Abstract
Fonksiyonel iskelet kası mitokondri yaşlanma, obezite ve Tip II diyabeti olan gözlenen değiştirilmiş metabolizmasında rol oynar. İzole mitokondriyal müstahzarlardan mitokondriyal respirometrik deneyler, ilaç ve metabolizmasını modüle eden proteinlerin hareket mekanizması (ler) in mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, hem de belirlenmesi için izin verir. Güncel izolasyon prosedürleri genellikle Respirometrik deneyleri için gerekli yüksek kaliteli mitokondri verim dokusunun büyük miktarlarda gerektirir. Bu tarifnamede sunulan yöntemler (~ 450 ug), yüksek verimli, solunum ölçümlerde kullanmak için, fare, iskelet kası, minimum miktarlarda (~ 75-100 mg) izole edilebilir ne kadar kaliteli saflaştırılmıştır mitokondri tarif eder. Bizim izolasyon yöntemi spektrofotometrik sitrat sentaz aktivitesini ölçerek 92.5 ± 2.0% bozulmamış mitokondri verimleri belirlenmiştir. Buna ek olarak, izole edilmiş bir mitokondride Western blot analizi, cytoso soluk ekspresyonu ile sonuçlandılic proteini, GAPDH ve mitokondriyal protein, COXIV sağlam ifadesi. İzole mitokondri belirgin bir GAPDH bantın yokluğu, izolasyon prosedürü sırasında olmayan mitokondriyal kaynaklardan çok az kirlenme göstergesidir. En önemlisi, O 2 tüketimi mikro plakalı tabanlı teknoloji ile hızı ve yüksek birleştiğinde gösterir akuple Respirometrik deneyleri için solunum kontrolü oranı (RCR) belirlenmesi ölçümü (RCR, tüm tahliller için> 6) ve fonksiyonel mitokondri. Sonuç olarak, ayrı bir kıyma adım eklenmesi ve önemli ölçüde daha önce bildirilen yöntemin motor tahrikli homojenleştirme hızını azaltarak yüksek fonksiyonlu teneffüs yüksek bağlanmış mitokondri sonuçlanır fare iskelet kası küçük miktarlarda yüksek kalitede ve saflaştırılmış mitokondri izolasyonunu sağladı mikro-bazlı respirometirc deneyleri sırasında.
Protocol
Hayvan çalışmaları Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış bir protokol çerçevesinde gerçekleştirilen ve Virginia Politeknik Enstitüsü ve Eyalet Üniversitesi'nde Committee bulundu.
1. Kurulum (Saat: ~ 45 dk)
- 37 ° C su banyosunda Mitokondri (IBM) 1 ve IBM2 için% 0.25 tripsin, İzolasyon Tampon çözülme dondurulmuş saklar.
- Cam ve yüksek saflıkta su ile,% 70 etanol içinde kesme durulayınız.
- 4 bölümden IBM1 1 kısım tripsin seyrelterek% 0.25 tripsin stokundan% 0.05 tripsin çözüm hazırlayın.
- Vidalı kapaklı 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde (100 oranı 1) hücre liziz tamponu ile proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyl karıştırın.
- Kısım 5 ml 15 ml'lik plastik tüp içine% 0.05 tripsin (5 ml / fare).
- Set Motor 80 RPM doku homojenleştirici tahrik.
İskelet Kası Mitokondri 2. izolasyonu (Saat: ~ 90 dk)
- CO 2 ile bir fare Euthanize
- Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi soleus (~ 75-100 mg toplam) içeren kuadriseps ve gastroknemius kasının, kırmızı kas kaldırın:
- Fare doğru cilt soyma.
- Kuadriseps kökenli noktası üzerinde yağ yastığı çıkarın. Ince uçlu makasla patella bağlı olduğu kuadriseps tendonu kesin.
Not: quadriceps proksimal femur ön kısmı üzerindeki anatomik pozisyonuna ile tanımlanır. - Kemik kuadriseps kurtarmak için, femoral arter kaçınarak Yavaşça, kemik ve kuadriseps arasındaki künt snip. Kuadriseps kas özgürleştirmek ve soğutulmuş PBS kuadriseps kas yerleştirmek için femur üzerinde orijin noktasında ince uçlu makasla tendon kesin.
- Makasla kuadriseps üzerinde görünür yağ dokusu çıkarın. Yani femur örten oldu kas kısmı u bakacak şekilde çevirin üzerinde kuadrisepss. Bir yelpaze hareket forseps ile kuadriseps kas açın. Soğutulmuş IBM1 5 ml içeren bir cam kapta ince uçlu makas ve yer ile her lobdan iki görünür kırmızı kas kısımlarını çıkarın.
Not: kuadriseps her lobun yan kenarında bulunan kırmızı bir kas şeridi ile iki lob olarak görünür. - İnce uçlu makasla Aşil tendonu örten deri kesin ve fare doğru cilt soyma. Maruz Aşil tendonu kesin ve fare gövdesine doğru kas soyun.
- Gastroknemius serbest ve soğutulmuş PBS kendi tendon bağlı gastrocnemius yerleştirmek için ince uçlu makasla femur lateral ve medial kondil de tendon kesin.
- Üzerinde gastroknemius ve soleus kas çevirin kalkmasına ve soğutulmuş IBM1 5 ml içeren beher içine yerleştirin. Fan gastroknemius açın. Ince uçlu makas ile üç görsel kırmızı kas kısımlarını (iki yanal ve bir medial yüzeysel kırmızı şeritler) çıkarıns ve soğutulmuş IBM1 5 ml ihtiva eden bir behere aktarın.
- (Adım 2.2 de tarif edildiği gibi) fare diğer bacak kırmızı kas diğer ~ 75-100 mg çıkarın ve proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli ve hücre liziz tamponu (50 mM Tris-HCl, 1 ile 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirmek mM EDTA, 150 mM NaCl,% 1 sodyum dodesil sülfat,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 1 polioksietilen (9) nonilfenileter. hemen Western blotlama daha sonra kullanmak için sıvı azot içinde bu ikinci örnek flaş dondurularak dallanmış (adım 6.1).
- Büyük bir kova buz üzerinde önceden soğutulmuş, düz plastik yüzeyi yerleştirin. Plastik yüzeye IBM1 bir damla dökün ve IBM1 damlacık içinde bölümlere kırmızı kas (adım 2.2.4 ve 2.2.7) tüm yerleştirmek için cımbız kullanın. Değişen jilet ile 3 tek kenar jilet her 40 saniye ile 2 dakika süreyle kas dokusu kıyma.
- Th plastik yüzey tutarak taze IBM1, 5 ml ile yeni bir behere kıyılmış doku transfere beher ve bir jilet ile beher içine kas kazıma. Bu çözümü alın ve 50 ml konik tüp yerleştirilir 100 mikron hücre süzgecinden boşaltın.
- Bir hassas bir görev silecek ile doku Blot ve daha sonra% 0.05 tripsin solüsyonu 5 ml aktarın. Görev silecek doku kaldırmak için cımbız kullanın.
- % 0.05 tripsin solüsyonu içinde 30 dakika için buz üzerinde kas dokusu inkübe edin.
- 4 ° C'de 3 dakika boyunca 200 x g'de 15 ml konik tüp içeren tripsin / kas karışımı dönerler.
- Bir atık kabına tripsin süpernatant dökün ve buz 3 ml soğuk IBM1 ile pelletini. 45 ml'lik bir cam homojenizatör tüp doku aktarın. Kalan numune toplamak ve cam homojenleştirici tüp bu eklemek için başka bir 1.5 ml IBM1 ile 15 ml konik tüp durulayın.
- Cam homogenizer beher içinde minimal hareket yani buz ile bir bardak ya da plastik kap dolu yarım içine cam homojenizatör tüp yerleştirin.
- Yeni 15 ml konik tüp doku Homojenat aktarın ve IBM1 6.5 ml cam homojenizatör tüp durulayın. Doku Homojenat içeren 15 ml konik tüp içine IBM1 dökün.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 700 g'de 15 ml konik bir tüp dönerler. Yavaşça cam yüksek mukavemetli santrifüj tüpüne süpernatant dökün ve pelet atın.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 8000 x g'de, yukarıdaki aşamada elde edilen süpernatant dönerler.
- IBM1 Süpernatantı ve yavaşça IBM2 500 ul ekleyerek pelet yeniden askıya. Bir pipet ucunu kesti ve hafifçe karıştırma ve hareketleri karıştırılarak IBM2 pelet homojenize. Pelet tamamen askıya sonra karışıma IBM2 başka 4,5 ml ilave edilir.
T gibi büyük pelet parçaları kırarak aşırı öğütme kaçının: Notonun mitokondriyal zarlarının zarar verebilir. - 4 ° C'de 10 dakika boyunca 8000 x g'de IBM2 / doku Homojenat dönerler.
Not: Bu adım, toplam protein içeriğinin katkıda bulunabilir bakiye BSA yana Aşama 4 izole mitokondri daha doğru bir protein ölçümü için temiz bir yüksek mukavemetli santrifüj tüpüne tekrarlanabilir. - Nazikçe Süpernatantı ve kaldırmak, ancak tamamen kesilmiş olan nokta ile bir pipet ile IBM2 iki 25 ul artışlarını ekleyerek pelet yeniden askıya. Yavaşça karıştırın ve IBM2 25 ul her bir ilaveden sonra pelet karıştırın. Buz üzerinde bu mitokondriyal stok yerleştirin.
Tüm Doku Lizat 3. Homojenizasyon (Saat: ~ 45 dakika; Adım sırasında Yapılabilir 7)
- Bu adım 2.3 sıvı azot içine yerleştirilmiştir gelen kas çıkarın ve tam çözülmüş kadar oda sıcaklığında inkübe edin.
- Ince uçlu makasla buz üzerinde ~ 30 saniye için doku kıyma.
- Zirco iki 100 ul kepçe eklemekıyılmış doku içeren adım 3.2 vidalı kapaklı 1.5 ml mikrosantrifüj tüp uranyum Oksit Boncuk. 4-6 (orta ayar) bir hız ayarında iki 5 ila üç dakika döngüleri kullanarak bir boncuk değirmeni doku homojenleştiricide doku homojenize.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de aşama 3,3 karışımın dönerler. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine spin ve transferden sonra 1000 ul pipet kullanarak süpernatantı. Pelet atın ve buz üzerinde supernatant yerleştirin.
4. Protein Tayini (süre: ~ 30 dakika)
- Üreticinin talimatlarına göre BCA Protein tahlil kiti kullanılarak tüm doku lizat (adım 3.4) ve mitokondriyal stokunun (adım 2.17) protein konsantrasyonu belirleyin.
5. Mitokondri Membran Bütünlüğü; Sitrat Sentaz (CS) Etkinlik (Saat: ~ 15 dk)
- Yüksek saflıkta su mitokondriyal stokunun 20 dilüsyonları: iki ayrı 1 yapın. EklemekTek örnek Triton 100 X% 0,1 ve düşük ayarda (765 Watt, 2 genlik) it at ses dalgalarına maruz. Buz üzerinde başka seyreltme bırakın. Sonikasyon sonra buza örneği dönün.
- Olan bir sitrat sintaz deneyi gerçekleştirmek hem sigara soniklendi ve daha önce tarif edildiği gibi 11,12 bir spektrofotometrik deneyle mitokondriyal dilüsyonları sonike edilmiştir.
- Aşağıdaki denklemleri kullanarak sağlam mitokondri zarlarının yüzdesini belirleyin:
(Non-soniklendi CS faaliyeti ÷ soniklendi CS aktivitesi) * 100
100- N (yüzde yukarıdan elde)
6. Mitokondri İzolasyon Kalite; Western Blot (Saat: Lab Protokole göre)
- Daha önce açıklandığı gibi 12 tam doku lizat ve izole mitokondri Batı blotting gerçekleştirin.
Not: GAPDH kullanımlar primer antikor (1: 1000 seyreltme,% 5 BSA / TBS-T) ve COXIV (1: 1000 seyreltme içinde% 5 yağsızsüt / TBS-T, sırasıyla anti-keçi, tavşan sekonder antikor, (1) ve akabinde: 10,000).
7. Respirometrik Deneyi Run (Saat: ~ 90 dk)
- Daha önce açıklandığı gibi mikroplaka bazlı O 2 tüketimi ölçüm teknolojisi kullanılarak istenilen Respirometrik tahlilleri yapın (arkadaşı makale ve Rogers bkz ark 8).
- Devlet 4o (RCR) tarafından State 3 bölünmesi veya Devlet 4o Devlet 3U bölerek Solunum kontrol oranı (RCR) belirleyin. RCR belirlerken noktadan noktaya izlerinden orta (ortalama) noktası, ya da en yüksek (Devlet 3) ve en düşük fiyatları (Devlet 4o) kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sitrat sintaz aktivitesi sitrat sentez intakt membranlı mitokondri süspansiyonlar içinde mevcut olmamalıdır böylece iç mitokondriyal zarın içinde bulunan ve bu yana membran bütünlüğü için bir ölçüt olarak hizmet vermektedir. 1 sonike ile karşılaştırıldığında sigara sonike mitokondriyal örnekleri sitrat sentaz aktivitesini temsil etmektedir Şekil Aynı izolasyondan örnekler. Sitrat sintaz aktivitesi istatistiksel olarak önemli bir artış mitokondri sonuçları (P <0.01) sonike. Önemlisi, mitokondri 92.5 ± 2.0% izolasyon aşağıdaki sağlamdı.
Şekil 2, izole edilmiş mitokondri ve bütün iskelet kası dokusu lizatındaki GAPDH ve COXIV ekspresyonu gösterilmektedir. GAPDH sitoplazmada bulunan bir protein olan, ancak COXIV iç mitokondriyal zarın yer alan bir protein ise, aynı zamanda, translokasyon sonra çekirdekte bulunabilir. GAPDH ve COXIV ifadesi, tüm Tiss belirgindirue lisatı. GAPDH sadece soluk bantlar belirgin ise izole mitokondri içinde, COXIV ekspresyonu gözlenir. Bu bulgular izolasyon prosedürü sırasında sigara mitokondrial bileşenlerden küçük kirlenme ile iyi mitokondriyal izolasyonları, gösterir.
Şekil 3 bu protokolü kullanılarak izole ve mikro bazlı O 2 tüketimi teknolojisi ile gerçekleştirilen mitokondriden gerçekleştirilen bir birleştirme deneyi için O 2 tüketimi oranları (OCR) karşı zaman (10 mM piruvat / 5 mM malat) temsili bir izleme olduğunu. Her panel Ø Şans ve Williams 13 tarafından açıklandığı gibi farklı mitokondriyal eyalette 2 tüketimini temsil etmektedir. Birinci panel, ADP enjeksiyonundan sonra bazal O 2 tüketimi veya Devlet 2. ikinci panel, temsil eden oligomycin enjeksiyonu (Karmaşık V inhibitörü), represe sonra, maksimal birleştiğinde solunum ya da State 3. Üçüncü paneli temsilproton sızıntısı, ya da Devlet 4o nedeniyle nts solunum. Dördüncü panel FCCP enjeksiyonundan sonra, maksimum Kuplajsız solunum veya Devlet 3U temsil eder. Son olarak, beşinci paneli Antimycin A enjeksiyonundan sonra, oksidatif solunumun engellenmesini gösterir. Solunum kontrolü oranı (RCR), mitokondriyal fonksiyon 1 bir ölçüsüdür, bu protokolden mitokondri verim itibaren yapılabilir alternatif substrat bağlama deneyleri için 4 Raporlar Devlet 4o. Tablo ortalama RCR değerleri State 3 bölünmesiyle hesaplanmıştır. Önemlisi, O 2 tüketimi izleme ve yüksek RCR değerleri yüksek işleyen ve birleştirilmiş mitokondri temsil eder. Burada bildirilen RCR değerleri önceden bu nedenle bu işlem sırasında izole edilen mitokondri kaliteli vurguluyor, fare iskelet kasında 7,14,15 benzer izolasyon protokolleri kullanarak rapor daha yüksek veya benzer.
Şekil 1: Sitrat Sintaz Etkinlik. Olmayan soniklendi ve sonicated mitokondri preps spektrofotometrik belirlenen sitrat sentaz enzim aktivitesi. Değerler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. ** p <0.01. Veri n = 3 biyolojik çoğaltır eşleştirilmiş ve protein mg göre ifade eder. 
Şekil 2:. Sitosolik ve izole mitokondri ve bütün doku lizatındaki mitokondriyal protein ifadesi izole mitokondri ve tam doku lysate'lerin Hem COXIV ve GAPDH antikorları ile bağışık lekelenmesi edildi. Mitokondriyal protein COXIV Ancak GAPDH sadece hafifçe belirgin izole mitokondri olduğu, her iki numunenin açıktı. Th önemli bir GAPDH bant yokluğue izole mitokondri izolasyon prosedürü sırasında olmayan mitokondriyal kaynaklardan çok az kirlenme göstergesidir.
Şekil 3:., Fare, iskelet kasından izole mitokondri kuplaj deneyinin Örnek izleme 10 mM piruvat / 5 mM malat O 2 tüketimi, çok oyuklu ölçümü ile tespit edildiği üzere mitokondriyal solunum deney trase bağlanmış. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. Oyuk başına yüklü Mitokondrial proteini 2,5 ug idi. OCR O 2 Tüketim Oranı =; ADP = Adenozin difosfat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Karbonil siyanür 4 - (triflüorometoksi) fenilhidrazon; Anti-A = Antimycin A.
| Ayıraç | Hazır Konsantrasyon | | Nihai Cilt | Kitle Eklendi | |
| (M) | (g / mol) | (mi) | (g) | |
| Tris / HCl, pH 7.4 | 2 | 157,56 | 250 | 78.8 |
| Tris / HCl, pH 7.4 | 1 | 157,56 | 250 | 39,39 |
| KCL | 1 | 74,55 | 500 | 37,28 |
| Tris Baz | 1 | 121,14 | 100 | 12.11 |
| EDTA, pH 8 | 0.5 | 416,2 | 100 ml (1 M Tris baz olarak) | 20,81 |
| EGTA, pH 7.2 | 0.1 | 380,35 | 100 (1 M Tris baz olarak) | 3,801 |
Tablo 1: Stok çözeltiler hazırlanması.
| Ayıraç | Hazır Konsantrasyon | Kitle Eklendi | Final Molarite / Yüzde |
| (M) | (g veya ml) | ||
| Sakaroz | - | 11,47 g | 67 mM |
| Tris / HCl, pH 7.4 | 2 | 12,5 mi | 50 mM |
| KCL | 1 | 25 mi | 50 mM |
| EDTA / Tris baz, pH 8 | 0.5 | 10 mi | 10 mM |
| Esasen FA Ücretsiz BSA | - | 1 g | % 0.20 |
| pH 7.4, 500 mi: Kısım 50 ml dondurma | |||
Tablo 2: Mitokondri 1 izolasyonu Tampon (IBM1) hazırlanması.
| Ayıraç | Hazır Konsantrasyon | Kitle Eklendi | Final Molarite / Yüzde |
| (M) | (g veya ml) | ||
| D-Mannitol | - | 10.9 g | 200 mM |
| Sakaroz | - | 7,188 gr | 70 mM |
| EGTA / Tris Baz | 0.1 | 15 mi | 5 mM |
| Tris-HCI, pH 7.4 | 1 | 3 mi | 10 mM |
| pH 7.4, 300 mi: Kısım 15 ml dondurma | |||
Tablo 3: Mitokondri 2 İzolasyon Tampon (IBM2) hazırlanması.
| Yüzey Orta | Nihai Konsantrasyon | RCR |
| Piruvat / Malat | 10 mM / 5 mM | 16.2 ± 4.6 |
| Süksinat / Rotenone | 10 mM / 2 mcM | 10.6 ± 3.8 |
| Palmitoil L-Carnitine / Malat | 40 uM / 1 mM Malat | 6.7 ± 0.6 |
| Glutamat / Malat | 10 mM / 10 mM | 8.6 ± 0.4 |
Tablo 4:. İlk maksimal birleştiğinde solunum bölünmesiyle ardından mikroplaka tabanlı Respirometrik deneyleri ile O 2 tüketimi oranlarını ölçerek belirlenen Coupled Mitokondrial Solunum Tahliller Solunum kontrolü oranları için Solunum Kontrol Oranı solunum yoluyla nedeniyle proton sızıntısı (ADP Uyarılmış Devlet 3) (oligomycin Bir yanıt Devlet 4o). Değerler benim gibi ifade edilirBir ± SE. Oyuk başına yüklü mitokondriyal protein palmitoil L-karnitin / malat ve glutamat / malat deneyleri için oyuk başına mitokondriyal protein piruvat / malat ve sukinat / rotenon deneyleri için 2.5 ug ve 3.5 ug olmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntemler fare iskelet kası minimal miktarlarda (~ 75-100 mg) bir mitokondriyal izolasyon prosedürü ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Bu izolasyon prosedürü O 2 tüketimi oranları, RCR değerleri, maksimal sitrat sentaz aktivitesi ve immunoblotting protein ifadesi ile kanıtlandığı gibi yüksek işleyişi, saf mitokondri (~ 450 mikrogram) elde edebiliyor. Önemli olarak, bu prosedür izole mitokondri, yüksek verimlilik sağlayan mikroplaka göre O2 tüketimi teknolojisi ile birden çok respirometirc deneyleri için de kullanılabilir.
Iskelet kas mitokondri izolasyonu genellikle bağ dokusu ve yapısal proteinleri 7,16 çevredeki mitokondri kurtarmak için sert yöntemler gerektirir. Sonuç olarak, mitokondriyal membranlar, böylece daha sonraki respirome sırasında mitokondrial O 2 tüketimi aktivitesini (ve dolayısıyla doğruluğu) zarar kesintiye hale gelebilirgastrik deneyler. Önceden tanımlanmış bir protokole 7 doku kesilip çıkarılmasından sonra tıraş bıçakları kullanılarak kıyma doku ek bir adım da dahil olmak üzere tarafından, motor tahrikli homojenizasyon için önemli ölçüde düşmüş bir rotor hızı (80 rpm genel 1600 rpm) mümkün olmuştur. Izolasyon prosedürü, aşağıdaki sitrat sintaz aktivitesi yoluyla belirlenebilen bu nazik homojenizasyon ve yeniden süspansiye etme teknikleri, intakt membranlı (92.5 ±% 2.0) ile birlikte mitokondri yüksek oranda yol açar. Bulgularımız Asmann ve ark., 17, insan iskelet kasından izole Aşağıdaki% 90-95 sağlam mitokondriyal preparatlar arasında rapor ile tutarlıdır. Bununla birlikte, sitrat sintaz aktivitesinin ölçülmesi mitokondriyal membranlar fiziksel bütünlüğünün ölçmek için daha uygundur ve izole mitokondri fonksiyonel bütünlüğü değerlendirmek için kullanılabilir gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Diğer yandan, bu tahlillerden gelen O2 tüketimi deneyleri ve RCR belirlenmesi mea için kullanılmalıdırİzole mitokondri 1 işlevi emin olun. Buna ek olarak, aynı zamanda RCR bağlanmış mitokondri bir göstergesi olarak da kullanılabilir. Bu nedenle, piruvat / malat deneyde 8 ve respirometrik muhtelif deneylerde elde edilen yüksek RCR değerleri tipik aralık içindeki OCR ve mitokondriyal durumları bu protokol türetilen mitokondri sıkıca bağlanmış ve son derece işlevsel olduğunu gösterir.
Bozulmamış ve saf mitokondri izolasyonu respirometic deneyleri için önemli etkileri vardır. Nihai mitokondriyal hazırlanmasında olmayan mitokondriyal protein kirlenmesi dolayısıyla mitokondri farklı preparatlar kullanılarak deneyler arasında herhangi bir karşılaştırmanın doğruluğu gerçekleştirilir azaltarak, iyi O2 tüketimi ölçümleri sırasında her mitokondriyal protein eşit miktarlarda yükleme neden olabilir. Ayrıca, diğer solunum organellerin mitokondriyal hazırlık kirlenme (örneğin, peroksizomlar) can daha O 2 tüketimi ölçümlerin doğruluğunu azaltabilir. Iç mitokondrial protein, COXIV, ve izole mitokondriyal hazırlanışı aşağıdaki immunoblotting sitozolik (ve potansiyel olarak nükleer) protein, GAPDH, önde gelen bir bant bulunmaması varlığı izolasyon prosedürü sırasında olmayan mitokondriyal kaynaklardan çok az kirlenme göstergesidir .
Bu saflaştırılmış bir mitokondriyal hazırlama yalıtım yukarıda belirtilen göre önemli olmasına rağmen, mitokondriyal bütünlüğünün korunması solunum deneylerinde büyük önem taşımaktadır olduğuna dikkat etmek önemlidir. Dış mitokondrial membran kolayca izolasyon tamponuna sitokrom c kaçış giden ve böylece O 2 tüketimi ve ATP sentezi 18 sırasında sınırlayıcı oranı olma, izolasyon işlemi sırasında zarar görebilir. Bu nedenle, izole mitokondri bütünlüğü daha da sitokrom miktarının değerlendirilebilir(önceki yeniden süspansiyon adım 2,15) ve Western blot ile izole mitokondri mitokondriyal hazırlama üstte yüzen madde içindeki ec-protein ifadesi. Mitokondriyal membranlar yalıtım prosedürleri takip sağlamsa Sitokrom c mitokondriyal hazırlanması süpernatan içinde mevcut olmamalıdır.
Bu protokolün tüm adımları ancak bu protokol üç kritik adımlar vardır, önemlidir. Bu aşama homojenleştirme adımı (adım 2.11) sırasında yavaş rotor hızları için izin verir, çünkü Birincisi, üç farklı Jilet (2.4 adım) kırmızı iskelet kasının kıyma önemlidir. İkinci olarak, buz üzerinde soğutulmuş tampon birçok adımda performansının eski mikrolevha göre respirometrik deneylere dinlenme aşamasında mitokondri korumak için önemlidir. Son olarak, IBM2 içine mitokondri pelet yeniden süspansiyon yumuşak büyük önem taşımaktadır. Nazik karıştırma doğru resp için çok önemlidir mitokondriyal bütünlüğünü korurirometic deneyler.
Bu tekniğin bazı sınırlamaları kayda değer bulunmaktadır. İlk olarak, malzemeleri (örneğin, ultrasantrifüj, motor tahrikli homojenleştirici, vs.) gerçekleştirmek için izolasyon prosedürü pahalı olabilir. Buna ek olarak, çoklu kalite kontrol yöntemleri, temiz ve bozulmamış mitokondri sağlamak için gereklidir. Western blotlar, enzim, RT-PCR, PCR, H2O 2 deneyleri: Araştırmacı izolasyon prosedürü yetkin bir kez, ancak, yüksek kaliteli mitokondri de dahil olmak üzere ölçümler bir çok kullanılan, bunlarla sınırlı olmamakla birlikte elde edilir ve yüksek verimlilik microplate solunum ölçümleri. Bu izolasyon prosedürü, optimize edilmiş ve aynı türden belirli bir dokudan izole etme teknikleri uygulanır çalışırken alınmalıdır fare iskelet kası ve dikkatli küçük miktarlar için değiştirilmiş olduğunu not etmek önemlidir (ve hatta farklı türlerden, aynı dokuya ) diğer dokulara / species. Amaçlanan doku / türler için en iyi izolasyon yöntemini bulmaya çalışırken optimum sonuçlar için, literatür taraması en iyi seçenek olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
| Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
| Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
References
- Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746 (2011).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
- Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
- Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
- Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
