Summary

Solid lipid Nanopartiklar (SLNs) för Intracellulär Targeting Tillämpningar

Published: November 17, 2015
doi:

Summary

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Abstract

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Introduction

Nanopartikelbaserade leveransfordon har visat mycket lovande för intracellulära inriktnings applikationer, vilket ger en mekanism för att specifikt förändra cellulär signalering och genuttryck. Dessa fordon kan laddas med läkemedel, proteiner och nukleinsyror som är avsedda att påverka cellulära svar och uppnå en önskad effekt i målvävnaderna. Många typer av nanocarriers har utforskats för terapeutisk och diagnostisk fördel inklusive lipider, polymerer, kisel och magnetiska material. Dessa system är attraktiva på grund av deras potential för lokal administrering läkemedel, ökad terapeutisk koncentration i målvävnader, och minskning av systemisk toxicitet.

Fasta lipida nanopartiklar (SLNs) är ett väl studerat exempel på en nanopartikel leveranssystem som har uppstått som en lovande läkemedelsleveransfordon under senare år. SLNs kan lätt formuleras för flera tillämpningar, inklusive bio kännande 1, kosmetika 2 och therapeutic leverans 3-7. Deras användbarhet härrör från det faktum att de är helt består av resorberbara, ogiftiga lipider, vilket resulterar i förbättrad biokompatibilitet. Under syntes kan lipofila läkemedel införlivas i SLN fordon och därigenom öka läkemedlets löslighet och lämplighet för parenteral administration. SLN fordon bidrar också till att stabilisera inkapslade läkemedel, vilket minskar deras nedbrytning och clearance, och maximera terapeutisk verkan. Dessa fordon är särskilt väl lämpade för långtidsverkande, beredningar för kontrollerad frisättning på grund av deras stabilitet vid kroppstemperatur 3,4,8,9. Viktigt, inkapsling av läkemedel i lipid nanopartiklar förändrar de inneboende farmakokinetiska profilerna för läkemedelsmolekyler. Detta tillhandahåller en potentiell fördel genom att tillåta kontrollerad frisättning av läkemedel med ett smalt terapeutiskt index. Frisättningshastigheten för SLN-inkorporerade terapeutika kan avstämmas baserat på hastigheten lipiden nedbrytning eller läkemedlets diffusionshastighet ilipidmatrisen.

SLNs ofta konstruerade för att ackumuleras i vissa målvävnader. Exempelvis deras storlek (typiskt större än 10 nm) potentierar retention i omlopp, där läckande vaskulaturen av tumörvävnad underlättar avlagring. Dessutom har vägen partikel administrering visats påverka biodistributionen med potential att rikta specifika fysiologiska strukturer såsom lymfkörtlar 10,11. Vid avsättning i målvävnader, att uppnå lämpliga cellulära interaktioner och eventuell internalisering av nanopartiklar är en utmaning på grund av förmågan hos cellmembran för att selektivt styra flödet av joner och molekyler in i och ut ur cellen 12. För att underlätta cellulär upptagning, är det möjligt att modifiera nanocarriers med specifika ligander innefattande peptider, små molekyler, och monoklonala antikroppar 13,14. Flera mekanismer, inklusive både passiva penetration och aktiv transport av nanopartiklaröver cellmembranet har tidigare beskrivits 3,12,15. I allmänhet har det visats att cellnanopartiklar interaktioner påverkas av de fysiokemiska egenskaperna hos de nanopartiklar, inklusive storlek, form, ytladdning och ytkemi, förutom cellspecifika parametrar såsom celltypen eller cellcykelfasen 12.

En tidigare undersökning visade syntesen av sub-10 nm SLNs för aktuella 16 och biomarkörer upptäckt applikationer 1 med hjälp av fasinversion temperaturen (PIT) metoden 17. Detta är en mild syntesmetod där två kompositionen förblir konstant under det att temperaturen gradvis ändras. Kontinuerlig omröring av den uppvärmda lösningen, när den svalnar till RT resulterar i en nanoemulsion. Denna process resulterar i syntesen av SLNs med mindre partikelstorlek 1 än vad som tidigare rapporterats med olika metoder för syntes av lipid nanoparticles 17-22. Den resulterande storlekstabellen, mindre än 20 nm, ger en fördel för intracellulära inriktningstillämpningar på grund av ökad yta och potentialen för förbättrade cellulära interaktioner.

Ett schema över SLNs, utformad för att leverera ett fluorescerande färgämne eller terapeutisk, visas i Figur 1. De SLNs består av en lipid inre (t.ex. linjär alkan) som möjliggör införlivandet av lipofila föreningar (t.ex. färgämnen eller terapeutika) och ett ytaktivt exteriör (t.ex. linjär nonjonisk tensid) omgiven av vatten. I denna studie var SLNs laddade med ett fluorescerande färgämne och användas som en modell för att undersöka partikelcellinteraktioner. Primära humana hudfibroblaster och mus dendritiska celler utsattes för färg laddad SLN över tiden för att karakterisera interaktioner med avseende på toxicitet och partikelupptagning. En 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) analysen var Utilized för att fastställa lämpliga doseringsnivåer. Fluorescensmikroskopi och flödescytometri var två metoder som används för att undersöka partikelupptag in vitro.

Figur 1
Figur 1. Schematisk av SLN visar huvudbeståndsdelarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. Behandling av SLNs Syntes av SLNs Obs! Använd PIT metoden 1,17,20 att förbereda under 20 nm SLNs 1. Använd aseptisk teknik, bioreagens eller cellodlingskvalitet reagens och sterila material (dvs, pipetter, spatlar, flaskor, etc.). Använd en biosäkerhet skåp för syntesen av SLNs (figur 2). Kombinera 0,6 mg fluorescerande färgämne (Nilrött (NIR), är NiR koncentration cirka 0,3 mg / ml) och 0,10 g heneikosa…

Representative Results

PIT metod användes för att syntetisera de SLNs och fasinversion Temperaturen bestämdes med användning av ett vattenbad. Proverna var långsamt uppvärmd och försiktigt upprörd tills lösningen verkade klar. Fasinversion temperatur för de SLNs framställda med användning heneikosan lipiden är 45 ° C. Tabell 1 sammanfattar den partikelstorlek, polydispersitet, smältpunkt och latent värme för smältande för SLNs. De SLNs syntetiserade med användning av de processbetingelser som beskrivits ov…

Discussion

I denna studie syntes av SLNs och deras användbarhet för intracellulära inriktnings applikationer utforskas. Dessa biokompatibla nanopartiklar har visat lovande resultat som avgivningsvehiklar för flera tillämpningar, inklusive drug delivery, tysta gener, och vaccinteknik 25-30. Ultrasmå SLNs syntetiserades med hjälp av en enkel process, och deras interaktioner med primära hudceller och primära immunceller undersöktes. SLNs var utformade för att inkludera inkapsling av ett fluorescerande färgämne…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Research reported in this publication was supported by The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory’s Research and Exploratory Development Department, Office of Technology Transfer, and Stuart S. Janney Fellowship Program, in addition to the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number R21HL127355.

Materials

Nile Red (NiR) Sigma 19123 BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane Aldrich 286052 98%
Brij O10 Sigma P6136 Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water Sigma W3500 Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding Life Sciences PN4612 Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra  Microtrac serial number U1985IS Instrument
Differential Scanning Calorimeter Mettlet-Toledo —- Instument
Primary human fibroblasts  Life Technologies C-004-5C Neonatal (HDFn)
Medium 106 Life Technologies M-106-500 A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) Life Technologies S-003-K All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit Trevigen 4890-025-K Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3,[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader Tecan —- Instrument
Phosphate buffered saline  Sigma P5493 For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF  R&D Systems 415 >97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4  R&D Systems 404 >97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

References

  1. Calderon-Colon, X., et al. Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications. J Nanopart Res. 16 (2252), 1-10 (2014).
  2. Patwekar, S., et al. Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3 (8), 1407-1421 (2014).
  3. Martins, S., et al. Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway. International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).
  4. Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. Solid Lipid Nanoparticles – A Review. International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5 (2), 8-18 (2013).
  5. Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art. Eur J Pharm Biopharm. 86 (1), 7-22 (2014).
  6. Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) – As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs. International Journal of Advanced Research. 2 (1), 433-441 (2014).
  7. Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
  8. Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends Pharmacol Sci. 30 (11), 592-599 (2009).
  9. Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
  10. Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations. International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).
  11. Oussoren, C., Storm, G. Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration. Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).
  12. Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters. J Nanobiotechnology. 12, 5 (2014).
  13. Joshi, M. D., Muller, R. H. Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).
  14. Torchilin, V. P. Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).
  15. Ashley, C. E., et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nature materials. 10, 389-397 (2011).
  16. Patchan, M., et al. Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery. Nanobandage for controlled release of topical therapeutics. 3, 255-258 (2013).
  17. Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S., Koutsoukos, P. Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV. Progress in Colloid and Polymer Science. 118, 184-189 (2001).
  18. Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).
  19. Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion. , 132-137 (2011).
  20. Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C., Buckin, V. Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV. Progress in Colloid and Polymer Science. 115, 36-39 (2000).
  21. Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature. Langmuir. 17 (7), 2076-2083 (2001).
  22. Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design. Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).
  23. Raimondi, G., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients. J Immunol. 184, 624-636 (2010).
  24. Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles. J Control Release. 133 (13), 191-197 (2009).
  25. Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells.. Front Pharmacol. 5 (159), 1-22 (2014).
  26. Musacchio, T., Torchilin, V. P. Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (16), 1388-1412 (2011).
  27. Cerpnjak, K., Zvonar, A., Gašperlin, M., Vrečer, F. Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs). Acta Pharm. 63 (4), 27-445 (2013).
  28. Rodrìguez-Gascòn, A., Pozo-Rodrìguez, A., Solinìs, M. A. Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles. Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).
  29. Almeida, A. J., Souto, E. Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins. Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).
  30. Pardeshi, C., et al. Solid lipid based nanocarriers: an overview. Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).
  31. Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F., Sezer, A. D. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development. Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems. , 107-140 (2012).

Play Video

Cite This Article
Calderón-Colón, X., Raimondi, G., Benkoski, J. J., Patrone, J. B. Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications. J. Vis. Exp. (105), e53102, doi:10.3791/53102 (2015).

View Video