLNs) för Intracellulär Targeting Tillämpningar

Summary

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Abstract

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Introduction

Nanopartikelbaserade leveransfordon har visat mycket lovande för intracellulära inriktnings applikationer, vilket ger en mekanism för att specifikt förändra cellulär signalering och genuttryck. Dessa fordon kan laddas med läkemedel, proteiner och nukleinsyror som är avsedda att påverka cellulära svar och uppnå en önskad effekt i målvävnaderna. Många typer av nanocarriers har utforskats för terapeutisk och diagnostisk fördel inklusive lipider, polymerer, kisel och magnetiska material. Dessa system är attraktiva på grund av deras potential för lokal administrering läkemedel, ökad terapeutisk koncentration i målvävnader, och minskning av systemisk toxicitet.

Fasta lipida nanopartiklar (SLNs) är ett väl studerat exempel på en nanopartikel leveranssystem som har uppstått som en lovande läkemedelsleveransfordon under senare år. SLNs kan lätt formuleras för flera tillämpningar, inklusive bio kännande ^1, kosmetika ² och therapeutic leverans ^3-7. Deras användbarhet härrör från det faktum att de är helt består av resorberbara, ogiftiga lipider, vilket resulterar i förbättrad biokompatibilitet. Under syntes kan lipofila läkemedel införlivas i SLN fordon och därigenom öka läkemedlets löslighet och lämplighet för parenteral administration. SLN fordon bidrar också till att stabilisera inkapslade läkemedel, vilket minskar deras nedbrytning och clearance, och maximera terapeutisk verkan. Dessa fordon är särskilt väl lämpade för långtidsverkande, beredningar för kontrollerad frisättning på grund av deras stabilitet vid kroppstemperatur ^3,4,8,9. Viktigt, inkapsling av läkemedel i lipid nanopartiklar förändrar de inneboende farmakokinetiska profilerna för läkemedelsmolekyler. Detta tillhandahåller en potentiell fördel genom att tillåta kontrollerad frisättning av läkemedel med ett smalt terapeutiskt index. Frisättningshastigheten för SLN-inkorporerade terapeutika kan avstämmas baserat på hastigheten lipiden nedbrytning eller läkemedlets diffusionshastighet ilipidmatrisen.

SLNs ofta konstruerade för att ackumuleras i vissa målvävnader. Exempelvis deras storlek (typiskt större än 10 nm) potentierar retention i omlopp, där läckande vaskulaturen av tumörvävnad underlättar avlagring. Dessutom har vägen partikel administrering visats påverka biodistributionen med potential att rikta specifika fysiologiska strukturer såsom lymfkörtlar ^10,11. Vid avsättning i målvävnader, att uppnå lämpliga cellulära interaktioner och eventuell internalisering av nanopartiklar är en utmaning på grund av förmågan hos cellmembran för att selektivt styra flödet av joner och molekyler in i och ut ur cellen ^12. För att underlätta cellulär upptagning, är det möjligt att modifiera nanocarriers med specifika ligander innefattande peptider, små molekyler, och monoklonala antikroppar ^13,14. Flera mekanismer, inklusive både passiva penetration och aktiv transport av nanopartiklaröver cellmembranet har tidigare beskrivits ^3,12,15. I allmänhet har det visats att cellnanopartiklar interaktioner påverkas av de fysiokemiska egenskaperna hos de nanopartiklar, inklusive storlek, form, ytladdning och ytkemi, förutom cellspecifika parametrar såsom celltypen eller cellcykelfasen ^12.

En tidigare undersökning visade syntesen av sub-10 nm SLNs för aktuella ¹⁶ och biomarkörer upptäckt applikationer ¹ med hjälp av fasinversion temperaturen (PIT) metoden ^17. Detta är en mild syntesmetod där ^två kompositionen förblir konstant under det att temperaturen gradvis ändras. Kontinuerlig omröring av den uppvärmda lösningen, när den svalnar till RT resulterar i en nanoemulsion. Denna process resulterar i syntesen av SLNs med mindre partikelstorlek ¹ än vad som tidigare rapporterats med olika metoder för syntes av lipid nanoparticles ^17-22. Den resulterande storlekstabellen, mindre än 20 nm, ger en fördel för intracellulära inriktningstillämpningar på grund av ökad yta och potentialen för förbättrade cellulära interaktioner.

Ett schema över SLNs, utformad för att leverera ett fluorescerande färgämne eller terapeutisk, visas i Figur 1. De SLNs består av en lipid inre (t.ex. linjär alkan) som möjliggör införlivandet av lipofila föreningar (t.ex. färgämnen eller terapeutika) och ett ytaktivt exteriör (t.ex. linjär nonjonisk tensid) omgiven av vatten. I denna studie var SLNs laddade med ett fluorescerande färgämne och användas som en modell för att undersöka partikelcellinteraktioner. Primära humana hudfibroblaster och mus dendritiska celler utsattes för färg laddad SLN över tiden för att karakterisera interaktioner med avseende på toxicitet och partikelupptagning. En 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) analysen var Utilized för att fastställa lämpliga doseringsnivåer. Fluorescensmikroskopi och flödescytometri var två metoder som används för att undersöka partikelupptag in vitro.

Figur 1. Schematisk av SLN visar huvudbeståndsdelarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. Behandling av SLNs Syntes av SLNs Obs! Använd PIT metoden 1,17,20 att förbereda under 20 nm SLNs 1. Använd aseptisk teknik, bioreagens eller cellodlingskvalitet reagens och sterila material (dvs, pipetter, spatlar, flaskor, etc.). Använd en biosäkerhet skåp för syntesen av SLNs (figur 2). Kombinera 0,6 mg fluorescerande färgämne (Nilrött (NIR), är NiR koncentration cirka 0,3 mg / ml) och 0,10 g heneikosa…

Representative Results

PIT metod användes för att syntetisera de SLNs och fasinversion Temperaturen bestämdes med användning av ett vattenbad. Proverna var långsamt uppvärmd och försiktigt upprörd tills lösningen verkade klar. Fasinversion temperatur för de SLNs framställda med användning heneikosan lipiden är 45 ° C. Tabell 1 sammanfattar den partikelstorlek, polydispersitet, smältpunkt och latent värme för smältande för SLNs. De SLNs syntetiserade med användning av de processbetingelser som beskrivits ov…

Discussion

I denna studie syntes av SLNs och deras användbarhet för intracellulära inriktnings applikationer utforskas. Dessa biokompatibla nanopartiklar har visat lovande resultat som avgivningsvehiklar för flera tillämpningar, inklusive drug delivery, tysta gener, och vaccinteknik ^25-30. Ultrasmå SLNs syntetiserades med hjälp av en enkel process, och deras interaktioner med primära hudceller och primära immunceller undersöktes. SLNs var utformade för att inkludera inkapsling av ett fluorescerande färgämne…

Materials

Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo	—-	Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3,[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	—-	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	R&D Systems	415	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	R&D Systems	404	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.