Abstract
Dysfunksjonelle skjelettmuskel mitokondrier spille en rolle i endret metabolisme observert med aldring, overvekt og type II diabetes. Mitokondrie respirometrisk analysene fra preparater av isolerte mitokondrier tillate vurdering av mitokondriell funksjon, så vel som bestemmelse av mekanismen (e) av virkningen av narkotika og proteiner som modulerer metabolisme. Nåværende isoleringsprosedyrer krever ofte store mengder av vev for å gi høy kvalitet mitokondrier er nødvendige for respirometrisk analyser. Metodene som presenteres heri beskriver hvordan høy kvalitet renset mitochondria (~ 450 ug) kan isoleres fra minimale mengder (~ 75 til 100 mg) av mus skjelettmuskulatur for anvendelse ved høy gjennomstrømning respirasjonsmålinger. Vi fastslått at vår isolasjonsmetoden gir 92,5 ± 2,0% intakt mitokondriene ved å måle citratsyntaseaktivitet spektrofotometrisk. I tillegg, Western blot-analyse i isolerte mitokondrier resulterte i svak ekspresjon av cytosolic protein, GAPDH og robust uttrykk for mitokondrie protein, COXIV. Fraværet av en fremtredende GAPDH bånd i de isolerte mitokondrier er indikativ for lite forurensning fra ikke-mitokondrielle kilder under isoleringsprosedyren. Viktigst, måling av O 2 forbruk hastighet med micro-plate basert teknologi og bestemme luftkontrollforholdet (RCR) for koblede respirometrisk analyser viser svært kombinert (RCR;> 6 for alle analyser) og funksjonelle mitokondrier. Som konklusjon, tilsetning av et separat hakking trinn og betydelig redusere motordrevet homogenisering hastigheten til en tidligere rapportert fremgangsmåte har tillatt isoleringen av høy kvalitet og renset mitokondrier fra mindre mengder av mus skjelettmuskulatur som resulterer i sterkt koplet mitokondrier som respirere med høy funksjon under mikro basert respirometirc analyser.
Protocol
Dyrestudier ble utført under en godkjent protokoll av Institutional Animal Care og bruk Utvalget ved Virginia Polytechnic Institute og State University.
1. Setup (Time: ~ 45 min)
- Tine frosne butikker på 0,25% Trypsin, Isolation Buffer for Mitokondrier (IBM) 1 og IBM2 i en 37 ° C vannbad.
- Skyll glass og dissekere instrumenter i 70% etanol etterfulgt av høy renhet vann.
- Forbered 0,05% trypsinoppløsning fra 0,25% trypsin lager ved å fortynne en del trypsin i 4 deler IBM1.
- Bland protease inhibitor cocktail og fosfatase med cellelyseringsbuffer (1: 100 forhold) i et 1,5 ml mikrosentrifugerør med skrukork.
- Alikvote 5 ml (5 ml / mus) på 0,05% trypsin i en 15 ml plastrør.
- Still motordrevet vevshomogenisator til 80 RPM.
2. Isolering av Skeletal Muscle Mitokondrier (Time: ~ 90 min)
- Avlive en mus av CO 2
- Fjern røde muskel fra den quadriceps og gastrocnemius muskelen, som inkluderer soleus (~ 75-100 mg totalt) som beskrevet i følgende trinn:
- Skrelle huden mot mus.
- Fjern fett puten over quadriceps opprinnelse punktet. Skjær quadriceps senen som er festet til patella med fine tippet saks.
Merk: quadriceps er identifisert av sin anatomisk posisjon på den fremre del av den proksimale femur. - Sakte avklipt aponeurosis mellom benet og quadriceps, og samtidig unngå lårarterie, for å frigjøre quadriceps fra beinet. Skjær sene med fine tippet saks i origo punkt på femur å frigjøre quadriceps muskel og plasser quadriceps muskel i kjølt PBS.
- Fjern synlig fettvev over quadriceps med saks. Flip quadriceps over slik at den del av muskelen som ble overliggende femur er vendt us. Åpne quadriceps muskel med tang i en Fanning bevegelse. Fjern de to synlige røde muskel delene fra hver lapp med fine tippet saks og sted i et beger som inneholder 5 ml kjølt IBM1.
Merk: Quadriceps muskel vises som to lapper med en stripe av rød muskel som ligger nær sidekant av hver lapp. - Skjær huden overliggende akillessene med fine tippet saks og skrelle huden mot mus. Skjær den eksponerte akillessene og skrelle muskelen mot kroppen av musen.
- Kutt sene i laterale og mediale kondylene av femur med fine tippet saks for å frigjøre gastrocnemius og plassere gastrocnemius festet til sine sener i kjølt PBS.
- Vend gastrocnemius over og skrelle av soleus muskelen og fyll i begeret inneholder 5 ml kjølt IBM1. Fan åpne gastrocnemius. Fjern de tre visuelle røde muskel deler (to laterale og en medial overfladiske røde striper) med fin tippet sakses og overføre dem til begeret inneholder 5 ml kjølt IBM1.
- Fjern en annen ~ 75-100 mg av røde muskel fra den andre etappe av mus (som beskrevet i trinn 2,2) og plasseres i et 1,5 ml mikrosentrifugerør med protease inhibitor cocktail og fosfatase og cellelyseringsbuffer (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% natrium-dodecyl-sulfat, 0,5% natriumdeoksykolat, 1% Polyoksyetylen (9) nonylphenylether, forgrenet. Umiddelbart flash-fryse den andre prøven i flytende nitrogen for senere bruk ved Western blotting (se trinn 6.1).
- Plasser et pre-kjølt, flat plastoverflate på is i en stor bøtte. Hell en dråpe IBM1 på plastoverflaten og bruke pinsett til å plassere alle delbare røde muskelen (trinn 2.2.4 og 2.2.7) i IBM1 dråpe. Finhakk muskelvev i 2 min ved hjelp av 3 enkle kant barberblad ved å endre barberhøvler hver 40 sek.
- Overfør hakket vevet til en ny begerglass med 5 ml frisk IBM1 ved å holde plast overflate over the begerglass og skraping muskelen i begerglasset med et barberblad. Ta denne løsningen og tømme det gjennom en 100 um celle sil plassert på et 50 ml konisk rør.
- Blot vevet med en delikat oppgave svisker og deretter overføre den til 5 ml av 0,05% trypsin løsning. Bruk pinsett til å fjerne vev fra oppgaven svisker.
- Inkuber muskelvev på is i 30 minutter i 0,05% trypsin-løsning.
- Spinn 15 ml konisk rør som inneholder trypsin / muskel blandingen ved 200 xg i 3 min ved 4 ° C.
- Hell trypsin supernatanten i en avfallsbeholder og resuspender pelleten med 3 ml iskald IBM1. Overfør vevet til et 45 ml glass homogenisator rør. Skyll de 15 ml konisk rør med en annen 1,5 ml IBM1 å samle eventuelle gjenværende prøven og legge dette til glasshomogenisator tube.
- Plasser glasshomogenisator røret i et begerglass eller plastbeholder fylt halvveis med is, slik at glasshomogenisator beveger seg minimalt innenfor begeret.
- Overfør vevshomogenat i et nytt 15 ml konisk rør og skyll glasshomogenisator røret med 6,5 ml IBM1. Hell IBM1 inn i 15 ml konisk rør som inneholder vevhomogenat.
- Spinn 15 ml konisk rør på 700 g for 10 min ved 4 ° C. Forsiktig helles supernatanten i et glass med høy styrke sentrifugerør og kast pelleten.
- Spinn supernatanten fra det foregående trinn ved 8000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Fjern IBM1 supernatanten og re-suspendere pellet ved langsom tilsetning av 500 ul IBM2. Skjær av enden av en pipette tips og forsiktig homogen pelleten i IBM2 med blanding og røring bevegelser. Legge til en annen 4,5 ml IBM2 til blandingen etter at pelleten er fullstendig suspendert.
Merk: Unngå overdreven utgnidning mens bryte større pellets stykker som thans kan skade mitokondrie membraner. - Snurr IBM2 / vevhomogenatet ved 8000 xg i 10 min ved 4 ° C.
Merk: Dette trinnet kan bli gjentatt i en ren høyfast sentrifugerør for mer nøyaktig kvantifisering av protein isolerte mitokondrier i trinn 4, siden rest BSA kan bidra til totalt proteininnhold. - Fjern supernatanten og forsiktig, men helt re-suspendere pellet ved å legge to 25 mL trinn på IBM2 med en pipette med spissen avskåret. Forsiktig røre og blande pellet etter hvert tillegg av 25 ul av IBM2. Plasser denne mitokondrie lager på is.
3. homogenisering av Whole Tissue Lysate (Time: ~ 45 min; Kan gjøres under Trinn 7)
- Fjerne muskel fra som ble plassert i flytende nitrogen fra trinn 2.3 og inkuber ved værelsetemperatur inntil fullstendig opptint.
- Finhakk vev for ~ 30 sek på is med fine tippet saks.
- Legg til to 100 mL scoops av Zircoskiftet Oxide Perler til 1,5 ml mikro rør med skrukork fra trinn 3.2 som inneholder kjøttdeig vev. Homogenisere vevet i en kulemølle vevshomogenisator ved hjelp av to til tre 5 min sykluser ved en hastighetsinnstilling på 4-6 (middels innstilling).
- Spinne blandingen fra trinn 3,3 ved 12 000 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten ved hjelp av en 1000 mL pipette tips etter spinn og overføring til en 1,5 ml mikro tube. Kast pellet og plassere supernatanten på is.
4. Protein Bestemmelse (Time: ~ 30 min)
- Bestem proteinkonsentrasjonen av hele vevet lysat (trinn 3.4) og mitokondrielle lager (trinn 2.17) ved hjelp av BCA Protein assay kit i henhold til produsentens spesifikasjoner.
5. Mitokondrier membranintegritet; Citratsyntaseaktivitet (CS) Aktivitet (Time: ~ 15 min)
- Lag to separate 1: 20 fortynninger av mitokondrie lager i høy renhet vann. Legg til0,1% Triton X-100 til en prøve og sonikere det ved en lav temperatur (765 watt, amplitude av 2). La den andre fortynning på is. Returner prøven til is etter lydbehandling.
- Utføre en citratsyntaseaktivitet analysen med både ikke-ultralydbehandlet og sonikert mitokondrielle fortynninger ved bruk av en spektrofotometrisk analyse som beskrevet tidligere 11,12.
- Hvor mange prosent av intakte mitokondrier membraner ved hjelp av følgende ligninger:
(Non-lydbehandlet CS aktivitet ÷ lydbehandlet CS aktivitet) * 100
100- N (prosent oppnådd ovenfra)
6. Mitokondrier Isolation Quality; Western blotting (Time: Ifølge Lab Protocol)
- Utføre Western blotting på hele lysatet vev og isolerte mitokondrier som tidligere beskrevet 12.
Merk: Bruk primære antistoffer for GAPDH (1: 1000 fortynning i 5% BSA / TBS-T) og COXIV (1: 1000 fortynning i 5% fettfrimelk / TBS-T), etterfulgt av anti-geit, kanin og sekundære antistoffer, henholdsvis (1: 10000).
7. respirometrisk analysen Run (Time: ~ 90 min)
- Utføre ønskede respirometrisk analyser ved anvendelse av mikroplatebasert O 2 forbruk måleteknologien som tidligere beskrevet (se ledsagende artikkelen og Rogers et al 8).
- Bestem luftkontrollforholdet (RCR) ved å dividere State 3 ved State 4o (RCR) eller dividere State 3U ved State 4o. Bruk enten midten (gjennomsnitt) punkt, eller den høyeste (State 3) og laveste priser (State 4o) fra punkt-til-punkt-spor ved fastsettelse RCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Citratsyntaseaktivitet tjener som et mål for membranintegritet siden citratsyntaseaktivitet er plassert i den indre mitokondriemembranen, og derfor bør ikke være til stede i suspensjoner av mitochondria med intakte membraner. Figur 1 representerer citratsyntaseaktivitet i ikke-ultralydbehandlet mitokondrielle prøvene sammenlignet med sonikert prøver fra samme isolasjon. Sonicating mitokondrienes resulterer i en statistisk signifikant økning i citratsyntaseaktivitet (P <0,01). Viktigere, 92,5 ± 2,0% av mitokondrier var intakte etter isoleringen.
Figur 2 viser GAPDH og COXIV ekspresjon i isolerte mitokondrier og i hele skjelettmuskelvevet lysat. GAPDH er et protein som ligger i cytosol, men kan også bli funnet i kjernen etter translokasjonen, mens COXIV er et protein som ligger i den indre mitokondrie-membran. Uttrykk for GAPDH og COXIV er tydelig i hele tissue lysatet. I det isolerte mitokondrier, er ekspresjon av COXIV observert, mens bare svake bånd av GAPDH er tydelig. Disse funnene indikerer gode mitokondrielle isolasjoner, med liten forurensning fra ikke-mitokondrielle komponenter under isoleringsprosedyren.
Figur 3 er en representant sporing av O 2 forbruk priser (OCR) vs tid for en kobling assay (10 mM pyruvat / 5mM malat) utført fra mitokondrier isolert ved hjelp av denne protokollen, og utført med mikroplatebasert O 2 forbruk teknologi. Hvert panel representerer O 2 forbruk i ulike mitokondrie tilstander som beskrevet av Chance og Williams 13. Det første panel representerer basal O 2 forbruk, eller State 2. Det andre panelet, etter injeksjon av ADP, representerer maksimal koplet åndedrett eller State 3. Den tredje panel, etter injeksjon av oligomycin A (en inhibitor av Complex V), represents åndedrett grunn proton lekkasje, eller stat 4o. Den fjerde panel, etter injeksjon av FCCP, representerer maksimal frakoplet åndedrett eller State 3U. Til slutt, det femte panel, etter injeksjon av antimycin A, representerer inhibering av oksydativ åndedrett. Åndedrettskontroll ratio (RCR), et mål på mitokondriefunksjon 1, ble beregnet ved å dividere State 3 av State 4o. Tabell 4 rapporter gjennomsnitts RCR verdier for alternative underlaget koblings analyser som kan utføres fra mitokondriene utbyttet fra denne protokollen. Viktigst, O 2 forbruk sporing og de høye RCR verdiene representerer svært velfungerende og kombinert mitokondrier. RCR verdier som rapporteres her, er høyere eller lik enn tidligere rapportert med lignende isolasjon protokoller i murine skjelettmuskulatur 7,14,15, og dermed fremheve den høye kvaliteten på mitokondriene isolert under denne prosedyren.
Figur 1: citratsyntaseaktivitet. Citratsyntaseaktivitet enzymaktivitet som bestemmes spektrofotometrisk i ikke-sonikerte og sonikerte mitokondrier forbereder. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. ** p <0,01. Data representerer n = 3 sammenkoblede biologiske replikater og uttrykt i forhold til mg av protein. 
Fig. 2: cytosolisk og mitokondrie protein ekspresjon i isolerte mitokondrier og hele vev lysat Både isolerte mitokondrier og hele vev lysater ble immunoblottet med COXIV og GAPDH-antistoffer. Mitokondrie protein, COXIV, var tydelig i begge prøvene, men GAPDH var bare svakt tydelig i de isolerte mitokondrier. Fraværet av en fremtredende GAPDH bandet i the isolerte mitokondrier er en indikasjon på liten forurensning fra ikke-mitokondrielle kilder under isoleringsprosedyren.
Figur 3:. Representant sporing av kopling analysen med mitokondrier isolert fra mus skjelettmuskulatur 10 mM pyruvat / 5mM malat kombinert mitokondrielle respirasjonen analyse tracings som bestemmes av multi-brønn måling av O 2 forbruk. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Mitokondrie protein lastet per brønn var 2,5 mikrogram. OCR = O 2 Forbruk Rate; ADP = adenosindifosfat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanide- 4 - (trifluoromethoxy) phenylhydrazone; Anti-A = antimycin
| Reagens | Stock Konsentrasjon | | Endelig Volume | Mass Lagd | |
| (M) | (g / mol) | (ml) | (g) | |
| Tris / HCl, pH 7,4 | 2 | 157,56 | 250 | 78.8 |
| Tris / HCl, pH 7,4 | 1 | 157,56 | 250 | 39.39 |
| KCL | 1 | 74.55 | 500 | 37.28 |
| Tris Base | 1 | 121,14 | 100 | 12.11 |
| EDTA, pH 8 | 0.5 | 416,2 | 100 ml (i 1 M Tris base) | 20.81 |
| EGTA, pH 7.2 | 0.1 | 380,35 | 100 (i en M Tris Base) | 3,801 |
Tabell 1: Utarbeidelse av Stock Solutions.
| Reagens | Stock Konsentrasjon | Mass Lagd | Sluttmolariteten / Percent |
| (M) | (g eller ml) | ||
| Sukrose | - | 11,47 g | 67 mm |
| Tris / HCl, pH 7,4 | 2 | 12,5 ml | 50 mm |
| KCL | 1 | 25 ml | 50 mm |
| EDTA / Tris Base, pH 8 | 0.5 | 10 ml | 10 mm |
| Hovedsak FA Gratis BSA | - | 1 g | 0,20% |
| pH 7,4, 500 ml: Alikvoter 50 ml og fryse | |||
Tabell 2: Utarbeidelse av isolasjonsbuffer for Mitokondrier 1 (IBM1).
| Reagens | Stock Konsentrasjon | Mass Lagd | Sluttmolariteten / Percent |
| (M) | (g eller ml) | ||
| D-Mannitol | - | 10,9 g | 200 mm |
| Sukrose | - | 7,188 g | 70 mm |
| EGTA / Tris Base | 0.1 | 15 ml | 5 mm |
| Tris-HCl, pH 7.4 | 1 | 3 ml | 10 mm |
| pH 7,4, 300 ml: Alikvoter 15 ml og fryse | |||
Tabell 3: Utarbeidelse av isolasjonsbuffer for Mitokondrier 2 (IBM2).
| Underlaget Medium | Endelig Konsentrasjon | RCR |
| Pyruvat / Malate | 10 mM / 5 mM | 16.2 ± 4.6 |
| Suksinat / Rotenon | 10 mM / 2 pM | 10.6 ± 3.8 |
| Palmitoyl L-karnitin / Malate | 40 mikrometer / 1 mM Malate | 6.7 ± 0.6 |
| Glutamat / Malate | 10 mM / 10 mM | 8.6 ± 0.4 |
Tabell 4: Luftveiskontrollprosenter for Coupled mitokondrie respirasjon Analyser Respiratory kontroll forhold som bestemmes av første måling O 2 forbruk priser med mikro basert respirometrisk analyser, etterfulgt ved å dele maksimal kombinert respirasjon (ADP stimulert State 3) ved respirasjon grunn proton lekkasje (Oligomycin. Et svar State 4o). Verdier er uttrykt som megen ± SE. Mitokondrie protein lastet per brønn var 2,5 mikrogram for pyruvat / malat og succinate / rotenon analyser, og 3,5 mikrogram av mitokondriell protein per brønn for palmitoyl L-karnitin / malat og glutamat / malat analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene som presenteres heri, gir en detaljert beskrivelse av en mitokondriell isoleringsprosedyren fra minimale mengder (~ 75 til 100 mg) av mus skjelettmuskel. Denne isolasjonen prosedyren er i stand til å gi høyt fungerende, ren mitokondrier (~ 450 mikrogram) som gjenspeiles av O 2 forbruk priser, RCR verdier, maksimal citratsyntaseaktivitet og protein expression fra immunoblotting. Viktigere, kan mitokondriene isolert fra denne fremgangsmåten kan brukes for flere respirometirc analyser med mikroplatebasert O 2 forbruk teknologi som gjør det mulig for høy gjennomstrømning.
Isolering av skjelettmuskel mitokondrier krever ofte harde metoder for å frigjøre mitokondriene fra omkringliggende bindevev og strukturelle proteiner 7,16. Følgelig kan mitokondrielle membraner bli forstyrret, og dermed svekke aktiviteten (og dermed nøyaktigheten) av mitokondriell O 2 forbruket under etterfølgende respirometric analyser. Ved å inkludere et ytterligere trinn av vev hakking ved hjelp av barberblader etter eksisjon vev til en tidligere beskrevet protokoll 7, ble en betydelig redusert hastighet rotor for homogenisering mulig motordrevet (80 rpm vs. 1600 rpm). Disse mildere homogenisering og resuspensjon teknikker fører til en høy andel av mitokondrier med intakte membraner (92,5 ± 2,0%), som målt fra citratsyntaseaktivitet følgende isoleringsprosedyren. Våre funn er i samsvar med Asmann et al. 17, som rapporterer mellom 90-95% intakte mitokondrielle preparater følgende isolert fra human skjelettmuskulatur. Det er viktig å merke seg at måle citratsyntaseaktivitet er bedre egnet for å måle fysiske integritet av mitokondrielle membraner og skal ikke benyttes til å vurdere funksjonell integritet av de isolerte mitokondrier. På den annen side bør O 2 forbruk assays og bestemmelse av RCR fra disse analysene brukes til å measikker funksjon av isolerte mitokondrier 1. I tillegg kan RCR også brukes som en indikator på koplede mitokondrier. Derfor indikerer OCR og mitokondrie stater innenfor en typisk rekkevidde fra pyruvat / malat analysen 8, og de høye RCR verdier hentet fra en rekke respirometrisk analyser som mitokondriene avledet fra denne protokollen er tett koblet og meget funksjonell.
Isolering av intakte og rene mitokondrier har viktige implikasjoner for respirometic analyser. Forurensning av ikke-mitokondrielle proteiner i slutt mitokondrie forberedelse kan føre til lasting ulike mengder av mitokondrie protein til hver brønn under O 2 forbruksmålinger, og dermed redusere nøyaktigheten av enhver sammenligning mellom eksperimenter utført ved hjelp av ulike preparater av mitokondrier. Videre forurensning av mitokondriell preparat med andre pustende organeller (f.eks peroxisomes) can ytterligere redusere nøyaktigheten til O 2 forbruk målinger. Tilstedeværelsen av den indre mitokondrie protein, COXIV, og fraværet av et fremtredende bånd av cytosoliske (og potensielt atom) protein, GAPDH, i vårt isolerte mitokondriell fremstillingen følgende immunoblotting er en indikasjon på liten forurensning fra ikke-mitokondrielle kilder under isoleringsprosedyren .
Det er viktig å merke seg at selv om isoleringen av et renset mitokondriell preparat er viktig med hensyn til det ovennevnte, er opprettholdelsen av mitokondriell integriteten av største viktighet i respirasjon analyser. Den ytre mitokondriemembranen kan lett bli skadet under isoleringsprosedyren, som fører til frigjøring av cytokrom c inn i isolasjon buffer og dermed blir hastighetsbegrensende under O 2 forbruk og ATP syntese 18. Derfor kan integriteten av isolerte mitokondrier bli ytterligere vurdert ved å kvantifisere cytochromec protein ekspresjon i supernatanten av mitokondriell preparatet (trinn 2.15, før resuspensjon) og i det isolerte mitokondrier med Western blotting. Cytokrom c bør ikke være til stede i det mitokondrielle fremstillingen supernatanten hvis den mitokondrielle membraner er intakte følge isoleringsprosedyrer.
Alle trinnene i denne protokollen er viktige, men det er tre viktige skritt i denne protokollen. Først er hakking av rød skjelettmuskulatur med tre forskjellige barberblad (trinn 2.4) kritisk fordi dette trinnet åpner for lavere rotorhastigheter under homogenisering trinn (trinn 2.11). For det andre, er ytelsen til mange skritt på is eller i kjølt buffere avgjørende å opprettholde mitokondriene i en hvilende tilstand før mikro basert respirometrisk analyser. Endelig er den milde resuspensjon av mitokondriene pellet inn IBM2 av største betydning. Lett blanding opprettholder mitokondrie integritet, noe som er avgjørende for nøyaktig respirometic analyser.
Noen begrensninger av denne teknikken er verdt å nevne. Først, det utstyr som er nødvendig (for eksempel ultrasentrifuge, motordrevet homogenisator, etc.) for å utføre isoleringsprosedyren kan være kostbart. I tillegg er flere kvalitetskontroll metoder er nødvendig for å sikre et rent og intakte mitokondrier. Men når forskeren er dyktig i isoleringsprosedyren, er av høy kvalitet mitokondrier ga som kan brukes i en rekke målinger, inkludert, men ikke begrenset til: Western blot, enzymatiske analyser, RT-PCR, PCR, H 2 O 2 assays og høy gjennomstrømning mikroluftmålinger. Det er viktig å merke seg at dette isolert sett prosedyren har blitt optimalisert og modifisert for små mengder av mus skjelettmuskulatur og forsiktighet bør tas når du prøver å bruke isoleringsmetoder fra en gitt vev fra samme art (og til og med den samme vev fra forskjellige arter ) til andre vev / spesies. For optimale resultater, vil søker litteraturen være det beste alternativet når du prøver å finne den beste isolasjonsmetoden for de tiltenkte vev / arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
| Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
| Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
References
- Brand, M., Nicholls, D.
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746 (2011).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
- Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
- Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
- Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
