Abstract
Dysfunktionalen Skelettmuskel Mitochondrien spielen eine Rolle in Zusammenhang mit der Alterung, Übergewicht und Diabetes Typ II beobachtet veränderten Stoffwechsel. Mitochondriale respirometrischen Assays aus isolierten Mitochondrien Zubereitungen erlauben die Beurteilung der Mitochondrienfunktion sowie die Bestimmung des Mechanismus (en) der Wirkung von Arzneimitteln und Proteinen, die den Stoffwechsel modulieren. Aktuelle Isolierungsverfahren erfordern häufig große Mengen von Gewebe, um qualitativ hochwertige Mitochondrien für respirometrischen Assays notwendig ergeben. Die hier vorgestellten Methoden beschreiben, wie hohe Qualität gereinigt Mitochondrien (~ 450 & mgr; g) von geringen Mengen (~ 75-100 mg) von Maus-Skelettmuskel isoliert werden für den Einsatz in Hochdurchsatz-Atemmessungen. Wir stellten fest, dass unsere Trennung Verfahren ergibt 92,5 ± 2,0% intakte Mitochondrien durch Messung Citrat-Synthase-Aktivität spektralphotometrisch. Darüber hinaus Western Blot-Analyse in isolierten Mitochondrien führte das schwache Expression des cytosolic Protein, GAPDH und die robuste Expression des mitochondrialen Proteins, COXIV. Die Abwesenheit eines bekannten GAPDH Band in den isolierten Mitochondrien indikativ für kleine Verunreinigungen von nicht mitochondrialen Quellen während des Isolierungsverfahrens. Am wichtigsten ist, die Messung des O 2 Verbrauchsrate mit Mikroplatte basierte Technologie und Bestimmen des respiratorischen Steuerungsverhältnis (RCR) für gekoppelte respirometrischen Assays zeigen hoch gekoppelt (RCR,> 6 für alle Assays) und funktionelle Mitochondrien. Im Ergebnis ist die Zugabe eines separaten Zerkleinern Schritt und Motor angetrieben Homogenisierungsgeschwindigkeit eines zuvor beschriebene Verfahren erheblich reduziert ist die Isolierung von hoher Qualität und gereinigten Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskel, in stark gekoppelt Mitochondrien, die mit hoher Funktions respire Ergebnisse führten während auf Mikrotiterplatte respirometirc Assays.
Protocol
Tierexperimentelle Studien wurden im Rahmen einer genehmigten Protokoll von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee durchgeführt am Virginia Polytechnic Institute und State University.
1. Setup (Zeit: ~ 45 min)
- Tauwetter gefrorenen Filialen von 0,25% Trypsin, Isolation Puffer für Mitochondrien (IBM) 1 und IBM2 in einem 37 ° C Wasserbad.
- Spülen Sie Gläser und Sezieren Instrumente in 70% Ethanol, gefolgt von hochreinem Wasser.
- Bereiten 0,05% Trypsin-Lösung von 0,25% Trypsin Lager durch Verdünnen von 1 Teil Trypsin in 4 Teilen IBM1.
- Mischen Sie Protease und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail mit Zelllysepuffer (1: 100-Verhältnis) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss.
- Aliquots von 5 ml (5 ml / Maus) von 0,05% Trypsin in ein 15 ml Kunststoffröhrchen.
- Set Motor angetrieben Gewebehomogenisator zu 80 RPM.
2. Isolierung der Skelettmuskulatur Mitochondrien (Zeit: ~ 90 min)
- Euthanize eine Maus mit CO 2
- Entfernen Sie rote Muskel von der Quadrizeps und M. gastrocnemius, der die soleus (~ 75-100 mg insgesamt), wie in den folgenden Schritten beschrieben beinhaltet:
- Schälen Sie die Haut in Richtung der Maus.
- Entfernen Sie die Fettpolster über der Quadrizeps-Ursprungspunkt. Schneiden Sie die Quadrizeps-Sehne, die die Kniescheibe mit feiner Spitze Schere angebracht ist.
Hinweis: Der Quadrizeps durch seine anatomische Position an dem vorderen Abschnitt des proximalen Femur identifiziert. - Langsam schnippeln die Aponeurose zwischen dem Knochen und der Quadrizeps, unter Vermeidung der Oberschenkelschlagader, um die Quadrizeps aus dem Knochen zu befreien. Schneiden Sie die Sehne mit feiner Spitze Schere am Ursprungspunkt auf dem Femur um den Quadrizeps zu befreien und legen Sie die Quadrizeps in gekühltem PBS.
- Entfernen Sie sichtbaren Fettgewebe in den Quadrizeps mit einer Schere. Flip Quadrizeps um, so dass der Teil des Muskels, der über den Oberschenkelknochen wurde zugewandt ist uSeite Öffnen Sie die Quadrizeps mit einer Pinzette in einem pendelnden Bewegungen. Entfernen Sie die beiden sichtbaren roten Muskelabschnitte von jedem Lappen mit feiner Spitze Schere und in ein Becherglas mit 5 ml gekühlt IBM1.
Hinweis: Quadrizeps als zwei Lappen mit einem Streifen aus roten Muskel in der Nähe der Seitenkante jedes Flügels angeordnet angezeigt. - Schneiden Sie die Haut über der Achillessehne mit feiner Spitze Schere und schälen die Haut in Richtung der Maus. Schneiden Sie die freiliegenden Achillessehne und schälen die Muskeln auf den Körper der Maus.
- Schneiden Sie die Sehne am lateralen und medialen Kondylen des Oberschenkelknochens mit feiner Spitze Schere, um die gastrocnemius zu befreien und legen Sie die gastrocnemius, seine Sehnen in gekühltem PBS angeschlossen.
- Klappen Sie den gastrocnemius auf und ziehen Sie die Soleusmuskel und legen Sie in den Becher, die 5 ml gekühlt IBM1. Fan öffnen Sie die gastrocnemius. Entfernen Sie die drei visuellen roten Muskelabschnitte (zwei seitlichen und einem medialen oberflächliche rote Streifen) mit feinen Spitzen versehenen Scherens und übertragen diese zu dem Becherglas gegeben, 5 ml gekühlter IBM1.
- Entfernen weiteres ~ 75-100 mg von roten Muskel aus dem anderen Schenkel des Maus (wie in Schritt 2.2 beschrieben) und in einen 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und Zelllyse-Puffer (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Natriumdodecylsulfat, 0,5% Natriumdeoxycholat, 1% Polyoxyethylen (9) nonylphenylether, verzweigt. Unmittelbar Blitz-einfrieren dieses zweite Probe in flüssigem Stickstoff für die spätere Verwendung in Western Blot (siehe Schritt 6.1).
- Legen Sie eine vorgekühlte, flache Kunststoffoberfläche auf Eis in einem großen Eimer. Gießen Sie einen Tropfen IBM1 auf die Kunststoffoberfläche und verwenden Pinzette, um das gesamte geschnittene rote Muskel (Schritt 2.2.4 und 2.2.7) in IBM1 Tröpfchen zu platzieren. Hackfleisch das Muskelgewebe für 2 min mit 3 Einzelklingen durch Ändern Rasierer alle 40 sec.
- Übertragen des zerkleinerten Gewebes mit einem neuen Becherglases mit 5 ml frischem IBM1, indem die Kunststoffoberfläche, über the-Becherglas und Abkratzen der Muskeln in den Becher mit einer Rasierklinge. Nutzen Sie diese Lösung und lassen es durch einen 100 & mgr; m Zellsieb auf eine 50 ml konischen Röhrchen platziert.
- Tupfen Sie das Gewebe mit einer heiklen Aufgabe Wischer und dann übertragen sie in 5 ml 0,05% Trypsin-Lösung. Verwenden einer Pinzette, um das Gewebe von der Aufgabe Wischer zu entfernen.
- Inkubieren des Muskelgewebes auf Eis für 30 min in 0,05% Trypsin-Lösung.
- Spinnen Sie die 15 ml konischen Röhrchen mit Trypsin / Muskel Mischung bei 200 × g für 3 min bei 4 ° C.
- Gießen Sie die Trypsin-Überstand in einen Abfallbehälter und das Pellet mit 3 ml eiskaltem IBM1. Übertragen Sie das Gewebe bis zu einer 45 ml Glas-Homogenisator Rohr. Mit einem weiteren 1,5 ml IBM1 Spülen Sie die 15 ml konischen Röhrchen, um alle verbleibenden Proben sammeln und fügen Sie diese in die Glas-Homogenisator Rohr.
- Legen Sie das Glas-Homogenisator Rohr in ein Becherglas oder Kunststoffbehälter gefüllt zur Hälfte mit Eis, so dass die Glas-Homogenisator bewegt sich minimal in das Becherglas.
- Übertragen Sie die Gewebehomogenat auf ein neues 15 ml konischen Rohr und spülen Sie das Glas-Homogenisator Rohr mit 6,5 ml IBM1. Gießen Sie die IBM1 in die 15 ml konischen Röhrchen mit Gewebehomogenat.
- Spin der konischen 15 ml-Röhrchen bei 700 g für 10 min bei 4 ° C. Gießen Sie vorsichtig den Überstand in ein Glas mit hoher Festigkeit Zentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Pellet.
- Spin der Überstand aus dem obigen Schritt bei 8.000 × g für 10 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie den Überstand und IBM1 resuspendieren Sie das Pellet durch langsame Zugabe von 500 ul IBM2. Schnitt das Ende einer Pipettenspitze und schonend homogenisiert das Pellet in IBM2 mit Mischen und Rühren von Bewegungen. Fügen Sie ein weiteres 4,5 ml IBM2 zu der Mischung, nachdem das Pellet vollständig aufgehängt ist.
Hinweis: Vermeiden Sie übermäßige Verreiben, während brechen größere Pellet Stücke tsein kann die Mitochondrienmembranen beschädigen. - Spin der IBM2 / Gewebehomogenisat bei 8.000 × g für 10 min bei 4 ° C.
Hinweis: Dieser Schritt kann in einem sauberen hohe Festigkeit Zentrifugenröhrchen für eine genauere Quantifizierung der Protein isolierten Mitochondrien in Schritt 4, da Rest BSA wiederholen kann, um den Gesamtproteingehalt beiträgt. - Entfernen Sie den Überstand und sanft, aber vollständig resuspendieren Sie das Pellet durch Zugabe von zwei 25 & mgr; l-Schritten IBM2 mit einer Pipettenspitze mit der Spitze abgeschnitten. Vorsichtig umrühren und mischen das Pellet nach jeder Zugabe von 25 ul IBM2. Dieses mitochondriale Lager auf Eis.
3. Homogenisierung Whole Gewebelysat (Zeit: ~ 45 min; kann getan werden während Schritt 7)
- Entfernen Sie den Muskel aus, dass in den flüssigen Stickstoff aus dem Schritt 2.3 gelegt und bei Raumtemperatur, bis sie vollständig aufgetaut.
- Hackfleisch das Gewebe für ~ 30 sec auf Eis mit feiner Spitze Schere.
- Fügen Sie zwei 100 ul Kugeln Zirconium-Perlen mit dem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss aus Schritt 3.2, die das zerkleinerte Gewebe enthält. Homogenisieren des Gewebes in einer Perlmühle Gewebehomogenisator mit zwei, um drei 5-Minuten-Zyklen bei einer Geschwindigkeitseinstellung von 4-6 (mittlere Einstellung).
- Spin der Mischung aus Schritt 3.3 bei 12.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand mit einer 1.000 ul Pipettenspitze nach dem Spin und Transfer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Entsorgen Sie das Pellet und platzieren Sie den Überstand auf Eis.
4. Proteinbestimmung (Zeit: ~ 30 min)
- Bestimmung der Proteinkonzentration des gesamten Gewebelysat (Schritt 3.4) und mitochondriale Lager (Schritt 2.17) unter Verwendung des BCA-Protein-Assay-Kit nach den Angaben des Herstellers.
5. Mitochondrien Membranintegrität; Citratsynthase (CS) Activity (Zeit: ~ 15 min)
- Machen Sie zwei 1: 20-Verdünnungen der mitochondrialen Lager in hochreinem Wasser. Hinzufügen0,1% Triton X-100 zu einer Probe und beschallen es bei einer niedrigen Einstellung (765 Watts, Amplitude 2). Lassen Sie die anderen Verdünnung auf Eis. Bringen Sie die Probe auf Eis nach der Beschallung.
- Führen Citratsynthase Assay sowohl die nicht-beschallte und beschallt mitochondrialen Verdünnungen mit einem spektrophotometrischen Test, wie zuvor beschrieben 11,12.
- Bestimmen Sie den Prozentsatz der intakten Mitochondrien-Membranen unter Verwendung der folgenden Gleichungen:
(Non-beschallt CS Aktivität ÷ beschallt CS-Aktivität) * 100
100- N (Prozent von oben erreicht)
6. Mitochondrien Isolation Qualität; Western Blot (Zeit: Nach Lab Protocol)
- Zuführen Western Blot auf die gesamte Gewebelysat und isolierte Mitochondrien, wie zuvor beschrieben 12.
Anmerkung: Die Verwendung Primärantikörper für GAPDH (1: 1.000 Verdünnung in 5% BSA / TBS-T) und COXIV (1: 1.000 Verdünnung in 5% fettMilch / TBS-T), gefolgt von anti-Ziege und Kaninchen-Sekundärantikörper, die jeweils (1: 10.000).
7. Respirometrische Testlauf (Zeit: ~ 90 min)
- Führen Sie gewünschte respirometrischen Tests unter Verwendung von Mikroplatten-basierten O 2 Verbrauchsmesstechnik, wie zuvor beschrieben (siehe Begleitartikel und Rogers et al 8).
- Bestimmen Sie die Atemkontrollverhältnis (RCR) durch Division State 3 durch staatliche 4o (RCR) oder Division Staat 3U durch staatliche 4o. Verwenden Sie entweder die mittlere (durchschnittliche) Punkt oder die höchste (State 3) und die niedrigsten Preise (State 4o) von den Punkt-zu-Punkt-Spuren bei der Ermittlung RCR.
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Representative Results
Citrat-Synthase-Aktivität als Maß für die Unversehrtheit der Membran, da Citratsynthase ist in der inneren Mitochondrienmembran, und sollte daher nicht in Suspensionen von Mitochondrien mit intakten Membranen vorliegen. 1 stellt Citrat-Synthase-Aktivität in nicht-beschallten mitochondrialen Proben verglichen, die mit beschallter Proben aus der gleichen Isolation. Beschallen der Mitochondrien führt zu einem statistisch signifikanten Anstieg der Citrat-Synthase-Aktivität (P <0,01). Wichtig ist, dass 92,5 ± 2,0% der Mitochondrien intakt waren nach der Trennung.
2 zeigt GAPDH und COXIV Expression in isolierten Mitochondrien und die ganze Skelettmuskelgewebe Lysat. GAPDH ist ein Protein im Cytosol lokalisiert sind, sondern kann auch im Kern nach der Translokation gefunden werden, während COXIV ist ein Protein der inneren Mitochondrienmembran gelegen. Expression von GAPDH und COXIV sind offensichtlich im gesamten tissue Lysat. Im isolierten Mitochondrien wird die Expression COXIV beobachtet, während nur schwache Banden von GAPDH offensichtlich sind. Diese Befunde zeigen, gute mitochondrialen Isolationen, mit wenig Verunreinigungen von nicht-mitochondrialen Komponenten während des Isolierungsverfahrens.
Figur 3 ist ein repräsentativer Rückverfolgung von O 2 Verbrauchsraten (OCR) gegen die Zeit für ein Kopplungsassay (10 mM Pyruvat / 5 mM Malat) aus Mitochondrien isoliert unter Verwendung dieses Protokolls und Mikrotiterplatte O 2 -Verbrauch Technologie durchgeführt wird. Jedes Panel für O 2 -Verbrauch in verschiedenen mitochondrialen Zustände wie durch Zufall und Williams 13 beschrieben. Die erste Platte darstellt basalen O 2 -Verbrauch oder Zustand 2 der zweiten Platte, nach der Injektion von ADP stellt maximale gekoppelt Atmung oder Zustand 3 der dritten Platte nach Injektion Oligomycin A (ein Inhibitor der Komplexe V), represents Atmung durch Protonenleck oder Staats 4o. Die vierte Platte nach Injektion FCCP stellt maximale entkoppelt Atmung oder Staats 3u. Schließlich wird das fünfte Panel nach der Injektion von Antimycin A, stellt die Hemmung der oxidativen Atmung. Die Atemsteuerungsverhältnis (RCR), ein Maß für die Funktion der Mitochondrien 1 wurde durch Dividieren State 3 durch staatliche 4o. Tabelle 4 zeigt die durchschnittliche RCR Werte für alternative Substratkopplungs Assays, die aus den Mitochondrien Ausbeute aus diesem Protokoll durchgeführt werden kann, berechnet. Wichtig ist, dass der O 2 -Verbrauch Tracing und die hohen RCR Werte stellen hoch funktioniert und verbunden Mitochondrien. RCR-Werte hierin angegebenen sind höher oder ähnliche als bisher mit ähnlichen Isolierung-Protokolle in murinen Skelettmuskel 7,14,15, so betont die hohe Qualität der Mitochondrien während dieses Verfahrens getrennt ausgewiesen.
Abbildung 1: Citrat-Synthase-Aktivität. Citratsynthase Enzymaktivität, wie spektrophotometrisch in nicht beschallt beschallt und Mitochondrien Minipreps bestimmt. Werte sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. ** p <0,01. Daten für n = 3 gepaart biologischen Replikaten und ausgedrückt in Bezug auf Protein mg. 
Abbildung 2:. Cytosolic und mitochondriale Protein-Expression in isolierten Mitochondrien und ganze Gewebelysat Beide isolierten Mitochondrien und ganze Gewebelysaten wurden mit COXIV und GAPDH-Antikörper immungeblottet. Die mitochondriale Protein, COXIV, zeigte sich in beiden Proben jedoch GAPDH war nur schwach in den isolierten Mitochondrien deutlich. Das Fehlen eines prominenten GAPDH Band in the isolierten Mitochondrien ist bezeichnend für kleine Verunreinigungen von nicht-mitochondrialen Quellen während des Isolierungsverfahrens.
Abb. 3: Repräsentative Rückverfolgung von Kopplungsassay mit Mitochondrien aus Maus-Skelettmuskel isoliert 10 mM Pyruvat / 5 mM Malat gekoppelt mitochondriale Atmung Test Kurven wie von Multi-Well-Messung von O 2 Verbrauch bestimmt. Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Mitochondriale Protein pro Vertiefung geladen betrug 2,5 & mgr; g. OCR = O 2 Verbrauchsrate; ADP = Adenosindiphosphat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanid- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A.
| Reagens | Lizenz Konzentration | | Schluss Volume | Masse gegeben | |
| (M) | (g / mol) | (ml) | (G) | |
| Tris / HCl, pH 7.4 | 2 | 157,56 | 250 | 78,8 |
| Tris / HCl, pH 7.4 | 1 | 157,56 | 250 | 39,39 |
| KCL | 1 | 74,55 | 500 | 37,28 |
| Tris-Base | 1 | 121,14 | 100 | 12.11 |
| EDTA, pH 8 | 0,5 | 416,2 | 100 ml (in 1 M Tris-Base) | 20.81 |
| EGTA, pH 7,2 | 0.1 | 380,35 | 100 (in 1 M Tris-Base) | 3,801 |
Tabelle 1: Herstellung von Stammlösungen.
| Reagens | Lizenz Konzentration | Masse gegeben | Endmolarität / Percent |
| (M) | (g oder ml) | ||
| Saccharose | - | 11,47 g | 67 mM |
| Tris / HCl, pH 7.4 | 2 | 12,5 ml | 50 mM |
| KCL | 1 | 25 ml | 50 mM |
| EDTA / Tris-Base, pH 8 | 0,5 | 10 ml | 10 mM |
| Im Wesentlichen FA Kostenlose BSA | - | 1 g | 0,20% |
| pH 7,4, 500 ml: 50 ml Aliquot und gefrier | |||
Tabelle 2: Herstellung von Isolationspuffer für Mitochondrien 1 (IBM1).
| Reagens | Lizenz Konzentration | Masse gegeben | Endmolarität / Percent |
| (M) | (g oder ml) | ||
| D-Mannit | - | 10,9 g | 200 mM |
| Saccharose | - | 7,188 g | 70 mM |
| EGTA / Tris-Base | 0.1 | 15 ml | 5 mM |
| Tris-HCl, pH 7,4 | 1 | 3 ml | 10 mM |
| pH 7,4, 300 ml: 15 ml Aliquot und gefrier | |||
Tabelle 3: Herstellung von Isolationspuffer für Mitochondrien 2 (IBM2).
| Substrat Medium | Endkonzentration | RCR |
| Pyruvat / Malate | 10 mm / 5 mM | 16,2 ± 4,6 |
| Succinat / Rotenon | 10 mm / 2 & mgr; M | 10,6 ± 3,8 |
| Palmitoyl L-Carnitin / Malate | 40 & mgr; M / 1 mM Malate | 6,7 ± 0,6 |
| Glutamat / Malate | 10 mm / 10 mM | 8,6 ± 0,4 |
Tabelle 4: Atemkontrolle Ratios Gekoppelte mitochondriale Atmung Assays Atemkontrollquoten nach ersten Mess O 2 Verbrauchswerte mit auf Mikrotiterplatte respirometrischen Tests, gefolgt von der Division maximale gekoppelt Atmung bestimmt (ADP angeregten Zustand 3) durch die Atmung durch Protonenleck (Oligomycin. Eine Antwort Staat 4o). Die Werte sind als mir zum Ausdruckeine ± SE. Mitochondriale Protein pro Vertiefung geladen betrug 2,5 & mgr; g für die Pyruvat / Malat und Succinat / Rotenon-Assays und 3,5 & mgr; g der mitochondrialen Protein pro Vertiefung für die Palmitoyl L-Carnitin / Malat und Glutamat / Malat-Assays.
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Discussion
Die hier vorgestellten Methoden liefern eine detaillierte Beschreibung eines mitochondrialen Isolierungsverfahren von minimalen Mengen (~ 75-100 mg) von Maus-Skelettmuskel. Dieses Isolierungsverfahren ist in der Lage, High-Functioning, reine Mitochondrien (~ 450 & mgr; g) zu ergeben, wie durch O 2 Verbrauchsraten, RCR-Werte, Maximal Citrat-Synthase-Aktivität und Proteinexpression von Immunoblotting nachgewiesen. Wichtig ist, dass die Mitochondrien von diesem Verfahren getrennt für mehrere respirometirc Assays mit auf Mikrotiterplatte O 2 -Verbrauch Technologie, die für einen hohen Durchsatz ermöglicht werden.
Die Isolierung der Skelettmuskulatur Mitochondrien erfordert oft harten Methoden, um Mitochondrien aus den umliegenden Bindegewebe und Strukturproteine 7,16 befreien. Folglich können Membranen der Mitochondrien gestört zu werden, wodurch die Aktivität (und damit die Genauigkeit) der mitochondrialen O 2 -Verbrauch bei nachfolgenden respirome Beeinträchtigungtric Assays. Durch Einschließen eines zusätzlichen Schritt der Zerkleinerung unter Verwendung von Rasierklingen nach Gewebeentnahme zu einem zuvor beschriebenen Protokoll 7 Gewebe, eine deutlich reduzierte Rotorgeschwindigkeit für motorische Homogenisierung möglich war (80 rpm vs. 1.600 rpm). Diese schon Homogenisieren und Resuspendieren Techniken führt zu einem hohen Prozentsatz von Mitochondrien mit intakten Membranen (92,5 ± 2,0%), wie aus Citratsynthase Aktivität nach dem Isolierungsverfahren beurteilt. Unsere Ergebnisse stimmen mit Asmann et al. 17, der zwischen 90-95% intakte Mitochondrien-Präparate nach der Isolierung aus menschlichen Skelettmuskel zu melden. Es ist wichtig zu beachten, dass die Messung Citrat-Synthase-Aktivität ist für die Messung der physikalischen Integrität der Mitochondrienmembranen besser geeignet und sollte nicht verwendet werden, um funktionelle Integrität der isolierten Mitochondrien beurteilen. Andererseits soll O 2 Verbrauchstests und Bestimmung von RCR aus diesen Assays verwendet werden meaSie sicher, dass die Funktion des isolierten Mitochondrien 1. Zusätzlich kann RCR auch als ein Indikator von gekoppelten Mitochondrien verwendet werden. Daher ist die OCR und mitochondriale Zustände innerhalb eines typischen Bereichs von der Pyruvat / Malat-Test 8, und die hohen RCR-Werte aus einer Vielzahl von respirometrischen Assays erhalten zeigt, dass die Mitochondrien aus diesem Protokoll ergeben, sind eng gekoppelt und sehr funktionell.
Isolierung von intakten und rein Mitochondrien hat wichtige Implikationen für respirometic Assays. Die Kontamination der Nicht-mitochondrialen Proteinen in der endgültigen mitochondrialen Präparation kann beim Laden ungleiche Mengen der mitochondrialen Protein zu jeder Vertiefung während des O 2 Verbrauchsmessungen, wodurch eine Verringerung der Genauigkeit der Vergleich zwischen den durchgeführten Versuchen unter Verwendung verschiedener Zubereitungen von Mitochondrien resultieren. Weiterhin Verunreinigung des mitochondrialen Präparation mit anderen atmenden Organellen (beispielsweise die Peroxisomen) can weiter zu verringern die Genauigkeit von O 2 Verbrauchsmessungen. Während des Isolierungsverfahrens die Gegenwart der inneren Mitochondrienprotein COXIV und Abwesenheit von einer prominenten Bande der cytosolischen (und möglicherweise Kern-) Protein, GAPDH, im isolierten Mitochondrien Präparation folgenden Immunoblotting indikativ für kleine Verunreinigungen von nicht mitochondrialen Quellen .
Es ist wichtig zu beachten, dass, obwohl die Isolierung eines gereinigten mitochondrialen Präparation ist wichtig im Hinblick auf die oben erwähnte, von größter Bedeutung ist die Aufrechterhaltung der Integrität der mitochondrialen Atmung Assays. Die äußere mitochondriale Membran kann leicht während des Isolierungsverfahrens beschädigt werden, was zur Freisetzung von Cytochrom c in das Isolationspuffer und damit zum Ratenbegrenzung während der O 2 -Verbrauch und die ATP-Synthese 18. Daher kann die Integrität der isolierten Mitochondrien durch Quantifizieren Cytochrom beurteilenec Proteinexpression in dem Überstand der mitochondrialen Präparation (Schritt 2.15, vor der Resuspension) und im isolierten Mitochondrien mit Western Blot. Cytochrom c sollte nicht in der mitochondrialen Präparation Stand vorhanden sein, wenn die Mitochondrienmembranen nach den Isolierungsverfahren sind intakt.
Alle Schritte dieses Protokolls sind wichtig, aber es gibt drei kritischen Schritte dieses Protokolls. Erstens ist das Zerkleinern von rotem Skelettmuskel mit drei verschiedenen Rasierklingen (Schritt 2.4) kritisch, da dieser Schritt ermöglicht die langsamere Rotorgeschwindigkeiten während der Stufe der Homogenisierung (Schritt 2.11). Zweitens ist die Leistungsfähigkeit vieler Schritte auf Eis oder in gekühltem Puffer kritisch, die Mitochondrien in einem Ruhezustand, bevor die Mikrotiterplatte respirometrischen Assays aufrechtzuerhalten. Schließlich ist von größter Bedeutung, die schonende Resuspension des Pellets in Mitochondrien IBM2. Schonendes Mischen hält mitochondrialen Integrität, die von entscheidender Bedeutung für eine genaue bzw. istirometic Assays.
Einige Einschränkungen dieser Technik sind erwähnenswert. Erstens, die benötigte Ausrüstung (zB Ultrazentrifuge, Motor angetrieben Homogenisator, etc.) zur Durchführung der Isolationsverfahren kann teuer werden. Darüber hinaus werden mehrere Methoden der Qualitätskontrolle erforderlich, um saubere und intakte Mitochondrien gewährleisten. Sobald jedoch die Forscher beherrscht des Isolierungsverfahrens werden die hochwertigen Mitochondrien ergab, dass in einer Vielzahl von Messungen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Western-Blots, enzymatische Assays, RT-PCR, PCR, H 2 O 2 Assays und Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Isolierungsverfahren wurde optimiert und für kleine Mengen von Maus-Skelettmuskel und Vorsicht modifizierten sollte bei dem Versuch, Isolierungstechniken von einem bestimmten Gewebe aus der gleichen Spezies erstrecken soll (und sogar auf den gleichen Gewebe verschiedener Spezies ) zu anderen Geweben / species. Für optimale Ergebnisse wird der Fachliteratur, die beste Option sein, wenn sie versuchen, um die besten Isolationsmethode für die beabsichtigten Gewebe / Arten zu finden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
| Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
| Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
References
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