Abstract
Dysfunctionele skeletspieren mitochondria een rol spelen in gewijzigde stofwisseling waargenomen met veroudering, obesitas en type II diabetes. Mitochondriale respirometrische testen van geïsoleerde mitochondriële preparaten oog op het beoordelen van mitochondriale functie, evenals de bepaling van het mechanisme (s) van de werking van geneesmiddelen en eiwitten die het metabolisme moduleren. Huidige isolatie procedures vereisen vaak grote hoeveelheden weefsel van hoge kwaliteit mitochondriën nodig respirometrische assays opleveren. De hierin gepresenteerde werkwijzen beschrijven hoe kwaliteit gezuiverde mitochondria (~ 450 g) worden geïsoleerd uit geringe hoeveelheden (~ 75-100 mg) van muizen skeletspieren voor gebruik in high throughput metingen luchtwegen. We hebben vastgesteld dat onze isolatiemethode levert 92,5 ± 2,0% intact mitochondria door meting citraat synthase activiteit spectrofotometrisch. Bovendien Western blotanalyse in geïsoleerde mitochondria resulteerde in de zwakke expressie van het cytosolic eiwit, GAPDH, en de robuuste expressie van het mitochondriale eiwit, COXIV. Het ontbreken van een prominente band GAPDH in geïsoleerde mitochondriën indicatief is weinig verontreinigingen uit niet-mitochondriale bronnen tijdens de isolatieprocedure. Belangrijker nog, het meten van O 2 verbruik met micro-plaat gebaseerde technologie en het bepalen van de respiratoire controle ratio (RCR) voor gekoppelde respirometrische assays toont sterk gekoppeld (RCR;> 6 voor alle assays) en functionele mitochondriën. Concluderend, de toevoeging van een afzonderlijk hakken stap en aanzienlijke vermindering motor aangedreven homogenisering snelheid van een eerder beschreven werkwijze heeft het de isolatie van hoge kwaliteit en gezuiverde mitochondria uit kleinere hoeveelheden muis skeletspier die resulteert in sterk gekoppelde mitochondria die ademen met een hoge functie tijdens microplaat respirometirc assays.
Protocol
Dierstudies werden uitgevoerd onder een protocol goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Virginia Polytechnic Institute en de State University.
1. Setup (Tijd: ~ 45 min)
- Ontdooi bevroren opslag van 0,25% trypsine, Isolation buffer voor Mitochondria (IBM) 1 en IBM2 in een 37 ° C waterbad.
- Spoel glaswerk en ontleden instrumenten in 70% ethanol gevolgd door zuiver water.
- Bereid 0,05% trypsine-oplossing van 0,25% trypsine voorraad door te verdunnen 1 deel trypsine in 4 delen IBM1.
- Meng protease en fosfatase-inhibitor cocktail met cell lysis buffer (1: 100 verhouding) in een 1,5 ml microcentrifuge buis met schroefdop.
- Aliquot 5 ml (5 ml / muis) van 0,05% trypsine in een 15 ml plastic buis.
- Stel motor aangedreven weefselhomogenisator tot 80 RPM.
2. Isolatie van skeletspieren Mitochondriën (Tijd: ~ 90 min)
- Euthanaseren een muis door CO 2
- Verwijder rode spieren van de quadriceps en gastrocnemius, waarbij de soleus (~ 75-100 mg totaal) zoals beschreven in de volgende stappen omvat:
- Schil de huid in de richting van de muis.
- Verwijder het vet pad over de quadriceps beginpunt. Snijd de quadriceps pees die aan de patella met fijne getipt schaar is bevestigd.
Opmerking: De quadriceps wordt geïdentificeerd door zijn anatomische positie op het voorste gedeelte van de proximale femur. - Langzaam knip de aponeurose tussen het bot en de quadriceps, terwijl het vermijden van de dijbeenslagader, aan de quadriceps van het bot te bevrijden. Snijd de pees met fijne getipt schaar op de oorsprong punt op het dijbeen van de quadriceps te bevrijden en plaats de quadriceps spier in gekoeld PBS.
- Verwijder zichtbaar vetweefsel over de quadriceps met een schaar. Draai de quadriceps om zodat het gedeelte van de spier die werd bovenop de femur wordt geconfronteerd up. Open de quadriceps met een tang in een ventilatie-beweging. Verwijder de twee zichtbare rode spier gedeelten uit elke kwab met fijne getipt schaar en plaats in een bekerglas met 5 ml gekoelde IBM1.
Opmerking: quadricepsspier weergegeven met twee lobben met een strook rode spieren gelegen nabij de zijrand van elke lob. - Snijd de huid bovenop de achillespees met fijne getipt schaar en schil de huid in de richting van de muis. Snijd de blootgestelde achillespees en schil de spier naar het lichaam van de muis.
- Snijd de pees aan de laterale en mediale condylus van het femur met fijne getipt schaar om de gastrocnemius te bevrijden en plaats de gastrocnemius gehecht aan de pezen in gekoelde PBS.
- Flip de gastrocnemius over en trek het soleus spier en plaats in het bekerglas met 5 ml gekoelde IBM1. Ventilator open de gastrocnemius. Verwijder de drie visuele rode spier porties (twee laterale en een mediale oppervlakkige rode stroken) met fijne getipt schaars en overbrengen naar het bekerglas met 5 ml gekoelde IBM1.
- Verwijder een ander ~ 75-100 mg rode spierweefsel het andere been van de muis (zoals beschreven in stap 2.2) en plaats in een 1,5 ml microcentrifuge buis met protease inhibitor cocktail en fosfatase en cellysis buffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% natrium dodecyl sulfaat, 0,5% natrium deoxycholaat, 1% polyoxyethyleen (9) nonylphenylether, vertakte. onmiddellijk flash-bevriezen tweede monster in vloeibare stikstof om later bij Western blotting (zie stap 6,1).
- Plaats een pre-gekoelde, platte kunststof oppervlak op het ijs in een grote bak. Giet een druppel IBM1 op het kunststofoppervlak en gebruik pincet om alle rode doorgesneden spier (stap 2.2.4 en 2.2.7) in IBM1 druppel plaatsen. Hak het spierweefsel gedurende 2 min met 3 enkele rand scheermesjes door het veranderen van scheermessen iedere 40 sec.
- Breng het gehakt weefsel in nieuw bekerglas met 5 ml vers IBM1 houden door het plastic oppervlak van the bekerglas en schrapen de spier in het bekerglas met een scheermesje. Neem deze oplossing en laat het door een 100 um cel zeef geplaatst op een 50 ml conische buis.
- Dep het weefsel met een moeilijke taak wisser en breng deze in 5 ml van 0,05% trypsine-oplossing. Gebruik een pincet om het weefsel van de taak wisser te verwijderen.
- Incubeer het spierweefsel op ijs gedurende 30 min in 0,05% trypsine-oplossing.
- Draai de 15 ml conische buis met trypsine / spier mengsel bij 200 xg gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Giet de trypsine supernatant in een afvalcontainer en resuspendeer de pellet met 3 ml ijskoude IBM1. Breng het weefsel een 45 ml glazen homogenisator buis. Spoel de 15 ml conische buis met nog eens 1,5 ml IBM1 om alle resterende monster te verzamelen en voeg deze toe aan de glashomogenisator buis.
- Plaats het glas homogenisator buis in een beker of een plastic container gevuld helft met ijs, zodat het glas homogenisator beweegt minimaal binnen de beker.
- Breng de weefselhomogenaat om een nieuwe 15 ml conische buis en spoel het glas homogenisator buis met 6,5 ml IBM1. Giet het IBM1 in de 15 ml conische buis met weefselhomogenaat.
- Draai de 15 ml conische buis bij 700 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Giet de bovenstaande vloeistof in een glas met hoge sterkte centrifugebuis en de pellet gooi.
- Draai de supernatant van de bovenstaande stap bij 8000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder de IBM1 supernatant en resuspendeer de pellet door langzaam toevoegen van 500 pi van IBM2. Knip het uiteinde van een pipet en voorzichtig homogeniseren de pellet in IBM2 mengen en roeren van bewegingen. Voeg nog 4,5 ml IBM2 aan het mengsel nadat de pellet volledig is gesuspendeerd.
Opmerking: Vermijd overmatige wrijven terwijl het breken van grotere pellet stukken als thij kan de membranen beschadigen. - Draai de IBM2 / weefsel homogenaat bij 8000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
Opmerking: Deze stap kan worden herhaald in een schone hoge sterkte centrifugebuis voor meer nauwkeurige eiwit kwantificatie van geïsoleerde mitochondria in stap 4 sinds resterende BSA kunnen bijdragen aan de totale eiwitgehalte. - Verwijder de bovenstaande vloeistof en voorzichtig, maar volledig resuspendeer de pellet door het toevoegen van twee 25 ul stappen van IBM2 met een pipet tip met zijn punt afgesneden. Roer en meng de pellet na elke toevoeging van 25 pl IBM2. Plaats deze mitochondriale voorraad op ijs.
3. homogenisering van Whole Tissue Lysate (Tijd: ~ 45 min, kan worden uitgevoerd tijdens Stap 7)
- Verwijder het spierweefsel dat de vloeibare stikstof werd gebracht bij stap 2,3 en incuberen bij kamertemperatuur geroerd tot het volledig ontdooid.
- Hak het weefsel voor ~ 30 sec op ijs met fijne getipt schaar.
- Voeg twee 100 ul bolletjes Zirconium Oxide Beads aan de 1,5 ml microcentrifugebuis met schroefdop uit stap 3.2 dat het gehakt weefsel bevat. Homogeniseer het weefsel in een parelmolen weefselhomogenisator met 2-3 5 min cycli bij een snelheid instelling van 4-6 (medium instelling).
- Draai het mengsel van stap 3,3 bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant met een pipet tip 1000 gl na de spin en overbrengen in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Gooi de pellet en plaats de bovenstaande op het ijs.
4. Eiwit bepaling (Time: ~ 30 min)
- Bepaal de eiwitconcentratie van het gehele weefsel lysaat (stap 3,4) en mitochondriale voorraad (stap 2,17) met de BCA Protein Assay Kit volgens specificaties van de fabrikant.
5. Mitochondriën Membraan Integriteit; Citraatsynthase (CS) activiteit (Tijd: ~ 15 min)
- Maak twee afzonderlijke 1: 20 verdunningen van de mitochondriale voorraad in zuiver water. Toevoegen0,1% van de Triton 100-X een monster en ultrasone trillingen het op een lage stand (765 Watt, amplitude van 2). Laat de andere verdunning op het ijs. Terug het monster ijs na sonicatie.
- Voer een citraat synthase test met zowel de niet-gesoniceerd en gesonificeerd mitochondriale verdunningen met behulp van een spectrofotometrische assay zoals eerder beschreven 11,12.
- Bepaal het percentage intact mitochondria membranen met behulp van de volgende vergelijkingen:
(Non-gesoniceerde CS activiteit ÷ gesoniceerde CS activiteit) * 100
100- N (procent bereikt van boven)
6. Mitochondriën Isolatie Kwaliteit; Western Blotting (Tijd: Volgens protocol Lab)
- Voer Western blotting op het gehele weefsel lysaat en geïsoleerde mitochondria zoals eerder 12 beschreven.
Opmerking: Gebruik primaire antilichamen voor GAPDH (1: 1000 verdunning in 5% BSA / TBS-T) en COXIV (1: 1000 verdunning in 5% vetvrijemelk / TBS-T), gevolgd door anti-geit, en konijn secundaire antilichamen, respectievelijk (1: 10.000).
7. Respirometrische Assay Run (Tijd: ~ 90 min)
- Voeren gewenste respirometrische assays met microplaat O 2 verbruik meettechniek zoals eerder beschreven (zie begeleidend artikel en Rogers et al 8).
- Bepaal de respiratoire controle ratio (RCR) door het delen van State 3 van State 4o (RCR) of State 3u te delen door de Staat 4o. Gebruik ofwel het midden (gemiddelde) punt, of de hoogste (staat 3) en de laagste tarieven (Staat 4o) van de point-to-point sporen bij het bepalen van RCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Citraat synthase activiteit dient als maat voor de membraanintegriteit aangezien citrate synthase is gelegen in het binnenste mitochondriale membraan, en dus moeten niet in suspensies van mitochondria met intacte membranen. Figuur 1 geeft citraat synthase activiteit in niet-gesonificeerde mitochondriale monsters tegenover gesoniceerd monsters van dezelfde isolatie. Sonicatie de mitochondria resulteert in een statistisch significante toename van citraat synthase activiteit (P <0,01). Belangrijk is 92,5 ± 2,0% van de mitochondriën intact na de isolatie.
Figuur 2 geeft GAPDH en COXIV expressie in geïsoleerde mitochondria en het hele skelet spierweefsel lysaat. GAPDH is een eiwit in het cytosol, maar ook in de kern na translocatie, terwijl COXIV een eiwit in het binnenste mitochondriale membraan. Expressie van GAPDH en COXIV zijn duidelijk in het geheel tissUE lysaat. In de geïsoleerde mitochondriën, is uitdrukking van COXIV waargenomen, terwijl slechts zwakke banden van GAPDH zijn evident. Deze bevindingen geven goede mitochondriale isolaties, weinig verontreiniging van niet-mitochondriale bestanddelen tijdens de isolatieprocedure.
Figuur 3 is een representatief traceren O 2 consumptiesnelheden (OCR) versus tijd voor een koppeling assay (10 mM pyruvaat / 5 mM malaat) uitgevoerd vanaf mitochondriën geïsoleerd met dit protocol en uitgevoerd met microplaat O 2 consumptietechnologie. Elk paneel vertegenwoordigt O 2 verbruik in verschillende mitochondriale toestanden zoals beschreven door Chance en Williams 13. Het eerste paneel vertegenwoordigt basale O 2 consumptie of State 2. De tweede paneel, na injectie van ADP, vertegenwoordigt maximale gekoppeld ademhaling, of State 3. Het derde paneel, na injectie van oligomycin A (een remmer van Complex V), VERTEGENTS ademhaling als gevolg van proton lek, of State 4o. Het vierde paneel, na injectie van FCCP vertegenwoordigt maximale ontkoppeld ademhaling of State 3u. Tenslotte, het vijfde paneel, na injectie van Antimycin A vertegenwoordigt de remming van oxidatieve respiratie. De respiratoire controle ratio (RCR), een maat voor de mitochondriale functie 1, werd berekend door de Staat 3 door de staat 4o. Tabel 4 verslagen van de gemiddelde RCR waarden voor alternatieve substraat koppeling tests die kunnen worden uitgevoerd vanaf de mitochondriën opbrengst van dit protocol. Belangrijk is dat de O 2 verbruik opsporen en de hoge RCR waarden vertegenwoordigen zeer functionerende mitochondria en gekoppeld. RCR die hierin vermeld zijn hoger of gelijk is dan eerder gemeld met vergelijkbare isolatie protocollen in muizen skeletspieren 7,14,15, waardoor accentueren de hoge kwaliteit van de mitochondriën geïsoleerd tijdens deze procedure.
Figuur 1: citraatsynthase activiteit. Citraat synthase enzymactiviteit zoals spectrofotometrisch bepaald niet gesonificeerd en gesonificeerd mitochondria preps. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. ** p <0,01. Gegevens vertegenwoordigt n = 3 gepaarde biologische replicaten en uitgedrukt ten opzichte mg eiwit. 
Figuur 2:. Cytosolische en mitochondriale eiwitexpressie in geïsoleerde mitochondria en hele weefsel lysaat Beide geïsoleerde mitochondria en hele weefsel lysaten werden onderworpen aan immunoblotting met antilichamen COXIV en GAPDH. De mitochondriale eiwitten, COXIV, bleek in beide monsters echter GAPDH slechts vaag zichtbaar in de geïsoleerde mitochondria. Het ontbreken van een prominente GAPDH band in the geïsoleerde mitochondria is indicatief voor weinig verontreiniging van niet-mitochondriale bronnen tijdens de isolatie procedure.
Figuur 3:. Representatieve tracing koppeling test met mitochondriën geïsoleerd uit muizen skeletspier 10 mM pyruvaat / 5 mM malaat gekoppelde mitochondriale respiratie assay traces zoals bepaald door multi-well meten van O 2 consumptie. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Mitochondriale eiwit per putje geladen was 2,5 pg. OCR = O 2 verbruik; ADP = adenosinedifosfaat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanide 4 - (trifluormethoxy) fenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A.
| Reagens | Stock Concentratie | | Final Volume | Mass Toegevoegd | |
| (M) | (g / mol) | (ml) | (g) | |
| Tris / HCl, pH 7,4 | 2 | 157,56 | 250 | 78.8 |
| Tris / HCl, pH 7,4 | 1 | 157,56 | 250 | 39,39 |
| KCL | 1 | 74,55 | 500 | 37,28 |
| Tris Base | 1 | 121,14 | 100 | 12.11 |
| EDTA, pH 8 | 0.5 | 416,2 | 100 ml (in 1 M Tris Base) | 20,81 |
| EGTA, pH 7,2 | 0.1 | 380,35 | 100 (in 1 M Tris Base) | 3,801 |
Tabel 1: Voorbereiding van de voorraad Solutions.
| Reagens | Stock Concentratie | Mass Toegevoegd | Final Molarity / Procent |
| (M) | (g of ml) | ||
| Sucrose | - | 11,47 g | 67 mm |
| Tris / HCl, pH 7,4 | 2 | 12,5 ml | 50 mM |
| KCL | 1 | 25 ml | 50 mM |
| EDTA / Tris Base, pH 8 | 0.5 | 10 ml | 10 mM |
| Wezen FA Gratis BSA | - | 1 g | 0,20% |
| pH 7,4, 500 ml: Aliquot 50 ml en vries | |||
Tabel 2: Bereiding van isolatie buffer voor Mitochondria 1 (IBM1).
| Reagens | Stock Concentratie | Mass Toegevoegd | Final Molarity / Procent |
| (M) | (g of ml) | ||
| D-mannitol | - | 10,9 g | 200 mM |
| Sucrose | - | 7,188 g | 70 mM |
| EGTA / Tris Base | 0.1 | 15 ml | 5 mM |
| Tris-HCl, pH 7,4 | 1 | 3 ml | 10 mM |
| pH 7,4, 300 ml: Aliquot 15 ml en vries | |||
Tabel 3: Bereiding van isolatie buffer voor Mitochondria 2 (IBM2).
| Substraat Medium | Eindconcentratie | RCR |
| Pyruvaat / Malate | 10 mM / 5 mM | 16,2 ± 4,6 |
| Succinaat / Rotenon | 10 mM / 2 pM | 10,6 ± 3,8 |
| Palmitoyl L-Carnitine / Malate | 40 uM / 1 mM malaat | 6,7 ± 0,6 |
| Glutamaat / Malate | 10 mM / 10 mM | 8,6 ± 0,4 |
Tabel 4: Respiratory Controle Ratio's voor Gekoppeld Mitochondriale Ademhaling Testen Respiratory controle ratio's zoals bepaald door eerst het meten van O 2 verbruik tarieven met microplaat respirometrische testen, gevolgd door delen maximale gekoppeld ademhaling (ADP gestimuleerde State 3) door de ademhaling als gevolg van proton lek (oligomycin. Een antwoord Staat 4o). De waarden worden uitgedrukt als meeen ± SE. Mitochondriale eiwit per putje geladen was 2,5 ug voor de pyruvaat / malaat en succinaat / rotenone assays, en 3,5 ug van mitochondriale eiwit per putje voor de palmitoyl L-carnitine / malaat en glutamaat / malaat assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierin gepresenteerde werkwijzen een gedetailleerde beschrijving van een mitochondriaal isolatieprocedure van geringe hoeveelheden (~ 75-100 mg) van muizen skeletspieren. Deze isolatie procedure is in staat om hoge functioneren, puur mitochondria (~ 450 ug) opleveren, zoals blijkt uit O 2 consumptie prijzen, RCR waarden, maximale citraat synthase activiteit en eiwit expressie van immunoblotting. Belangrijk is, kan de mitochondriën geïsoleerd uit deze procedure gebruikt voor meerdere assays respirometirc met microplaat O 2 consumptie technologie die voor hoge doorvoer.
De isolatie van de skeletspieren mitochondriën vereist vaak agressieve methoden om de mitochondria te bevrijden uit de omliggende bindweefsel en structurele eiwitten 7,16. Bijgevolg kunnen membranen verstoord raken, waardoor de activiteit (en dus de nauwkeurigheid) van mitochondriale O 2 consumptie afbreuk tijdens volgende respirometrische assays. Door het opnemen van een aanvullende stap weefsel hakken gebruik scheermesjes weefsel na excisie een eerder beschreven protocol 7, een aanzienlijk lagere snelheid rotor motor aangedreven homogeniseren mogelijk was (80 rpm versus 1600 rpm). Deze zachtere homogenisatie en resuspensie technieken leidt tot een hoog percentage van mitochondria met intacte membranen (92,5 ± 2,0%), zoals beoordeeld uit citraat synthase activiteit na de isolatieprocedure. Onze bevindingen komen overeen met Asmann et al. 17, die tussen de 90-95% intact mitochondriaal voorbereidingen rapporteren na isolatie uit menselijke skeletspier. Het is belangrijk op te merken dat het meten citraat synthase activiteit beter geschikt voor het meten van de fysieke integriteit van de membranen en mogen niet worden gebruikt om de functionele integriteit van de geïsoleerde mitochondria beoordelen. Aan de andere kant moet O 2 consumptie assays en bepaling van RCR van deze assays worden toegepast om MEAZorg dat de functie van geïsoleerde mitochondriën 1. Daarnaast kunnen RCR ook worden gebruikt als een indicator van gekoppelde mitochondria. Daarom is de OCR en mitochondriale toestanden in een typisch bereik van de pyruvaat / malaat assay 8 en de hoge RCR waarden verkregen uit diverse respirometrische testen geeft aan dat de mitochondriën ontleend protocol nauw gekoppeld en zeer functioneel.
Isolatie van intact en zuiver mitochondriën heeft belangrijke implicaties voor respirometic assays. De verontreiniging van niet-mitochondriale eiwitten in het uiteindelijke preparaat kan mitochondriale leiden loading ongelijke hoeveelheden mitochondriaal eiwit aan elk putje in O 2 consumptie metingen, waardoor het verminderen van de nauwkeurigheid van elke vergelijking tussen experimenten uitgevoerd met verschillende bereidingen van mitochondria. Bovendien, verontreiniging van de mitochondriale voorbereiding met andere ademende organellen (bijv peroxisomen) can verdere daling van de juistheid van de O 2 consumptie metingen. De aanwezigheid van de binnenste mitochondriale eiwit COXIV en het ontbreken van een prominente band van de cytosolische (en mogelijk kern) eiwit, GAPDH, in ons geïsoleerde mitochondriële preparaat na immunoblotting een indicatie van kleine verontreinigingen uit niet-mitochondriale bronnen tijdens de isolatieprocedure .
Het is belangrijk op te merken dat hoewel de isolatie van een gezuiverd preparaat mitochondriale is van belang voor de bovengenoemde, het behoud van mitochondriale integriteit van het grootste belang ademhaling assays. De buitenste mitochondriale membraan kan gemakkelijk beschadigd worden tijdens de isolatieprocedure, leidt tot het vrijkomen van cytochroom c in de isolatiebuffer en waardoor zij snelheidsbeperking in O 2 consumptie en ATP-synthese 18. Daarom kan de integriteit van geïsoleerde mitochondria verder beoordeeld door het kwantificeren cytochroomec eiwitexpressie in de supernatant van de mitochondriale bereiding (stap 2,15, vóór resuspensie) en in de geïsoleerde mitochondria met Western blotting. Cytochroom c mag niet in het mitochondriaal supernatant preparaat als de membranen intact na de isolatie procedures.
Alle stappen van dit protocol zijn belangrijk, maar er zijn drie cruciale stappen om dit protocol. Ten eerste, het hakken van rode skeletspier drie verschillende scheermesjes (stap 2,4) is kritisch omdat deze stap maakt lagere rotorsnelheden tijdens de homogenisering (stap 2.11). Ten tweede, de prestaties van de vele stappen op ijs of gekoeld buffers is kritisch voor de mitochondria in een rustende toestand te houden vóór de microplaat respirometrische assays. Tenslotte, de zachte resuspensie van de mitochondria pellet in IBM2 van het grootste belang. Voorzichtig mengen onderhoudt mitochondriale integriteit, wat cruciaal is voor nauwkeurige respirometic assays.
Een aantal beperkingen van deze techniek zijn het vermelden waard. Ten eerste, de apparatuur die nodig is (bijv ultracentrifuge, gemotoriseerde homogenisator, etc.) uitvoeren van de isolatie procedure kan duur zijn. Bovendien zijn meerdere methoden voor kwaliteitscontrole worden gelet schoon en intact mitochondria. Echter, zodra de onderzoeker bedreven in de isolatieprocedure, hoge kwaliteit mitochondriën opgeleverd die kan worden gebruikt in een veelheid van metingen, inclusief maar niet beperkt tot: Western blots, enzymatische assays, RT-PCR, PCR, H 2 O 2 assays en high throughput microplate respiratoire metingen. Het is belangrijk op te merken dat deze isolatieprocedure is geoptimaliseerd en aangepast voor kleine hoeveelheden muis skeletspieren en voorzichtigheid is geboden bij het proberen om isolatietechnieken ingang van een bepaald weefsel van dezelfde soort (en zelfs voor hetzelfde weefsel van verschillende species ) naar andere weefsels / species. Voor een optimaal resultaat, het doorzoeken van de literatuur zal de beste optie zijn wanneer het proberen om de beste isolatie methode voor de beoogde weefsel / soorten te vinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
| Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
| Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
References
- Brand, M., Nicholls, D.
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746 (2011).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
- Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
- Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
- Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
