Abstract
機能不全骨格筋ミトコンドリアは、加齢、肥満およびII型糖尿病で観察し、変化した代謝の役割を果たしています。分離されたミトコンドリア調製物からのミトコンドリア呼吸アッセイは、薬物や代謝を調節するタンパク質の作用メカニズム（複数可）のミトコンドリア機能の評価だけでなく、決意を可能にします。現在の単離方法は、多くの場合、呼吸アッセイに必要な高品質のミトコンドリアを得るために組織を大量に必要とします。本明細書に提示される方法は、（〜450μgの）は、高スループットの呼吸測定に使用するために、マウスの骨格筋の最小量（〜75-100ミリグラム）から単離することができる方法を高品質精製ミトコンドリア説明します。私たちは、分離法は、分光光度法、クエン酸合成酵素活性を測定することにより、92.5±2.0％、完全なミトコンドリアをもたらすことを決定しました。また、単離ミトコンドリアにおけるウェスタンブロット分析は、cytosoのかすかな発現をもたらしましたLICタンパク質、GAPDH、およびミトコンドリアタンパク質、COXIVの強い発現。単離されたミトコンドリアにおいて顕著GAPDHのバンドが存在しないことは、単離手順の間の非ミトコンドリア源からの少量の汚染の指標です。最も重要なのは、O 2消費率の測定マイクロプレートベースの技術とし、結合された呼吸アッセイのための呼吸調節比（RCR）を決定するには、高度（RCRを、全てのアッセイのための> 6）に接続ショーや機能ミトコンドリア。結論として、独立したミンチ工程の追加とはかなり以前に報告された方法のモーター駆動均質化速度を低下させることにより、高機能と呼吸性の高い結合されたミトコンドリアになり、マウス骨格筋の少ない量から高品質、精製されたミトコンドリアの単離を可能にしましたマイクロプレートベースrespirometircアッセイ中に。
Protocol
動物実験は、動物実験によって承認されたプロトコルの下で行われ、バージニア工科大学で委員会を使用しました。
1.セットアップ（時間：〜45分）
- 37℃の水浴中で0.25％トリプシン、単離ミトコンドリアのバッファ（IBM）1 IBM2の凍結貯蔵を解凍。
- ガラス製品をすすぎ、高純度水に続いて70％エタノール中で楽器を解剖。
- 4部IBM1で1部のトリプシンを希釈することにより、0.25％のトリプシンの株式0.05％トリプシン溶液を準備します。
- スクリューキャップ1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内：（100比1）細胞溶解バッファーでプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを混ぜます。
- アリコートを5 mlの15 mlのプラスチックチューブに、0.05％トリプシン（5ミリリットル/マウス）。
- 80 RPMにモータ駆動の組織ホモジナイザーを設定します。
骨格筋ミトコンドリアの2分離（時間：〜90分）
- CO 2でマウスを安楽死させます
- 大腿四頭筋と腓腹筋から赤筋を削除するには、以下の手順で説明するようにヒラメ（〜75-100 mgの合計）が含まれています：
- マウスの方の皮膚の皮をむきます。
- 大腿四頭筋原点の上に脂肪パッドを取り外します。細かい傾いてハサミで膝蓋骨に接続されている四頭筋腱をカットします。
注意：大腿四頭筋は、大腿骨近位部の前方部分に、その解剖学的位置によって識別されます。 - 骨から大腿四頭筋を解放するために、大腿動脈を回避しながらゆっくりと、骨と大腿四頭筋腱膜の間を切り取ります。大腿四頭筋を解放し、冷PBSで大腿四頭筋を配置するために、大腿骨上の原点で細かい傾いてハサミで腱をカットします。
- ハサミで大腿四頭の上に目に見える脂肪組織を削除します。大腿骨の上に位置された筋肉の部分はUを向くように上で大腿四頭筋をフリップP。ファニングの運動でピンセットで大腿四頭筋を開きます。チルドIBM1の5ミリリットルを含むビーカー中に微細な先端ハサミと場所で各葉から2可視赤色筋肉部分を削除します。
注意：大腿四頭筋は、各葉の側縁付近に位置する赤筋のストリップで2つのローブとして表示されます。 - 細かい先端に付いたハサミでアキレス腱を覆う皮膚を切り、マウスに向かって皮をはがし。露出したアキレス腱を切って、マウスの体内に向けて筋肉を剥離。
- 腓腹筋を解放し、冷却PBS中の腱に取り付けた腓腹筋を配置するために、微細な先端ハサミで大腿骨の外側顆および内側顆で腱をカットします。
- 以上の腓腹筋を裏返し、ヒラメ筋を剥離し、冷却IBM1の5ミリリットルを入れたビーカーに入れます。ファンは腓腹筋を開きます。細かい傾いてはさみで3種類の視覚的な赤い筋肉部（二つの側方および1内側表面的な赤のストリップ）を削除しますSとは、冷却IBM1の5ミリリットルを含むビーカーに転送します。
- マウスの他の脚部から赤筋の別〜75-100 mgの削除（ステップ2.2）およびプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルおよび細胞溶解緩衝液を用いて1.5 mlのマイクロ遠心チューブに入れる（50mMのTris-HCL、1 mMのEDTA、150mMのNaCl、1％ドデシル硫酸ナトリウム、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1％ポリオキシエチレン（9）ノニルフェニルエーテルは、直ちにウェスタンブロッティングにおける後の使用のために液体窒素中でこの第二のサンプルをフラッシュ凍結分岐（ステップ6.1参照）。
- 大きなバケツに氷上で予冷し、平らなプラスチック表面を置きます。プラスチック表面上にIBM1の低下を注ぎ、IBM1滴に区分赤筋（ステップ2.2.4および2.2.7）のすべてを配置するためにピンセットを使用しています。カミソリごとに40秒を変更することにより、3つのシングルエッジかみそりの刃を使用して、2分間の筋肉組織をミンチ。
- 目の上にプラスチック表面を保持することによって、新鮮なIBM1 5mlで新しいビーカーに刻んだ組織を転送Eビーカーやかみそりの刃でビーカーに筋肉をこします。このソリューションを取り、50mlコニカルチューブ上に配置さ100μmのセルストレーナーを介して排出します。
- 繊細な作業ワイパーで組織をブロットした後、0.05％トリプシン溶液5mlにそれを転送します。タスクワイパーから組織を除去するためにピンセットを使用してください。
- 0.05％トリプシン溶液中で30分間氷上で筋肉組織をインキュベートします。
- 4℃で3分間200×gで15ミリリットルコニカルチューブ含むトリプシン/筋肉の混合物をスピン。
- 廃棄物容器にトリプシン上清を注ぎ、氷冷IBM1 3mlでペレットを再懸濁。 45ミリリットルのガラスホモジナイザーチューブに組織を移します。残りのサンプルを収集し、ガラスホモジナイザーチューブにこれを追加するために、別の1.5ミリリットルIBM1で15ミリリットルにコニカルチューブを洗浄します。
- ガラスホモジナイザーをビーカー内で最小限に移動して、氷を入れたビーカーやプラスチック容器満たし途中にガラスホモジナイザーチューブを置きます。
- 新しい15ミリリットルコニカルチューブに組織ホモジネートを移し、IBM1 6.5 mlのガラスホモジナイザーチューブをすすいでください。組織ホモジネートを含む15ミリリットルコニカルチューブにIBM1を注ぎます。
- 4℃で10分間700グラムで15ミリリットルコニカルチューブをスピン。静かにガラスの高強度遠心管に上清を注ぐし、ペレットを廃棄します。
- 4℃で10分間8000×gで、上記のステップからの上清をスピン。
- IBM1の上清を除去し、ゆっくりIBM2500μlのを追加することにより、ペレットを再懸濁。ピペットチップの先端をカットし、軽く運動を混合し、攪拌しながらIBM2でペレットを均質化します。ペレットが完全に中断された後、混合物にIBM2の別の4.5ミリリットルを追加します。
注：tと大きなペレット片を破壊しながら、過度の摩砕を避けます彼は、ミトコンドリア膜を損傷することがあります。 - 4℃で10分間8000×gでIBM2 /組織ホモジネートをスピン。
注：残留BSAは、総タンパク質含有量に寄与することができるので、このステップは、ステップ4において、単離されたミトコンドリアのより正確なタンパク質定量のためのクリーンな高強度遠心管中で繰り返してもよいです。 - 上清を除去し、静かに、しかし完全に遮断、その点にピペットチップでIBM2の225μlの増分を追加することにより、ペレットを再懸濁。ゆっくりIBM225μlのそれぞれの添加後にペレットを攪拌、混合します。氷の上でこのミトコンドリアの在庫を置きます。
全組織溶解物の3均質化（時間：〜45分は、ステップ7の間に行うことができます）
- それがステップ2.3から液体窒素の中に入れたから筋肉を外し、完全に解凍するまで室温でインキュベートします。
- 細かい傾いてハサミで氷上で〜30秒のための組織をみじん切り。
- ジルコ二100μlのスクープを追加みじん切りの組織が含まれているステップ3.2からのスクリューキャップ1.5 mlのマイクロ遠心チューブにニウム酸化物ビーズ。 4-6（メディア設定）の速度設定で2 5 3分のサイクルを使用して、ビーズミル組織ホモジナイザー中で組織をホモジナイズします。
- 4℃で10分間12,000×gでステップ3.3からの混合物をスピン。スピンした後、千μlのピペットチップを使用して上清を除去し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移します。ペレットを捨て、氷の上に上清を配置します。
4.タンパク質の決意（時間：〜30分）
- 製造業者の仕様に従って、BCAタンパク質アッセイキットを使用して、全組織溶解液（ステップ3.4）とミトコンドリアの株式（ステップ2.17）のタンパク質濃度を決定します。
5.ミトコンドリア膜の完全性、クエン酸シンターゼ（CS）活動（時間：〜15分）
- 高純度水におけるミトコンドリアの株式の20希釈液：二つの別々の1を作ります。追加一つのサンプルにトリトン100-Xの0.1％と低く設定（765ワット、2の振幅）でそれを超音波処理します。氷の上の他の希釈のままにしておきます。超音波処理した後、氷にサンプルを返します。
- でクエン酸シンターゼアッセイを行う両方の非超音波処理し、以前に記載されているように11,12を分光光度アッセイを用いてミトコンドリアの希釈液を超音波処理しました。
- 以下の式を用いて、無傷のミトコンドリア膜の割合を決定します。
（超音波処理CS活性÷非超音波処理CS活性）* 100
100- N（上から達成パーセント）
6.ミトコンドリアの分離品質。ウェスタンブロッティング（時間：ラボプロトコルによります）
- 以前に説明したように12全組織溶解物および単離ミトコンドリアにウェスタンブロッティングを行います。
注意：GAPDHのための使用の一次抗体を（1：1,000希釈5％のBSA / TBS-T）とCOXIV（1：1,000希釈の5％無脂肪ミルク/ TBS-T）（1それぞれ、抗ヤギ、ウサギ二次抗体が続く：10,000）。
7.呼吸アッセイを実行します（時間：〜90分）
- 前述したように、マイクロプレートベースのO 2消費の測定技術を用いて所望の呼吸アッセイを実行します（関連記事やロジャースを参照ら8）。
- ステート40（RCR）によって状態3を分割または州40によって状態の3Uを分割することにより、呼吸制御比（RCR）を決定します。 RCRを決定する際に、ポイントツーポイントトレースからミドル（平均）点、または最高の（状態3）および最低宿泊料金（状態40）のいずれかを使用してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
クエン酸シンターゼはミトコンドリア内膜に位置しており、したがって、無傷の膜を有するミトコンドリアの懸濁物に存在してはならないので、クエン酸合成酵素活性は、膜の完全性のための尺度として役立つ。 図1を超音波処理と比較して、非超音波処理し、ミトコンドリア試料中のクエン酸合成酵素活性を示し、同じ分離からのサンプル。クエン酸シンターゼ活性（P <0.01）の統計的に有意な増加でミトコンドリアの結果を超音波処理。重要なことは、ミトコンドリアの92.5±2.0％は、単離後無傷でした。
図2は、単離されたミトコンドリアおよび全体骨格筋組織溶解物中のGAPDHおよびCOXIV発現を示します。 GAPDHは、細胞質ゾルに位置するタンパク質であるが、COXIVはミトコンドリア内膜に存在するタンパク質でありながらも、転座の後に核内に見つけることができます。 GAPDHおよびCOXIVの発現は、全体TISSで明らかですUE溶解液。 GAPDHの唯一のかすかなバンドが明らかであるが、単離されたミトコンドリアにおいて、COXIVの発現が観察されます。これらの知見は、単離手順の間に非ミトコンドリアのコンポーネントから少し汚染に、良いミトコンドリアの単離を示します。
図3は、このプロトコルを用いて単離し、マイクロプレートベースのO 2消費技術を用いて行うミトコンドリアから行っ結合アッセイのために、O 2消費率（OCR）対時間（10mMのピルビン酸/ 5mMのリンゴ酸）の代表的なトレースです。チャンスとウィリアムズ13で説明したように、各パネルは異なるミトコンドリアの状態でのO 2消費を表しています。最初のパネルはreprese、オリゴマイシンA（複合体Vの阻害剤）を注入した後、第三のパネルを第二パネルは、ADPの注入後、最大の結合された呼吸を表す基礎O 2消費 、または状態2を表し、またはステート3プロトンリーク、または状態40に起因するNTSの呼吸。第四のパネルが、FCCPの注入後、最大の脱共役呼吸、または状態3Uを表します。最後に、第五のパネルは、アンチマイシンAの注入後に、酸化性呼吸の阻害を表します。呼吸制御比（RCR）、ミトコンドリア機能1の尺度は、国家40によって状態3を割ることによって計算した。 表4は 、このプロトコルからミトコンドリア収量から実行することができる別の基板結合アッセイの平均RCR値を報告します。重要なことは、O 2消費のトレースと高いRCR値は非常に機能しており、接続されたミトコンドリアを表します。本明細書で報告RCR値は、以前にこのように、この手順の間に分離されたミトコンドリアの高品質を強調し、マウス骨格筋7,14,15に類似したアイソレーション・プロトコルを使用して報告よりも高いまたは類似しています。
図1：クエン酸シンターゼ活性。クエン酸シンターゼ酵素活性非超音波処理し、超音波処理し、ミトコンドリアプレップで分光光度法で測定します。値は平均±SEMとして表されます。 ** P <0.01。データは、n = 3が生物学的複製をペアにし、タンパク質のmgの相対を表明表します。 
図2：細胞質ゾル及び単離ミトコンドリアと全組織溶解物中のミトコンドリアのタンパク質の発現単離ミトコンドリア、全組織溶解物の両方がCOXIVおよびGAPDH抗体を用いてイムノブロットしました。ミトコンドリアタンパク質、COXIVは、両方のサンプルで明らかであった、しかし、GAPDHは、単離されたミトコンドリアにのみかすかに明らかでした。目の著名なGAPDHバンドの不在E単離ミトコンドリア、単離手順の間の非ミトコンドリア源からの少量の汚染の指標です。
図3：マウス骨格筋から単離したミトコンドリアとの結合アッセイの代表的なトレースの10mMピルビン酸/ 5mMのリンゴO 2消費のマルチウェル測定によるミトコンドリア呼吸アッセイトレーシングを結合さ。値は平均±SDとして表されます。ウェル当たりロードミトコンドリアタンパク質は、2.5μgのでした。 OCRは、O 2消費率を=。 ADP =アデノシン二リン酸;オリゴ=オリゴマイシンA; FCCP =カルボニルシアン化物4 - （トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン;アンチA =アンチマイシンAの
| 試薬 | ストック濃度 | | 最終容積 | 大量追加 | |
| （M） | （グラム/モル） | （ミリリットル） | （G） | |
| トリス/塩酸、pH7.4の | 2 | 157.56 | 250 | 78.8 |
| トリス/塩酸、pH7.4の | 1 | 157.56 | 250 | 39.39 |
| KCL | 1 | 74.55 | 500 | 37.28 |
| トリス塩基 | 1 | 121.14 | 100 | 12.11 |
| EDTA、pHが8 | 0.5 | 416.2 | 100ミリリットル（1 Mトリス塩基で） | 20.81 |
| EGTA、pHは7.2 | 0.1 | 380.35 | 100（1 Mトリス塩基で） | 3.801 |
表1：ストック溶液の調製。
| 試薬 | ストック濃度 | 大量追加 | 最終モル濃度/パーセント |
| （M） | （グラムまたはミリリットル） | ||
| スクロース | - | 11.47グラム | 67 mMの |
| トリス/のHCl、pHは7.4 | 2 | 12.5ミリリットル | 50 mMの |
| KCL | 1 | 25ミリリットル | 50 mMの |
| EDTA /トリス塩基、pHが8 | 0.5 | 10ミリリットル | 10 mMの |
| 基本的にFAフリーBSA | - | 1グラム | 0.20％ |
| pHは7.4、500ミリリットル：小分けし50ミリリットル、凍結 | |||
表2：ミトコンドリア1用アイソレーションバッファ（IBM1）の調製。
| 試薬 | ストック濃度 | 大量追加 | 最終モル濃度/パーセント |
| （M） | （グラムまたはミリリットル） | ||
| D-マンニトール | - | 10.9グラム | 200 mMの |
| スクロース | - | 7.188グラム | 70 mMの |
| EGTA /トリス塩基 | 0.1 | 15ミリリットル | 5 mMの |
| トリス-HCl、pH7.4の | 1 | 3ミリリットル | 10 mMの |
| pHは7.4、300ミリリットル：小分けし15ミリリットル、凍結 | |||
表3：ミトコンドリア2用アイソレーションバッファ（IBM2）の調製。
| 基質中 | 最終濃度 | RCR |
| ピルビン酸/マラテ | 10 MM / 5 mMの | 16.2±4.6 |
| コハク酸/ロテノン | 10 MM / 2μM | 10.6±3.8 |
| パルミトイルL-カルニチン/マラテ | 40μM/ 1 mMのマラテ | 6.7±0.6 |
| グルタミン酸/マラテ | 10 MM / 10mMの | 8.6±0.4 |
表4：結合ミトコンドリア呼吸アッセイのための呼吸調節比によるプロトンリークに呼吸によって最大結合された呼吸（ADP刺激状態3）を分割し、その後最初のマイクロプレートベースの呼吸アッセイとO 2消費率を測定することにより決定されるような呼吸コントロール比、（オリゴマイシン。応答状態40）。値は、私のように表現されています±SE。ウェル当たりロードミトコンドリアタンパク質はパルミトイルL-カルニチン/リンゴ酸およびグルタミン酸/リンゴ酸アッセイ用のウェルあたりのミトコンドリアタンパク質のピルビン酸/リンゴ酸およびコハク酸/ロテノンアッセイのために2.5μgの、および3.5μgのでした。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本明細書に提示する方法は、マウス骨格筋の最小量（〜75〜100ミリグラム）から、ミトコンドリアの単離手順の詳細な説明を提供します。この単離手順は、O 2消費率、RCR値、最大のクエン酸シンターゼ活性およびイムノブロットからのタンパク質の発現によって証明されるように、高機能、純粋なミトコンドリア（〜450μgの）を生成することができます。重要なことには、この手順から単離されたミトコンドリアは、高スループットを可能にするマイクロプレートベースのO 2消費の技術で複数respirometircアッセイのために使用することができます。
骨格筋ミトコンドリアの単離は、多くの場合、結合組織および構造タンパク質7,16を囲むからミトコンドリアを解放するために過酷な方法を必要とします。その結果、ミトコンドリア膜は、このように、後続のrespirome中のミトコンドリアO 2消費の活性（従って、精度）を損なう、崩壊してしまうことができますTRICアッセイ。以前に記載されたプロトコル7に組織切除後にカミソリの刃を使用してミンチ組織の追加のステップを含むことにより、モータ駆動均質化のため大幅に削減ロータ速度は（80 rpmの対1,600 rpm）で可能でした。これらの穏やかな均質化および再懸濁技術は、単離手順以下のクエン酸合成酵素活性から評価されるように、無傷の膜（92.5±2.0％）とミトコンドリアの割合が高いにつながります。我々の調査結果は、Asmann ら 17、ヒト骨格筋からの単離以下の90％〜95％無傷のミトコンドリアの準備の間報告と一致しています。これは、クエン酸シンターゼ活性を測定することは、ミトコンドリア膜の物理的完全性を測定するために適している単離ミトコンドリアの機能的完全性を評価するために使用されるべきではないことに留意することが重要です。一方、これらのアッセイからのO 2消費アッセイおよびRCRの決意は、MEAに使用する必要があります単離ミトコンドリア1の機能を確認してください。また、RCRはまた、結合されたミトコンドリアの指標として用いることができます。そのため、OCRおよびピルビン酸/リンゴ酸アッセイ8、および呼吸種々のアッセイから得られた高RCR値から典型的な範囲内のミトコンドリアの状態は、このプロトコル由来のミトコンドリアが密結合と機能性に優れていることを示しています。
そのまま、純粋なミトコンドリアの単離はrespirometicアッセイのための重要な意味を持ちます。最終のミトコンドリア調製物中の非ミトコンドリアタンパク質の汚染は、このように、ミトコンドリアの異なる調製物を用いて行った実験のうちのいずれかの比較の精度を低下させる、O 2消費の測定の間に各ウェルにミトコンドリアタンパク質の不均等な量のローディングをもたらすことができます。また、他の呼吸器官とミトコンドリアの準備の汚染（例えば、ペルオキシソーム）CAnは、さらにO 2消費測定の精度を低下させます。内側のミトコンドリアタンパク質、COXIV、と私たちの孤立したミトコンドリアの調製後、免疫ブロット法で細胞質ゾル（および潜在的核）タンパク質、GAPDH、の顕著なバンドの有無は、単離手順中に非ミトコンドリア源から少し汚染の指標であります。
これは、精製されたミトコンドリアの準備の単離は上述に関して重要であるが、ミトコンドリアの完全性の維持が呼吸アッセイにおいて最も重要であることに注意することが重要です。ミトコンドリア外膜を簡単に分離バッファへのシトクロムcの脱出につながるので、O 2消費とATP合成18の間にレート制限になって、単離手順中に破損することができます。したがって、単離されたミトコンドリアの完全性は、さらに、チトクロムを定量することによって評価することができます（前の再懸濁のステップ2.15）およびウエスタンブロット法で単離ミトコンドリアにおけるミトコンドリアの準備の上清中のECタンパク質発現。ミトコンドリア膜を単離手順以下の異常がない場合シトクロムcは、ミトコンドリア準備上清中に存在してはなりません。
このプロトコルのすべてのステップは、しかし、このプロトコルには3つの重要なステップがあり、重要です。このステップは、均質化ステップ（ステップ2.11）の間に遅いロータ速度を可能にするため、まず、三つの異なるかみそりの刃（ステップ2.4）と赤骨格筋のミンチが重要です。第二に、氷上または冷蔵緩衝液中の多くのステップの性能は、従来のマイクロプレートベースの呼吸アッセイに静止状態におけるミトコンドリアを維持することが重要です。最後に、IBM2にミトコンドリアペレットを穏やかに再懸濁が最も重要です。穏やかな混合は、正確なRESPのために重要であるミトコンドリアの完全性を維持irometicアッセイ。
この技術のいくつかの制限事項が言及する価値があります。まず、単離操作を実行するために必要な機器（例えば、超遠心、モーター駆動ホモジナイザーなど ）が高価であることができます。さらに、複数の品質管理方法は、清潔で、無傷ミトコンドリアを確保するために必要とされます。しかし、研究者は、単離操作に習熟したら、高品質のミトコンドリアが得られているなど、測定の多くで使用されるが、これらに限定されないことができる：ウェスタンブロット、酵素アッセイ、RT-PCR、PCR、H 2 O 2アッセイ、およびハイスループットマイクロプレート呼吸測定。それは、この分離手順を最適化し、同じ種からの組織から分離技術を適用しようとするときに注意する必要があり、マウス骨格筋および注意少量のために変更されていることに注意することが重要である（あっても異なる種からの同じ組織に）他の組織へ/特異エス。最適な結果を得るために、文献を検索することは意図された組織/種のための最良の単離法を見つけようとして最良の選択肢となります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
| Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
| Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
References
- Brand, M., Nicholls, D.
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746 (2011).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
- Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
- Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
- Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
