Abstract
बेकार कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया उम्र बढ़ने, मोटापा और टाइप टू मधुमेह के साथ मनाया बदल चयापचय में एक भूमिका निभाते हैं। पृथक माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी से माइटोकॉन्ड्रियल respirometric assays दवाओं और चयापचय को मिलाना है कि प्रोटीन की कार्रवाई की व्यवस्था (एस) के माइटोकॉन्ड्रियल समारोह का आकलन, साथ ही दृढ़ संकल्प के लिए अनुमति देते हैं। वर्तमान अलगाव प्रक्रियाओं अक्सर respirometric assays के लिए आवश्यक उच्च गुणवत्ता माइटोकॉन्ड्रिया उपज के लिए ऊतक की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। इस के साथ साथ प्रस्तुत तरीकों (~ 450 माइक्रोग्राम) उच्च throughput सांस की माप में उपयोग के लिए माउस कंकाल की मांसपेशी की न्यूनतम मात्रा (~ 75-100 मिलीग्राम) से अलग किया जा सकता है कि कैसे उच्च गुणवत्ता शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया का वर्णन है। हम अपने अलगाव विधि spectrophotometrically साइट्रेट synthase गतिविधि को मापने के द्वारा 92.5 ± 2.0% बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया कि पैदावार निर्धारित की। इसके अलावा, अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण cytoso के बेहोश अभिव्यक्ति में हुईएलआईसी प्रोटीन, GAPDH, और mitochondrial प्रोटीन, COXIV के मजबूत अभिव्यक्ति। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में एक प्रमुख GAPDH बैंड के अभाव अलगाव की प्रक्रिया के दौरान गैर-माइटोकॉन्ड्रियल स्रोतों से थोड़ा संदूषण का संकेत है। सबसे महत्वपूर्ण बात, हे 2 खपत सूक्ष्म प्लेट आधारित तकनीक के साथ दर और अत्यधिक युग्मित दिखाता युग्मित respirometric assays के लिए श्वसन नियंत्रण अनुपात (रेसकोर्स रोड) का निर्धारण करने का माप (रेसकोर्स रोड, सब assays के लिए> 6) और कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया। अंत में, एक अलग नख़रेबाज़ कदम के अलावा और काफी पहले से सूचना दी विधि की मोटर चालित homogenization गति को कम करने के लिए उच्च समारोह के साथ साँस लेते हैं कि अत्यधिक युग्मित माइटोकॉन्ड्रिया में यह परिणाम है कि माउस कंकाल की मांसपेशी की छोटी मात्रा से उच्च गुणवत्ता और शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव की अनुमति दी है microplate आधारित respirometirc assays के दौरान।
Protocol
जानवरों के अध्ययन संस्थागत पशु की देखभाल द्वारा एक अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत प्रदर्शन किया और वर्जीनिया पॉलिटेक्निक संस्थान और राज्य विश्वविद्यालय में समिति का उपयोग कर रहे थे।
1. सेटअप (समय: ~ 45 मिनट)
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में माइटोकॉन्ड्रिया (आईबीएम) 1 और IBM2 के लिए 0.25% trypsin, अलगाव बफर का पिघलना जमे हुए दुकानों।
- कांच के बने पदार्थ और उच्च शुद्धता पानी के बाद 70% इथेनॉल में विदारक उपकरणों कुल्ला।
- 4 भागों IBM1 में एक हिस्सा trypsin गिराए द्वारा 0.25% trypsin के स्टॉक से 0.05% trypsin समाधान तैयार करें।
- पेंच टोपी के साथ एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में: (100 अनुपात 1) सेल बफर के साथ प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोध करनेवाला कॉकटेल मिलाएं।
- अशेष 5 मिलीलीटर एक 15 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में 0.05% trypsin के (5 मिलीग्राम / माउस)।
- सेट मोटर 80 आरपीएम के लिए ऊतक homogenizer संचालित।
कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया के 2. अलगाव (टाइम: ~ 90 मिनट)
- सीओ 2 के द्वारा एक माउस euthanize
- निम्न चरणों में वर्णित के रूप में soleus (~ 75-100 मिलीग्राम कुल) भी शामिल है जो क्वाड्रिसेप्स और gastrocnemius मांसपेशियों से लाल पेशी निकालें:
- माउस की ओर त्वचा छील।
- क्वाड्रिसेप्स मूल बिंदु पर वसा पैड निकालें। ठीक इत्तला दे दी कैंची से पटेला से जुड़ा हुआ है कि quadriceps कण्डरा कट।
नोट: क्वाड्रिसेप्स समीपस्थ फीमर के अग्र भाग पर अपनी शारीरिक स्थिति से पहचाना जाता है। - हड्डी से क्वाड्रिसेप्स आजाद कराने के लिए, और्विक धमनी से परहेज करते हुए धीरे-धीरे, हड्डी और quadriceps के बीच कण्डराकला धज्जी। Quadriceps मांसपेशियों को आजाद कराने और ठंडा पीबीएस में quadriceps मांसपेशियों के लिए जगह फीमर पर मूल बिंदु पर ठीक इत्तला दे दी कैंची से कण्डरा कट।
- कैंची से क्वाड्रिसेप्स पर दिखाई दे वसा ऊतकों को हटा दें। इसलिए फीमर overlying गया था कि पेशी के हिस्से यू का सामना करना पड़ रहा है कि अधिक क्वाड्रिसेप्स पलटेंपी। एक फैनिंग गति में संदंश के साथ quadriceps मांसपेशियों खोलें। ठंडा IBM1 के 5 मिलीग्राम से युक्त एक बीकर में ठीक इत्तला दे दी कैंची और जगह के साथ प्रत्येक पालि से दो दिखाई लाल पेशी भागों निकालें।
नोट: quadriceps मांसपेशियों प्रत्येक पालि के पार्श्व किनारे के पास स्थित लाल मांसपेशियों की एक पट्टी के साथ दो पालियों के रूप में दिखाई देते हैं। - ठीक इत्तला दे दी कैंची से स्नायुजाल overlying त्वचा कट और माउस की ओर त्वचा छील। उजागर स्नायुजाल कट और माउस के शरीर के प्रति पेशी छील।
- Gastrocnemius को आजाद कराने और ठंडा पीबीएस में अपने tendons से जुड़ी gastrocnemius जगह के लिए ठीक इत्तला दे दी कैंची से फीमर के पार्श्व और औसत दर्जे का condyles पर कण्डरा कट।
- खत्म gastrocnemius पलटें और soleus मांसपेशी छील और ठंडा IBM1 के 5 मिलीलीटर युक्त बीकर में जगह है। फैन gastrocnemius खुला। ठीक इत्तला दे दी कैंची के साथ तीन दृश्य लाल पेशी भाग (दो पार्श्व और एक औसत दर्जे का सतही लाल स्ट्रिप्स) निकालेंs और ठंडा IBM1 के 5 मिलीलीटर युक्त बीकर को हस्तांतरण।
- (2.2 कदम में वर्णित है) माउस के दूसरे पैर से लाल मांसपेशियों की एक और ~ 75-100 मिलीग्राम निकालें और प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोध करनेवाला कॉकटेल और सेल बफर (50 मिमी Tris एचसीएल, एक के साथ एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जगह मिमी EDTA, 150 मिमी NaCl, 1% सोडियम dodecyl सल्फेट, 0.5% सोडियम deoxycholate, 1% polyoxyethylene (9) nonylphenylether। इसके तत्काल बाद सोख्ता पश्चिमी में बाद में उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में यह दूसरा नमूना फ्लैश फ्रीज branched (कदम 6.1 देखें)।
- एक बड़ी बाल्टी में बर्फ पर एक पूर्व ठंडा, फ्लैट प्लास्टिक सतह रखें। प्लास्टिक सतह पर IBM1 की एक बूंद डालो और IBM1 छोटी बूंद में sectioned लाल पेशी (कदम 2.2.4 और 2.2.7) के सभी जगह चिमटी का उपयोग करें। बदलते छुरा से 3 एकल बढ़त रेज़र ब्लेड हर 40 सेकंड का उपयोग कर 2 मिनट के लिए मांसपेशियों के ऊतकों कीमा।
- वें पर प्लास्टिक की सतह धारण करके ताजा IBM1 के 5 मिलीलीटर के साथ एक नया बीकर कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरणई बीकर और एक रेजर ब्लेड के साथ बीकर में पेशी scraping। इस समाधान को ले लो और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर रखा एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से यह नाली।
- एक नाजुक कार्य वाइपर के साथ ऊतक दाग और फिर 0.05% trypsin समाधान के 5 मिलीलीटर में स्थानांतरित। कार्य वाइपर से ऊतक निकालने के लिए चिमटी का प्रयोग करें।
- 0.05% trypsin समाधान में 30 मिनट के लिए बर्फ पर मांसपेशियों के ऊतकों को सेते हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 200 XG पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब युक्त / trypsin पेशी मिश्रण स्पिन।
- बर्बादी कंटेनर में ट्रिप्सिन सतह पर तैरनेवाला डालो और बर्फ के 3 मिलीलीटर ठंड IBM1 के साथ गोली resuspend। एक 45 मिलीलीटर कांच homogenizer ट्यूब के लिए ऊतक स्थानांतरण। किसी भी शेष नमूना इकट्ठा करने और कांच homogenizer ट्यूब में जोड़ने के लिए एक और 1.5 मिलीलीटर IBM1 के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कुल्ला।
- कांच homogenizer बीकर के भीतर न्यूनतम चाल तो बर्फ के साथ एक बीकर या प्लास्टिक कंटेनर भरा आधे रास्ते में कांच homogenizer ट्यूब रखें।
- एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ऊतक homogenate स्थानांतरण और IBM1 की 6.5 मिलीलीटर के साथ कांच homogenizer ट्यूब कुल्ला। ऊतक homogenate युक्त 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में IBM1 डालो।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 700 ग्राम में 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब स्पिन। धीरे एक गिलास उच्च शक्ति अपकेंद्रित्र ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला डालना और गोली त्यागें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 8000 XG पर ऊपर चरण से सतह पर तैरनेवाला स्पिन।
- IBM1 तैरनेवाला निकालें और धीरे धीरे IBM2 के 500 μl जोड़कर गोली फिर से निलंबित। एक विंदुक टिप के अंत कट और धीरे मिश्रण और गतियों सरगर्मी के साथ IBM2 में गोली homogenize। गोली पूरी तरह से निलंबित कर दिया है के बाद मिश्रण को IBM2 का एक और 4.5 मिलीलीटर जोड़ें।
टी के रूप में बड़ा गोली टुकड़े को तोड़ने, जबकि अत्यधिक विचूर्णन से बचें: नोटउसकी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को नुकसान पहुंचा सकता है। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 8000 XG पर IBM2 / ऊतक homogenate स्पिन।
नोट: यह कदम कुल प्रोटीन सामग्री के लिए योगदान कर सकते हैं अवशिष्ट बीएसए के बाद से चरण 4 में पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के और अधिक सटीक प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए एक साफ उच्च शक्ति अपकेंद्रित्र ट्यूब में दोहराया जा सकता है। - धीरे सतह पर तैरनेवाला और निकालें, लेकिन पूरी तरह से काट अपनी बात के साथ एक विंदुक टिप के साथ IBM2 की दो 25 μl वेतन वृद्धि जोड़कर गोली फिर से निलंबित। धीरे हलचल और IBM2 के 25 μl के बाद इसके अलावा गोली मिश्रण। बर्फ पर इस माइटोकॉन्ड्रियल शेयर रखें।
पूरे ऊतक lysate के 3. Homogenization (टाइम: ~ 45 मिनट; चरण के दौरान किया जा सकता है 7)
- उस कदम को 2.3 से तरल नाइट्रोजन में रखा गया था से पेशी निकालें और पूरी तरह thawed तक कमरे के तापमान पर सेते हैं।
- ठीक इत्तला दे दी कैंची के साथ बर्फ पर ~ 30 सेकंड के लिए ऊतक कीमा।
- Zirco के दो 100 μl scoops जोड़ेंकीमा बनाया हुआ ऊतक होता है कि 3.2 कदम से पेंच टोपी के साथ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब nium ऑक्साइड मोती। 4-6 (मध्यम सेटिंग) की गति सेटिंग में दो 5 से तीन मिनट के चक्र का उपयोग कर एक मनका मिल ऊतक homogenizer में ऊतक homogenize।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर 3.3 कदम से मिश्रण स्पिन। एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में स्पिन और हस्तांतरण के बाद एक 1000 μl विंदुक टिप का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला निकालें। गोली त्यागें और बर्फ पर सतह पर तैरनेवाला जगह है।
4. प्रोटीन निर्धारण (समय: ~ 30 मिनट)
- निर्माता विनिर्देशों के अनुसार बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग कर पूरे ऊतक lysate (3.4 कदम) और माइटोकॉन्ड्रियल शेयर (कदम 2.17) के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें।
5. माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली अखंडता; साइट्रेट synthase (सीएस) गतिविधि (समय: ~ 15 मिनट)
- उच्च शुद्धता पानी में माइटोकॉन्ड्रियल शेयर का 20 dilutions: दो अलग-अलग 1 बनाओ। जोड़नाएक नमूने के ट्राइटन 100-एक्स के 0.1% और एक कम सेटिंग (765 वाट, 2 के आयाम) पर यह sonicate। बर्फ पर अन्य कमजोर पड़ने छोड़ दें। Sonication के बाद बर्फ के लिए नमूना लौटें।
- के साथ एक साइट्रेट synthase परख प्रदर्शन दोनों गैर sonicated और पहले 11,12 वर्णित के रूप में एक spectrophotometric परख का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल dilutions sonicated।
- निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली का प्रतिशत निर्धारित करें:
(गैर-sonicated सीएस गतिविधि ÷ sonicated सीएस गतिविधि) * 100
100- एन (प्रतिशत ऊपर से प्राप्त)
6. माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव गुणवत्ता; पश्चिमी सोख्ता (टाइम: लैब प्रोटोकॉल के अनुसार)
- पहले 12 में वर्णित के रूप में पूरे ऊतक lysate और पृथक माइटोकॉन्ड्रिया पर पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन करते हैं।
नोट: GAPDH के लिए उपयोग प्राथमिक एंटीबॉडी (1: 1,000 कमजोर पड़ने 5 में% बीएसए / टीबीएस-टी) और COXIV (1: 1,000 कमजोर पड़ने में 5% गैर वसादूध / टीबीएस टी क्रमश विरोधी बकरी, और खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी, (1 के बाद): 10,000)।
7. Respirometric परख भागो (टाइम: ~ 90 मिनट)
- पहले से वर्णित के रूप में microplate आधारित ओ 2 की खपत को मापने प्रौद्योगिकी का उपयोग कर वांछित respirometric assays के प्रदर्शन (साथी लेख और रोजर्स को देखने एट अल 8)।
- राज्य 4o (रेसकोर्स रोड) द्वारा राज्य में 3 विभाजित या राज्य 4o द्वारा राज्य 3U विभाजित करके श्वसन नियंत्रण अनुपात (रेसकोर्स रोड) का निर्धारण करते हैं। रेसकोर्स रोड का निर्धारण करते समय बिंदु से बिंदु निशान से मध्यम (औसत) बिंदु, या उच्चतम (राज्य 3) और सबसे कम दरों (राज्य 4o) का उपयोग करें।
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Representative Results
साइट्रेट synthase गतिविधि साइट्रेट synthase बरकरार झिल्ली के साथ माइटोकॉन्ड्रिया के निलंबन में उपस्थित नहीं होना चाहिए, इस प्रकार भीतरी mitochondrial झिल्ली में स्थित है, और के बाद से झिल्ली अखंडता के लिए एक उपाय के रूप में कार्य करता है। 1 sonicated के साथ तुलना में गैर sonicated माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों में साइट्रेट synthase गतिविधि का प्रतिनिधित्व चित्रा एक ही अलगाव से नमूने हैं। साइट्रेट synthase गतिविधि में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि में माइटोकॉन्ड्रिया परिणाम (पी <0.01) sonicating। महत्वपूर्ण बात है, माइटोकॉन्ड्रिया के 92.5 ± 2.0% अलगाव निम्नलिखित बरकरार थे।
चित्रा 2 पृथक माइटोकॉन्ड्रिया और पूरे कंकाल की मांसपेशी ऊतक lysate में GAPDH और COXIV अभिव्यक्ति को दर्शाया गया है। GAPDH cytosol में स्थित एक प्रोटीन है, लेकिन COXIV भीतरी mitochondrial झिल्ली में स्थित एक प्रोटीन है, जबकि इसके अलावा, translocation के बाद नाभिक में पाया जा सकता है। GAPDH और COXIV की अभिव्यक्ति पूरे Tiss में स्पष्ट कर रहे हैंUE lysate। GAPDH के ही बेहोश बैंड स्पष्ट कर रहे हैं, जबकि पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में, COXIV की अभिव्यक्ति, मनाया जाता है। इन निष्कर्षों को अलगाव की प्रक्रिया के दौरान गैर-माइटोकॉन्ड्रियल घटकों से थोड़ा संदूषण के साथ अच्छा माइटोकॉन्ड्रियल विलगन, संकेत मिलता है।
चित्रा 3 इस प्रोटोकॉल का उपयोग अलग-थलग और microplate आधारित ओ 2 खपत प्रौद्योगिकी के साथ प्रदर्शन किया माइटोकॉन्ड्रिया से प्रदर्शन एक युग्मन परख के लिए ओ 2 खपत की दर (ओसीआर) बनाम समय (10 मिमी पाइरूवेट / 5 मिमी Malate) के एक प्रतिनिधि ट्रेसिंग है। प्रत्येक पैनल हे मौका और विलियम्स 13 से वर्णित के रूप में अलग अलग माइटोकॉन्ड्रियल राज्यों में 2 की खपत का प्रतिनिधित्व करता है। पहली पैनल, ADP के इंजेक्शन के बाद बेसल ओ 2 की खपत, या राज्य 2. दूसरे पैनल का प्रतिनिधित्व करता है एक oligomycin के इंजेक्शन (परिसर वी के एक अवरोध), represe के बाद, अधिक से अधिक युग्मित श्वसन, या राज्य 3. तीसरा पैनल का प्रतिनिधित्व करता हैप्रोटॉन रिसाव, या राज्य 4o के कारण एनटीएस श्वसन। चौथे पैनल, FCCP के इंजेक्शन के बाद, अधिक से अधिक uncoupled श्वसन, या राज्य 3U प्रतिनिधित्व करता है। अंत में, पांचवें पैनल, Antimycin ए के इंजेक्शन के बाद, ऑक्सीडेटिव श्वसन के निषेध का प्रतिनिधित्व करता है। श्वसन नियंत्रण अनुपात (रेसकोर्स रोड), mitochondrial समारोह 1 का एक उपाय है, इस प्रोटोकॉल से माइटोकॉन्ड्रिया उपज से किया जा सकता है कि वैकल्पिक सब्सट्रेट युग्मन assays के लिए 4 रिपोर्टों राज्य 4o। टेबल द्वारा औसत रेसकोर्स रोड मूल्यों राज्य 3 विभाजित करके गणना की गई। महत्वपूर्ण बात है, हे 2 खपत ट्रेसिंग और उच्च रेसकोर्स रोड मूल्यों अत्यधिक कार्य और युग्मित माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस के साथ साथ सूचना रेसकोर्स रोड मूल्यों पहले इस प्रकार इस प्रक्रिया के दौरान अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया की उच्च गुणवत्ता accentuating, murine कंकाल की मांसपेशी 7,14,15 में इसी प्रकार के अलगाव प्रोटोकॉल का उपयोग सूचना से अधिक या इसी तरह के हैं।
चित्रा 1: साइट्रेट synthase गतिविधि। गैर sonicated और sonicated माइटोकॉन्ड्रिया preps में spectrophotometrically निर्धारित रूप में साइट्रेट synthase एंजाइम की गतिविधि। मूल्यों ± SEM के मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। ** पी <0.01। डेटा एन = 3 जैविक प्रतिकृति बनती है और प्रोटीन के एमजी के सापेक्ष व्यक्त प्रतिनिधित्व करता है। 
चित्रा 2:। साइटोसोलिक और पृथक माइटोकॉन्ड्रिया और पूरे ऊतक lysate में माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन अभिव्यक्ति पृथक माइटोकॉन्ड्रिया और पूरे ऊतक lysates दोनों COXIV और GAPDH एंटीबॉडी के साथ immunoblotted थे। माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन, COXIV, तथापि GAPDH केवल थोड़े बल स्पष्ट पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में था, दोनों के नमूनों में स्पष्ट किया गया था। वें में एक प्रमुख GAPDH बैंड के अभावई पृथक माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव की प्रक्रिया के दौरान गैर-माइटोकॉन्ड्रियल स्रोतों से थोड़ा संदूषण का संकेत है।
चित्रा 3:। माउस कंकाल की मांसपेशी से अलग माइटोकॉन्ड्रिया के साथ युग्मन परख के प्रतिनिधि ट्रेसिंग 10 मिमी पाइरूवेट / 5 मिमी Malate हे 2 खपत की बहु अच्छी तरह से माप द्वारा निर्धारित रूप में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन परख ट्रेसिंग युग्मित। मूल्यों मतलब ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। अच्छी तरह से प्रति लोड माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन 2.5 ग्राम था। ओसीआर हे 2 खपत की दर =; ADP = Adenosine Diphosphate; Oligo = Oligomycin एक; FCCP = कार्बोनिल cyanide- 4 - (trifluoromethoxy) phenylhydrazone; विरोधी एक = Antimycin ए
| अभिकर्मक | शेयर एकाग्रता | | अंतिम वॉल्यूम | मास जोड़ा गया | |
| (एम) | (छ / मोल) | (एमएल) | (छ) | |
| Tris / एचसीएल, पीएच 7.4 | 2 | 157.56 | 250 | 78.8 |
| Tris / एचसीएल, पीएच 7.4 | 1 | 157.56 | 250 | 39.39 |
| KCL | 1 | 74.55 | 500 | 37.28 |
| Tris बेस | 1 | 121.14 | 100 | 12.11 |
| EDTA, पीएच 8 | 0.5 | 416.2 | 100 मिलीलीटर (1 एम Tris बेस में) | 20.81 |
| EGTA, पीएच 7.2 | 0.1 | 380.35 | 100 (1 एम Tris बेस में) | 3.801 |
तालिका 1: स्टॉक समाधान की तैयारी।
| अभिकर्मक | शेयर एकाग्रता | मास जोड़ा गया | अंतिम molarity / प्रतिशत |
| (एम) | (छ या एमएल) | ||
| सुक्रोज | - | 11.47 छ | 67 मिमी |
| Tris / एचसीएल, पीएच 7.4 | 2 | 12.5 मिलीलीटर | 50 मिमी |
| KCL | 1 | 25 मिलीलीटर | 50 मिमी |
| EDTA / Tris बेस, पीएच 8 | 0.5 | 10 मिलीलीटर | 10 मिमी |
| मूलतः एफए फ्री बीएसए | - | 1 ग्राम | 0.20% |
| पीएच 7.4, 500 मिलीलीटर: अशेष 50 मिलीग्राम और फ्रीज | |||
तालिका 2: माइटोकॉन्ड्रिया 1 के लिए अलगाव बफर (IBM1) की तैयारी।
| अभिकर्मक | शेयर एकाग्रता | मास जोड़ा गया | अंतिम molarity / प्रतिशत |
| (एम) | (छ या एमएल) | ||
| डी-Mannitol | - | 10.9 ग्राम | 200 मिमी |
| सुक्रोज | - | 7.188 ग्राम | 70 मिमी |
| EGTA / Tris बेस | 0.1 | 15 मिलीलीटर | 5 मिमी |
| Tris- एचसीएल, पीएच 7.4 | 1 | 3 मिलीग्राम | 10 मिमी |
| पीएच 7.4, 300 मिलीलीटर: अशेष 15 मिलीग्राम और फ्रीज | |||
तालिका 3: माइटोकॉन्ड्रिया 2 के लिए अलगाव बफर (IBM2) की तैयारी।
| सब्सट्रेट मझौले | अंतिम एकाग्रता | रेसकोर्स रोड |
| पाइरूवेट / Malate | 10 मिमी / 5 मिमी | 16.2 ± 4.6 |
| Succinate / Rotenone | 10 मिमी / 2 माइक्रोन | 10.6 ± 3.8 |
| Palmitoyl एल Carnitine / Malate | 40 माइक्रोन / 1 मिमी Malate | 6.7 ± 0.6 |
| ग्लूटामेट / Malate | 10 मिमी / 10 मिमी | 8.6 ± 0.4 |
सारणी 4:। पहले अधिक से अधिक युग्मित श्वसन विभाजित करके पीछा microplate आधारित respirometric assays के साथ ओ 2 खपत की दर को मापने के द्वारा निर्धारित रूप में युग्मित mitochondrial श्वसन Assays श्वसन नियंत्रण अनुपात के लिए श्वसन नियंत्रण अनुपात श्वसन द्वारा कारण प्रोटॉन रिसाव के लिए (ADP प्रेरित राज्य 3) (Oligomycin एक प्रतिक्रिया राज्य 4o)। मूल्यों मुझे के रूप में व्यक्त कर रहे हैंएक ± एसई। अच्छी तरह से प्रति लोड माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन palmitoyl एल carnitine / Malate और ग्लूटामेट / Malate assays के लिए अच्छी तरह से प्रति माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की पाइरूवेट / Malate और succinate / rotenone assays के लिए 2.5 माइक्रोग्राम, और 3.5 माइक्रोग्राम था।
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Discussion
इस के साथ साथ प्रस्तुत तरीकों माउस कंकाल की मांसपेशी की न्यूनतम मात्रा (~ 75-100 मिलीग्राम) से एक माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव की प्रक्रिया का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं। इस अलगाव की प्रक्रिया के ओ 2 खपत की दर, रेसकोर्स रोड मूल्यों, अधिक से अधिक साइट्रेट synthase गतिविधि और immunoblotting से प्रोटीन अभिव्यक्ति के सबूत के रूप में उच्च कामकाज, शुद्ध माइटोकांड्रिया (~ 450 माइक्रोग्राम) उपज के लिए सक्षम है। महत्वपूर्ण बात, इस प्रक्रिया से अलग माइटोकॉन्ड्रिया उच्च प्रवाह के लिए अनुमति देता है कि microplate आधारित ओ 2 खपत प्रौद्योगिकी के साथ कई respirometirc assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव अक्सर संयोजी ऊतक और संरचनात्मक प्रोटीन 7,16 आसपास से माइटोकॉन्ड्रिया आजाद कराने के लिए कठोर तरीकों की आवश्यकता है। नतीजतन, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली इस प्रकार बाद में respirome दौरान माइटोकॉन्ड्रियल हे 2 खपत की गतिविधि (और इस प्रकार शुद्धता) आई, बाधित हो सकता हैtric assays। एक पहले से वर्णित प्रोटोकॉल 7 के लिए ऊतक छांटना के बाद रेज़र ब्लेड का उपयोग कर नख़रेबाज़ ऊतक का एक अतिरिक्त कदम शामिल करके, मोटर चालित homogenization के लिए एक काफी कम रोटर गति (80 आरपीएम बनाम 1,600 आरपीएम) संभव हो गया था। अलगाव की प्रक्रिया के बाद साइट्रेट synthase गतिविधि से मूल्यांकन के रूप में ये विनम्र homogenization और मेजबान तकनीक बरकरार झिल्ली (92.5 ± 2.0%) के साथ माइटोकॉन्ड्रिया के एक उच्च प्रतिशत हो जाती है। हमारा निष्कर्ष Asmann एट अल। 17, मानव कंकाल की मांसपेशी से अलगाव के बाद 90-95% बरकरार माइटोकॉन्ड्रियल की तैयारियों के बीच जो रिपोर्ट के साथ संगत कर रहे हैं। यह साइट्रेट synthase गतिविधि को मापने के माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की शारीरिक अखंडता को मापने के लिए बेहतर अनुकूल है और अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया के कार्यात्मक अखंडता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है। दूसरी ओर, इन assays से ओ 2 खपत assays और रेसकोर्स रोड के निर्धारण के संबंध में विदेश मंत्रालय के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएपृथक माइटोकॉन्ड्रिया 1 के समारोह में सुनिश्चित करें। इसके अलावा, रेसकोर्स रोड भी युग्मित माइटोकॉन्ड्रिया का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, पाइरूवेट / Malate परख 8, और respirometric assays की एक किस्म से प्राप्त उच्च रेसकोर्स रोड मूल्यों से एक ठेठ सीमा के भीतर ओसीआर और माइटोकॉन्ड्रियल अमेरिका इस प्रोटोकॉल से निकाली गई माइटोकॉन्ड्रिया कसकर युग्मित और अत्यधिक कार्य कर रहे हैं कि इंगित करता है।
बरकरार है और शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव respirometic assays के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। अंतिम माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी में गैर-माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के प्रदूषण को इस प्रकार माइटोकॉन्ड्रिया के विभिन्न तैयारियों का उपयोग कर प्रयोगों के बीच कोई तुलना की सटीकता प्रदर्शन कम है, अच्छी तरह से ओ 2 खपत माप के दौरान प्रत्येक के लिए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के असमान मात्रा में लोड करने में परिणाम कर सकते हैं। इसके अलावा, अन्य respiring अंगों के साथ माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी के प्रदूषण (जैसे, peroxisomes) सीएएन आगे हे 2 खपत माप की सटीकता में कमी। भीतरी mitochondrial प्रोटीन, COXIV, और हमारे पृथक माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी निम्नलिखित immunoblotting में साइटोसोलिक (और संभावित परमाणु) प्रोटीन, GAPDH, के एक प्रमुख बैंड के अभाव की उपस्थिति अलगाव की प्रक्रिया के दौरान गैर-माइटोकॉन्ड्रियल स्रोतों से थोड़ा संदूषण का संकेत है ।
यह एक शुद्ध माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी के अलगाव उपर्युक्त के संबंध में महत्वपूर्ण है, हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता के रखरखाव श्वसन assays में अत्यंत महत्व का है कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है। बाहरी mitochondrial झिल्ली आसानी से अलगाव बफर में साइटोक्रोम ग के भागने के लिए अग्रणी है और इस तरह के ओ 2 की खपत और एटीपी संश्लेषण 18 के दौरान सीमित दर बनने अलगाव की प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त हो सकता है। इसलिए, अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया की अखंडता को आगे cytochrom बढ़ाता द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता(पहले मेजबान के लिए कदम 2.15) और पश्चिमी सोख्ता साथ पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी की सतह पर तैरनेवाला में चुनाव आयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली अलगाव प्रक्रियाओं का पालन बरकरार हैं, तो साइटोक्रोम ग माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी सतह पर तैरनेवाला में उपस्थित नहीं होना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल के सभी चरणों हालांकि इस प्रोटोकॉल के लिए तीन महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं, महत्वपूर्ण हैं। इस कदम के homogenization के कदम (कदम 2.11) के दौरान धीमी रोटर गति के लिए अनुमति देता है, क्योंकि सबसे पहले, तीन अलग अलग रेज़र ब्लेड (2.4 कदम) के साथ लाल कंकाल की मांसपेशी के नख़रेबाज़ महत्वपूर्ण है। दूसरा, बर्फ पर या ठंडा buffers में कई कदम के प्रदर्शन से पहले microplate आधारित respirometric assays के लिए एक आराम की स्थिति में माइटोकॉन्ड्रिया बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। अंत में, IBM2 में माइटोकॉन्ड्रिया गोली की कोमल मेजबान अत्यंत महत्व का है। सौम्य मिश्रण सटीक resp के लिए महत्वपूर्ण है जो माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता का कहना है,irometic assays।
इस तकनीक की कुछ सीमाओं में उल्लेख के लायक हैं। सबसे पहले, उपकरण की जरूरत है (जैसे, ultracentrifuge, मोटर चालित homogenizer, आदि) के प्रदर्शन करने के लिए अलगाव की प्रक्रिया महंगा हो सकता है। इसके अलावा, कई गुणवत्ता नियंत्रण के तरीकों स्वच्छ और बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं। पश्चिमी blots, एंजाइमी assays, आरटी पीसीआर, पीसीआर, एच 2 ओ 2 assays: शोधकर्ता अलगाव की प्रक्रिया में कुशल है हालांकि, एक बार, उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रिया कि सहित माप की एक भीड़ में इस्तेमाल किया है, लेकिन सीमित नहीं किया जा सकता झुकेंगे रहे हैं , और उच्च throughput microplate सांस की माप। यह इस अलगाव की प्रक्रिया अनुकूलित और एक ही प्रजाति से एक दिया ऊतक से अलगाव तकनीकों को लागू करने की कोशिश कर किया जाना चाहिए जब माउस कंकाल की मांसपेशी और सावधानी की छोटी मात्रा के लिए संशोधित किया गया है कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है (और यहां तक कि विभिन्न प्रजातियों में से एक ही ऊतक को ) अन्य ऊतकों को / विशिष्टतों। इरादा ऊतक / प्रजातियों के लिए सबसे अच्छा अलगाव विधि खोजने की कोशिश कर जब इष्टतम परिणामों के लिए, साहित्य खोज सबसे अच्छा विकल्प होगा।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
| Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
| Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
References
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