Abstract
Неблагополучные скелетные мышечные митохондрии играют важную роль в обмене веществ наблюдается измененной со старением, ожирения и сахарного диабета II типа. Митохондриальные respirometric анализы из изолированных препаратах митохондрий позволяют для оценки функции митохондрий, а также определения механизма (ов) действия лекарственных средств и белков, которые модулируют метаболизм. Текущие процедуры изоляции часто требуют большого количества ткани, чтобы получить высокие митохондрии качества, необходимые для respirometric анализов. Методы, представленные здесь, описывают, как высокое качество очищают митохондрии (~ 450 мкг) может быть выделен из минимальных количествах (~ 75-100 мг) мыши скелетных мышц для применения в дыхательных измерений с высокой пропускной способностью. Мы решили, что наш метод изоляции дает 92,5 ± 2,0% нетронутыми митохондрии путем измерения активности цитрат-синтазы спектрофотометрически. Кроме того, Вестерн-блот анализ в изолированной митохондрии в результате слабый экспрессии cytosoLIC белок, GAPDH и надежный выражение белка митохондрий, COXIV. Отсутствие видного GAPDH полосы в изолированных митохондриях свидетельствует о небольшом загрязнения от не-митохондриальных источников во время процедуры изоляции. Самое главное, что измерение O 2 скорости потребления с технологией, основанной микро-пластины и определения дыхательный коэффициент (РКП) для связанных respirometric анализов показывает весьма сочетании (RCR;> 6 для всех анализов) и функциональные митохондрии. В заключение, добавление отдельной стадии мясорубки и значительно снижая приводом двигателя скорость гомогенизации сообщалось ранее метода позволило изоляции высокого качества и очищенной митохондрий от небольших количеств мыши скелетных мышц, что приводит к высокой связанных митохондрий, что дышать с высокой функции во микропланшета на основе respirometirc анализов.
Protocol
Исследования на животных проводились в соответствии с утвержденным протоколом по Уходу за животными и использовать комитета в Вирджинском политехническом институте и государственном университете.
1. Настройка (Время: ~ 45 мин)
- Оттепель замороженных магазины 0,25% трипсина, изоляции буфера для митохондрий (IBM) 1 и IBM2 в водяной бане 37 ° C.
- Промыть стекла и рассекает инструменты в 70% этаноле с последующим воды высокой степени чистоты.
- Подготовка 0,05% раствора трипсина из 0,25% трипсина складе путем разбавления 1 часть трипсина в 4-х частях IBM1.
- Смешайте протеазы и ингибитор фосфатазы коктейль буфера для лизиса клеток (1: 100) в соотношении 1,5 мл микроцентрифужных трубки с винтовой крышкой.
- Кратные 5 мл (5 мл / мышь) в 0,05% трипсина в 15 мл пластиковую пробирку.
- Установите приводом от двигателя ткани гомогенизатора до 80 оборотов в минуту.
2. Выделение митохондрий скелетных мышц (Время: ~ 90 мин)
- Эвтаназии мыши по CO 2
- Удалить красный мышцы от четырехглавой мышцы и, икроножной который включает камбаловидной (~ 75-100 мг общее), как описано в следующих шагах:
- Очистите кожу к мыши.
- Удалить жировой ткани над четырехглавой точки происхождения. Вырезать сухожилия четырехглавой мышцы, которая крепится к коленной чашечки с мелкими наконечником ножницами.
Примечание: четырехглавой идентифицируется по анатомическом положении на передней части проксимального отдела бедренной кости. - Медленно отрезать апоневроз между костью и четырехглавой, избегая при этом бедренную артерию, чтобы освободить четырехглавой мышцы от костей. Вырезать сухожилия с мелкими наконечником ножницами в точке происхождения на бедра, чтобы освободить четырехглавой мышцы и поместите четырехглавой мышцы в охлажденный PBS.
- Удалить видимый жировой ткани над четырехглавой с ножницами. Флип четырехглавой над тем, что часть мышцы, которая была покрывающей бедренную сталкивается Uп. Откройте четырехглавой мышцы щипцами в движении Фаннинг. Снимите два видимых красных мышечных частей от каждого лепестка с мелкими наконечником ножницы и место в стакан, содержащий 5 мл охлажденного IBM1.
Примечание: четырехглавой мышцы бедра выглядят как две лопасти с полосой красной мышцы размещается в боковой кромки каждого лепестка. - Разрежьте кожу, покрывающий ахиллова сухожилия с прекрасными наконечниками ножницами и очистить кожу к мыши. Вырезать подвергается ахиллово сухожилие и очистить мышцы к телу мыши.
- Вырезать сухожилия на латеральной и медиальной мыщелков бедренной кости с мелкими наконечником ножницами по освобождению икроножной и место икроножной прикрепленный к его сухожилий в охлажденном PBS.
- Переверните икроножной снова и шелушиться камбаловидной мышцы и поместить в стакан, содержащий 5 мл охлажденного IBM1. Вентилятор открыть икроножной. Снимите три визуальные красные мышечные части (две боковые и одна медиальная поверхностные красные полоски) с тонкой наконечником ножницамис и передавать их в стакан, содержащий 5 мл охлажденного IBM1.
- Удалить другой ~ 75-100 мг красного мышцы от другой ногой мыши (как описано в шаге 2.2) и помещают в 1,5 мл микроцентрифужных трубки с протеазы и ингибитора фосфатазы коктейль и буфера для лизиса клеток (50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1% додецилсульфата натрия, 0,5% дезоксихолат натрия, 1% полиоксиэтилен (9) nonylphenylether, разветвленными. Сразу флеш-замораживать этот второй образец в жидком азоте для дальнейшего использования в вестерн-блоттинга (см шаг 6,1).
- Поместите предварительно охлажденной, плоский пластиковую поверхность на льду в большом ведре. Налейте капли IBM1 на пластиковой поверхности и использовать пинцет, чтобы разместить все секционного красной мышцы (шаг 2.2.4 и 2.2.7) в IBM1 капли. Фарш мышечной ткани в течение 2 мин с использованием 3 односпальные лезвия бритвы от меняющихся край бритвы каждые 40 сек.
- Передача измельченной ткани в новый стакан с 5 мл свежей IBM1, удерживая пластиковую поверхность над йе стакан и соскабливания мышцы в стакан с бритвенным лезвием. Возьмите это решение и осушить его через ситечко 100 мкм клеток помещали на 50 мл коническую трубку.
- Пятно ткани с деликатной задачей стеклоочистителя, а затем передать его в 5 мл 0,05% раствора трипсина. Используйте пинцет, чтобы удалить ткань от стеклоочистителя задач.
- Инкубируйте мышечной ткани на льду в течение 30 мин в 0,05% -ном растворе трипсина.
- Спина 15 мл коническую пробирку, содержащую трипсин / мышечной смесь при 200g в течение 3 мин при 4 ° С.
- Вылейте трипсина супернатант в контейнер для отходов и ресуспендируют осадок с 3 мл ледяной IBM1. Передача ткани в 45 мл стеклянный гомогенизатор трубки. Промыть 15 мл коническую трубку с другим 1,5 мл IBM1 собрать оставшуюся образец и добавить к стеклянном гомогенизаторе трубки.
- Поместите стакан гомогенизатора трубку в стакан или пластиковый контейнер, заполненный наполовину льдом, так что стекло гомогенизатор движется минимально в стакан.
- Передача гомогената ткани на новый 15 мл коническую трубку и промойте стекло гомогенизатор трубку с 6,5 мл IBM1. Вылейте IBM1 в 15 мл коническую пробирку, содержащую гомогената ткани.
- Спин 15 мл коническую трубку при 700 г в течение 10 мин при 4 ° С. Аккуратно влить супернатант в стеклянной высокопрочной центрифужную пробирку и отбросить гранул.
- Спин супернатант из вышеуказанной стадии при 8000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
- Удалить супернатант и IBM1 повторно приостанавливать осадок путем медленного добавления 500 мкл IBM2. Отрежьте конец пипетки и осторожно гомогенизации осадок в IBM2 с смешиванием движения. Добавить еще 4,5 мл IBM2 к смеси после осадок полностью приостановлено.
Примечание: Избегайте чрезмерного растирание, ломая более крупные гранулы куски, как тего может привести к повреждению мембран митохондрий. - Спин / гомогената ткани IBM2 в 8000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
Примечание: Этот шаг может быть повторен в чистом высокопрочной центрифужную пробирку для более точного количественного определения белка изолированной митохондрии в шаге 4, так как остаточного BSA может способствовать общего содержания белка. - Удалить супернатант и осторожно, но полностью повторно приостанавливать осадок путем добавления двух 25 приращения мкл IBM2 с кончика пипетки с его точки отсечения. Осторожно перемешать и смешать осадок после каждого добавления 25 мкл IBM2. Поместите эту митохондриальную акции на льду.
3. Усреднение Всего Tissue Lysate (Время: ~ 45 мин; может быть сделано во шаге 7)
- Удалить мышцу от помещали в жидкий азот со стадии 2.3, и инкубируют при комнатной температуре до полного оттаивают.
- Фарш ткани для ~ 30 сек на льду с мелкими наконечником ножницами.
- Добавьте две 100 мкл ложки Zirconium оксида Бусы к 1,5 мл микроцентрифужных трубки с винтовой крышкой из стадии 3.2, который содержит фарш ткани. Перемешать ткани в тканевом гомогенизаторе шаровой мельнице с использованием двух до трех циклов 5 мин при установке скорости 4-6 (средние настройки).
- Спин смеси со стадии 3.3 при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Удалить супернатант, используя пипетки с 1000 мкл после спина и передачи в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Откажитесь от гранул и поместите супернатант на льду.
Определение 4. Белок (Время: ~ 30 мин)
- Определить концентрацию белка в ткани лизата целом (шаг 3.4) и митохондриальной складе (шаг 2.17), используя для анализа белка BCA комплект в соответствии с требованиями завода-изготовителя.
5. Митохондрии Мембрана целостности; Цитратсинтазу (CS) Деятельность (Время: ~ 15 мин)
- Сделайте два отдельных 1: 20 разведениях митохондриальной складе в воды высокой степени чистоты. Добавить0,1% тритона Х-100 в одном образце и разрушать ультразвуком его на низком уровне (765 Вт, амплитуда 2). Оставьте другой разбавления на льду. Вернуться образец в лед после обработки ультразвуком.
- Выполнение цитрат-синтазы анализа как с не-ультразвуком и обрабатывали ультразвуком митохондрий разведений с использованием спектрофотометрического анализа, как описано ранее 11,12.
- Определить процент неповрежденных мембран митохондрий с помощью следующих уравнений:
(Не ультразвуком активность CS ÷ ультразвуком CS активность) * 100
100- N (процентов достигается сверху)
6. Митохондрии Изоляция качества; Вестерн блот (Время: Согласно Лаборатории протокола)
- Выполните Вестерн-блоттинга на лизата всей ткани и изолированными митохондриями, как описано ранее 12.
Примечание: Используйте первичных антител для GAPDH (1: 1000 разведение в 5% BSA / TBS-T) и COXIV (1: 1000 разведение в 5% обезжиренноемолоко / TBS-T), а затем анти-козел, и вторичными антителами кролика, соответственно (1: 10000).
7. Анализ Respirometric Выполнить (Время: ~ 90 мин)
- Выполняют желаемые respirometric анализа с использованием микропланшет-основанную O 2 измерения расхода технологии, как описано ранее (см сопутствующую статью и Роджерс и др 8).
- Определить дыхательный коэффициент (РКП), путем деления состояние 3 Государственной 4o (RCR) или деления государство 3U Государственной 4o. Используйте либо средний (средний) точку, или высокий (государство) и 3 низкие цены (Государственный 4х) от точки к точке следов при определении RCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цитрат-синтазы служит мерой для целостности мембраны, так как цитрат-синтазы находится в внутренней митохондриальной мембраны, и, таким образом, не должны присутствовать в суспензии митохондрий с интактными оболочками. Рисунок 1 представляет цитрат-синтазы в не обрабатывали ультразвуком митохондрий образцов по сравнению с ультразвуком Образцы из той же изоляции. Ультразвуком результаты митохондрий в статистически значимое увеличение в цитрат-синтазы (P <0,01). Важно отметить, что 92,5 ± 2,0% митохондрий были целы после изоляции.
Рисунок 2 изображает GAPDH и выражение COXIV в изолированных митохондриях и всей скелетной мышечной ткани лизата. GAPDH представляет собой белок, расположенный в цитозоле, но также могут быть найдены в ядре после транслокации, а COXIV представляет собой белок, расположенный в внутренней митохондриальной мембраны. Выражение GAPDH и COXIV очевидны во всей TISSUE лизат. В изолированном митохондрий, выражение COXIV наблюдается, в то время как только слабые полосы GAPDH очевидны. Эти данные указывают на хорошие митохондриальных обособления, с небольшим загрязнением от не-митохондриальных компонентов во время процедуры изоляции.
Фиг.3 представляет собой представителем отслеживание ставок O 2 потребления (OCR) от времени для сцепления анализа (10 мМ пирувата / 5 мМ малат), выполненных из митохондрий, выделенных с использованием этого протокола, и выполненных с микропланшетов на основе O 2 потребление технологии. Каждая панель представляет собой O 2 потребление в различных митохондриальных государств, как описано случайно и Уильямс 13. Первая панель представляет базальной O 2 потребление или состояние 2. Вторая панель, после инъекции АДФ, представляет максимальную сочетании дыхание или конечным 3. третьей панели, после инъекции олигомицином А (ингибитор комплекса V), represeНТС дыхание из-за утечки протонов, или государства 4o. Четвертый панель, после инъекции FCCP, представляет максимальную несвязанных дыхание, или государство 3U. Наконец, пятой панели, после инъекции антимицина А, представляет собой ингибирование окислительного дыхания. Соотношение дыхательных управления (РКП), мера функции митохондрий 1, была рассчитана путем деления состояние 3 ГК 4o. Табл 4 показывает средние значения RCR альтернативных субстрат связи анализов, которые могут быть выполнены по выходу из митохондрий этого протокола. Важно отметить, что потребление О 2 трассировки и высокие значения RCR представляют весьма функционирования и в сочетании митохондрии. Значения RCR, приведенные здесь, выше или аналогичный, чем сообщалось ранее с использованием аналогичных протоколов изоляции в мышиный скелетных мышц 7,14,15, таким образом, акцентируя высокое качество митохондрий, выделенных во время этой процедуры.
Рисунок 1: цитрат-синтазы. Цитрат-синтазы активности фермента, как определяли спектрофотометрически в не ультразвуком и ультразвуком митохондрий Preps. Значения выражены как среднее ± SEM. ** р <0,01. Данные представляют п = 3 в паре биологических повторяет и выразил относительно мг белка. 
Рисунок 2:. Цитозольного и митохондриальной экспрессии белка в изолированных митохондриях и всей ткани лизата Оба изолированные митохондрии и лизаты ткани были иммуноблоттингу с COXIV и GAPDH антитела. Митохондриальная белков, COXIV, было очевидно, в обоих образцах, однако GAPDH только слегка видно в изолированных митохондриях. Отсутствие видного GAPDH группы в гое изолированные митохондрии свидетельствует о маленькой загрязнения от не-митохондриальных источников во время процедуры изоляции.
Рисунок 3:. Представитель отслеживание связи анализе с митохондриями, выделенных из скелетных мышц мыши 10 мМ пируват / 5 мМ малат в сочетании митохондриальных прорисовки дыхание в тестах определяется путем измерения многолуночном из O 2 потребления. Значения выражены как среднее ± SD. Митохондриальная белков загружен на лунку 2,5 мкг. OCR = O 2 Норма расхода, АДФ = аденозиндифосфатом; Олиго = Олигомицин А; FCCP = Карбонильное cyanide- 4 - (трифторметокси) фенилгидразон; Анти-А = Антимицина А.
| Реагент | Фото Концентрация | | Конечный объем | Масса Добавлено | |
| (М) | (г / моль) | (мл) | (г) | |
| Трис / HCl, рН 7,4 | 2 | 157,56 | 250 | 78,8 |
| Трис / HCl, рН 7,4 | 1 | 157,56 | 250 | 39.39 |
| KCL | 1 | 74.55 | 5 часов | 37.28 |
| Трис-основание | 1 | 121,14 | 100 | 12.11 |
| ЭДТА, рН 8 | 0,5 | 416,2 | 100 мл (в 1 М Трис-основание) | 20.81 |
| EGTA, рН 7,2 | 0,1 | 380,35 | 100 (в 1 М Трис базы) | 3,801 |
Таблица 1: Получение исходных растворов.
| Реагент | Фото Концентрация | Масса Добавлено | Конечная молярность / Процент |
| (М) | (г или мл) | ||
| Сахароза | - | 11.47 г | 67 мм |
| Трис / HCl, рН 7,4 | 2 | 12,5 мл | 50 мм |
| KCL | 1 | 25 мл | 50 мм |
| ЭДТА / Трис-основание, рН 8 | 0,5 | 10 мл | 10 мм |
| По сути Англии БСА | - | 1 г | 0,20% |
| рН 7,4, 500 мл: Алиготе 50 мл и заморозить | |||
Таблица 2: Получение изоляции буфера для митохондрий (1 IBM1).
| Реагент | Фото Концентрация | Масса Добавлено | Конечная молярность / Процент |
| (М) | (г или мл) | ||
| Д-маннитол | - | 10,9 г | 200 мм |
| Сахароза | - | 7.188 г | 70 мм |
| ЭГТА / Трис База | 0,1 | 15 мл | 5 мм |
| Трис-HCl, рН 7,4 | 1 | 3 мл | 10 мм |
| рН 7,4, 300 мл: Алиготе 15 мл и заморозить | |||
Таблица 3: Получение изоляции буфера для митохондрий (2 IBM2).
| Субстрат Средний | Конечная концентрация | RCR |
| Пируват / малат | 10 мм / 5 мМ | 16.2 ± 4.6 |
| Сукцинат / Ротенон | 10 мм / 2 мкМ | 10.6 ± 3.8 |
| Пальмитоил L-карнитин / малат | 40 мкм / 1 мМ малат | 6.7 ± 0.6 |
| Глутамат / малат | 10 мм / 10 мМ | 8.6 ± 0.4 |
Таблица 4: Коэффициенты дыхательного контроля для связанных митохондриального дыхания Анализы соотношений дыхательного контроля, определяемых первым измерением O 2 нормы потребления с микропланшетов основе respirometric анализов, а затем путем деления максимальной сочетании дыхание (АДФ Вынужденное состояние 3) при дыхании из-за утечки протонов (Олигомицин. Ответ Государственный 4o). Величины выражены как я± SE. Митохондриальная белков загружен на лунку 2,5 мкг для пирувата / малат и сукцинат / Ротенон анализов, и 3,5 мкг белка митохондрий на лунку для пальмитоилхлорид L-карнитин / малата и глутамата / малат анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы, представленные здесь, обеспечивают подробное описание митохондриальной процедуры выделения из минимальных количествах (~ 75-100 мг) мыши скелетных мышц. Эта процедура изоляции способен дать высокую функционирование митохондрий, чистый (~ 450 мкг), о чем свидетельствует вывода 2 норм потребления, ценности RCR, максимальная цитрат-синтазы активности и экспрессии белка из иммуноблоттинга. Важно отметить, что митохондрии, выделенные из этой процедуры может быть использован для нескольких анализов respirometirc с микропланшетов на основе O 2 потребление технологии, которая позволяет высокой пропускной способностью.
Изоляция скелетных мышц митохондриями часто требует суровых методов, чтобы освободить митохондрии от окружающих соединительной ткани и структурные белки 7,16. Следовательно, митохондриальных мембран может нарушиться, что ухудшает активность (и, следовательно, точность) митохондриального потребления O 2 во время последующего respiromeкие анализы. В том числе дополнительную стадию измельчения ткани с помощью лезвия после иссечения ткани в ранее описанном протокола 7, значительное снижение скорости вращения ротора для электродвигателя приводом гомогенизации можно было (80 мин по сравнению с 1600 оборотов в минуту). Эти нежные гомогенизации и ресуспендирования методы приводит к высоким процентом митохондрий с интактными мембран (92,5 ± 2,0%), как определено в цитрат-синтазы следующей процедуры выделения. Наши данные согласуются с Асманн др. 17, которые сообщают между 90-95% интактных препаратах митохондрий после выделения из скелетных мышц человека. Важно отметить, что измерения цитрат-синтазы лучше подходит для измерения физическую целостность митохондриальных мембран и не должны быть использованы для оценки функциональной целостности изолированных митохондрий. С другой стороны, O 2 анализы потребления и определение RCR из этих анализов должны быть использованы для MEAУбедитесь, что функция изолированными митохондриями 1. Кроме того, RCR можно также использовать в качестве индикатора в сочетании митохондрий. Таким образом, OCR и митохондриальные государства в типичном диапазоне от пирувата / малат анализа 8 и высоких значений, полученных RCR из различных анализов respirometric указывает, что митохондрии, полученные из этого протокола тесно связаны и очень функциональным.
Выделение интактных митохондрий и чистых имеет важные последствия для respirometic анализов. Загрязнение без митохондриальных белков в конечном митохондриальной препарата может привести к загрузке неравные количества белка митохондрий в каждую лунку в процессе измерений О 2 потребления, таким образом уменьшая точность ни в какое сравнение между экспериментов, выполненных с использованием различных препаратов митохондрий. Кроме того, загрязнение митохондриальной препарата с другими дышащих органелл (например, пероксисом) чап дополнительно снизить точность измерений О 2 потребления. Наличие внутренней митохондриальной белка, COXIV и отсутствии видного полосы цитозольного (и потенциально ядерного) белка, GAPDH, в нашем изолированном митохондриальной подготовки следующего иммуноблоттинга свидетельствует о небольшом загрязнения от не-митохондриальных источников во время процедуры изоляции ,
Важно отметить, что, хотя выделение очищенного препарата митохондриальной важно по отношению к указанное выше, содержание митохондрий целостности имеет первостепенное значение в дыхании анализов. Внешняя мембрана митохондрий могут быть легко повреждены во время процедуры изоляции, что приводит к утечке цитохрома с в буфер изоляции и, таким образом, становится ограничивающим скорость во время потребления O 2 и синтеза АТФ 18. Таким образом, целостность изолированной митохондрии может быть дополнительно оценена посредством количественного цитохромэкспрессия белка EC в супернатанте митохондриальной подготовки (шаг 2.15, до ресуспендирования) и в изолированной митохондрии с Вестерн-блоттинга. Цитохром с, не должны присутствовать в митохондриальной подготовки супернатанта, если митохондриальные мембраны нетронутыми в соответствии с процедурами изоляции.
Все шаги этого протокола важно, однако есть три критические шаги в этом протоколе. Во-первых, мясорубки красного скелетных мышц с тремя различными бритвенных лезвий (шаг 2.4) имеет решающее значение, потому что этот шаг позволяет более медленных скоростях ротора во время стадии гомогенизации (шаг 2.11). Во-вторых, эффективность многих шагов на льду или в охлажденном буферов является критическим для поддержания митохондрии в состоянии покоя до микропланшета на основе respirometric анализов. И, наконец, нежная ресуспендирования осадка митохондрий в IBM2 имеет первостепенное значение. Нежный смешивание поддерживает митохондриальной целостности, которая имеет решающее значение для точного соответственноirometic анализы.
Некоторые ограничения этого метода стоит упомянуть. Во-первых, необходимое оборудование (например, ультрацентрифуга, приводом от двигателя гомогенизатор и т.д.), чтобы выполнить процедуры выделения могут быть дорогими. Кроме того, несколько методов контроля качества для обеспечения чистой и неповрежденные митохондрии. Однако, как только исследователь владеет в порядке, изоляции, высокие митохондрии качества являются дали которые могут быть использованы во множестве измерений, включая, но не ограничиваясь: Вестернблоттинга, ферментативных анализов, ОТ-ПЦР, ПЦР, H 2 O 2 анализы и респираторные измерения с высокой пропускной микроплатах. Важно отметить, что эта процедура изоляции был оптимизирован и модифицированы для небольших количеств мыши скелетных мышц и следует соблюдать осторожность при попытке применить методы изоляции из данной ткани от того же вида (и даже в той же ткани из различных видов ) с другими тканями / SPECIES. Для получения оптимальных результатов, поиск литературы будет самый лучший вариант, когда, пытаясь найти лучший метод изоляции для предполагаемых ткани / видов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
| Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
| Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
References
- Brand, M., Nicholls, D.
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746 (2011).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
- Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
- Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
- Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
