Abstract
מיטוכונדריה שריר שלד מתפקד לשחק תפקיד בחילוף חומרים שינו נצפו עם הזדקנות, השמנת יתר וסוכרת סוג II. מבחני respirometric מיטוכונדריאלי מהכנות המיטוכונדריה מבודדות מאפשרים ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה, כמו גם קביעת המנגנון (ים) של פעולה של תרופות וחלבונים המווסתים את חילוף חומרים. נהלי בידוד נוכחיים לעתים קרובות דורשים כמויות גדולות של רקמה להניב מיטוכונדריה באיכות גבוהה הנדרשת למבחני respirometric. השיטות שהוצגו במסמך זה מתארים כיצד באיכות גבוהה מטוהרת מיטוכונדריה (~ 450 מיקרוגרם) יכול להיות מבודדים מכמויות מינימליות (~ 75-100 מ"ג) של שריר שלד עכבר לשימוש במדידות בדרכי הנשימה תפוקה גבוהה. אנחנו קבענו כי שיטת הבידוד שלנו מניבה 92.5 ± 2.0% המיטוכונדריה שלמה על ידי מדידת פעילות synthase ציטראט spectrophotometrically. בנוסף, ניתוח כתם מערבי במיטוכונדריה המבודדת הביא לביטוי הקלוש של cytosoחלבון Lic, GAPDH, והביטוי חזק של חלבון המיטוכונדריה, COXIV. היעדר להקת GAPDH בולט במיטוכונדריה המבודדת מעיד על זיהום קטן ממקורות שאינן המיטוכונדריה במהלך הליך הבידוד. והכי חשוב, מדידת שיעור O 2 הצריכה עם טכנולוגיה מבוססת מיקרו-צלחת וקביעת יחס הנשימה השליטה (RCR) למבחני מצמידים respirometric תערוכות בשילוב מאוד (RCR;> 6 לכל מבחני) ומיטוכונדריה הפונקציונלית. לסיכום, התוספת של צעד זהיר, נפרד והפחתת מהירות הומוגניזציה מנוע מונע משיטה שדווחה בעבר באופן משמעותי אפשרה את הבידוד של איכות גבוהה ומיטוכונדריה המטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר, כי תוצאות במיטוכונדריה בשילוב מאוד כי לנשום עם פונקציה גבוהה במהלך מבחני respirometirc microplate מבוססים.
Protocol
מחקרים בבעלי חיים בוצעו תחת פרוטוקול שאושר על ידי הטיפול בבעלי חיים המוסדי הוועדה השתמש בוירג'יניה מכון הפוליטכני ואוניברסיטת מדינה.
1. הגדרות (זמן: ~ 45 דקות)
- חנויות הפשרה קפוא של 0.25% טריפסין, בידוד מאגר למיטוכונדריה (IBM) 1 וIBM2 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- יש לשטוף את הזכוכית ומכשירים לנתח באתנול 70% ואחריו מים טוהר גבוהים.
- הכן 0.05% פתרון טריפסין 0.25% ממניות טריפסין על ידי דילול טריפסין חלק 1 ב 4 חלקים IBM1.
- מערבבים קוקטייל פרוטאז ומעכב phosphatase עם חיץ תמוגה תא (1: 100 יחס) בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge עם כובע בורג.
- 5 מיליליטר aliquot (5 מיליליטר / עכבר) של טריפסין 0.05% לצינור פלסטיק 15 מיליליטר.
- מנוע הגדר מונע homogenizer רקמות 80 סל"ד.
2. בידוד של שרירי שלד מיטוכונדריה (זמן: ~ 90 דקות)
- להרדים עכבר על ידי CO 2
- הסר שריר אדום מהארבעה הראשי והגסטרוקנמיוס השריר, הכולל את soleus (~ 75-100 כולל מ"ג) כפי שמתואר בשלבים הבאים:
- לקלף את העור לקראת העכבר.
- הסר את כרית השומן על נקודת המוצא הארבע ראשי. חותך את גיד שריר הארבעה הראשי, שמצורף לפיקת הברך עם מספריים קנס היטה.
הערה: ארבע ראשי מזוהה על ידי העמדה אנטומית שלה בחלק הקדמי של עצם הירך הפרוקסימלית. - לאט לגזור אָלָל בין העצם והשריר הארבע ראשי, תוך הימנעות עורק הירך, כדי לשחרר את השריר הארבעה הראשיים מהעצם. חותך את הגיד במספריים קנס היטה בנקודת המוצא בירך כדי לשחרר את השרירים הארבע ראשי ולמקם את השריר הארבע ראשי בPBS המקורר.
- הסר רקמת שומן נראית לעין על פני הארבע ראשי במספריים. הפוך את השריר הארבעה הראשיים על כך שהחלק מהשריר שמעל עצם הירך פונה uעמ '. פתח את השריר הארבע ראשי עם מלקחיים בתנועת פנינג. הסר את שני חלקי השריר אדומים גלויים מכל אונה עם מספריים עדינים היטה ומקום בכוס המכילה 5 מיליליטר של IBM1 המקורר.
הערה: שריר ארבע ראשי מופיע כשתי אונות עם פס של שריר אדום ממוקם בסמוך לקצה הלטרלי של כל אונה. - חותך את העור שמעל גיד אכילס עם מספריים עדינים הטה ולקלף את העור כלפי העכבר. חותך את גיד אכילס החשוף ולקלף את השריר לכיוון הגוף של העכבר.
- חותך את הגיד בcondyles הרוחב והמדיאלי של עצם הירך במספריים קנס היטה לשחרר הגסטרוקנמיוס ולמקם את הגסטרוקנמיוס מצורף לגידים שלה בPBS הצונן.
- הפוך את הגסטרוקנמיוס שוב ולקלף את שריר הסוליה והמקום לכוס המכילה 5 מיליליטר של IBM1 המקורר. מאוורר לפתוח הגסטרוקנמיוס. הסר את שלושת חלקים חזותיים אדומים שריר (שתי רצועות אדומות לרוחב והמדיאלי אחד שטחית) עם מספריים קנס היטהים ולהעביר אותם לכוס המכילה 5 מיליליטר של IBM1 המקורר.
- הסר ~ 75-100 מ"ג אחר של שריר אדום מהרגל השנייה של העכבר (כמתואר בשלב 2.2) ומקום לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם קוקטייל פרוטאז ומעכב phosphatase וחיץ תמוגה תא (50 מ"מ טריס-HCL, 1 mM EDTA, 150 מ"מ NaCl, 1% סולפט dodecyl נתרן, 0.5% deoxycholate נתרן, 1% Polyoxyethylene (9) nonylphenylether, מסועף. מייד Flash-להקפיא מדגם השני בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר במערב סופג (ראה שלב 6.1).
- מניחים משטח טרום צונן, שטוח פלסטיק על קרח בדלי גדול. יוצקים ירידה של IBM1 על גבי משטח הפלסטיק ולהשתמש בפינצטה כדי למקם את כל השרירים האדומים מחולקים (שלב 2.2.4 ו2.2.7) בטיפת IBM1. לרכך את רקמת השריר למשך 2 דקות באמצעות 3 סכיני גילוח קצה אחד על ידי סכיני גילוח משתנים כל שנייה 40.
- העברת הרקמה הטחון לכוס חדשה עם 5 מיליליטר של IBM1 הטרי על ידי לחיצה על משטח הפלסטיק על הכוס דואר ומגרד את השריר לתוך הכוס עם סכין גילוח. קח את הפתרון הזה ולנקז אותו דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ממוקמת על צינור חרוטי 50 מיליליטר.
- למחוק את הרקמה עם מגב משימה עדין ולאחר מכן להעביר אותו לתוך 5 מיליליטר של פתרון טריפסין 0.05%. להשתמש בפינצטה כדי להסיר את הרקמה ממגב המשימה.
- דגירה רקמת השריר על קרח למשך 30 דקות ב0.05% פתרון טריפסין.
- ספין 15 מיליליטר תערובת טריפסין / שרירים המכילים צינור חרוטי ב XG 200 דקות 3 על 4 מעלות צלזיוס.
- יוצקים את supernatant טריפסין לתוך מיכל פסולת וresuspend גלולה עם 3 מיליליטר של קרח IBM1 הקר. העברת הרקמה לצינור homogenizer זכוכית 45 מיליליטר. יש לשטוף את צינור חרוטי 15 מיליליטר עם 1.5 מיליליטר IBM1 אחר כדי לאסוף כל מדגם שנותר ולהוסיף את זה לצינור homogenizer הזכוכית.
- מניחים את צינור homogenizer הזכוכית לאמצע מילא מיכל כוס או פלסטיק עם קרח כדי homogenizer הזכוכית נע מינימאלי בתוך הכוס.
- מעבירים את homogenate הרקמה לצינור 15 מיליליטר חרוטי חדש ולשטוף את צינור homogenizer הזכוכית עם 6.5 מיליליטר של IBM1. יוצקים את IBM1 לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מכיל homogenate רקמות.
- ספין צינור חרוטי 15 מיליליטר ב 700 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בעדינות יוצק את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות חוזק גבוה זכוכית וזורקים את הכדור.
- ספין supernatant מהצעד מעל ב 8000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את supernatant IBM1 מחדש להשעות את הכדור על ידי הוספת 500 μl של IBM2 לאט. לחתוך את הקצה של קצה פיפטה ועדינות homogenize גלולה בIBM2 עם ערבוב ובחישת תנועות. להוסיף עוד 4.5 מיליליטר של IBM2 לתערובת לאחר גלולה מושעה באופן מלא.
הערה: הימנע מטחינה דקה מופרזת תוך שבירת חתיכות גלולה גדולות כמו tשלו עלול לגרום נזק לקרומי המיטוכונדריה. - ספין homogenate / רקמת IBM2 ב 8000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: שלב זה ניתן לחזור בצינור צנטריפוגות חוזק גבוה נקי לכימות חלבון מדויקת יותר של מיטוכונדריה המבודדת בשלב 4 מאז BSA שייר עשוי לתרום לכלל תכולת חלבון. - הסר את supernatant ועדינות, אבל לגמרי מחדש להשעות את הכדור על ידי הוספת שני 25 מרווחי μl של IBM2 עם קצה פיפטה עם הנקודה שלו מנותק. בעדינות מערבבים ולערבב את הכדור לאחר כל הוספה של 25 μl של IBM2. הנח מניית המיטוכונדריה זה על קרח.
3. Homogenization של כל הפריטים רקמות lysate (זמן: ~ 45 דקות, אפשר לעשות במהלך שלב 7)
- הסר את השריר שמהונח בחנקן הנוזלי מצעד 2.3 ודגירה בטמפרטורת חדר עד שהפשיר באופן מלא.
- לרכך את הרקמה ל~ 30 שניות על קרח עם מספריים קנס היטה.
- להוסיף שני 100 סקופים μl של Zirconium חרוזים אוקסיד לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם פקק הברגה מהשלב 3.2 שמכיל רקמה הטחון. Homogenize הרקמות בhomogenizer רקמות טחנת חרוז באמצעות 02:58 5 מחזורי דקות בהגדרת מהירות של 4-6 (הגדרה בינונית).
- ספין את התערובת מצעד 3.3 ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant באמצעות קצה פיפטה 1,000 μl לאחר הספין וההעברה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. זורק את הכדור ומניח את supernatant על קרח.
4. קביעת חלבון (זמן: ~ 30 דקות)
- קבע את ריכוז החלבון של כל lysate הרקמות (שלב 3.4) ומניית המיטוכונדריה (שלב 2.17) באמצעות ערכת assay חלבון BCA על פי המפרט של היצרן.
5. המיטוכונדריה ממברנה יושרה; ציטראט synthase פעילות (CS) (זמן: ~ 15 דקות)
- לעשות שני 1 נפרד: 20 דילולים של מניית המיטוכונדריה במים טוהר גבוהים. לְהוֹסִיף0.1% מטריטון 100-X למדגם אחד וsonicate אותו בעצמה נמוכה (765 ואט, המשרעת של 2). השאר את הדילול האחר על קרח. להחזיר את המדגם לקרח לאחר sonication.
- בצע assay synthase ציטראט עם שני שאינו sonicated וsonicated דילולים המיטוכונדריה באמצעות assay spectrophotometric כפי שתואר קודם לכן 11,12.
- לקבוע את אחוז קרומי המיטוכונדריה שלמים באמצעות המשוואות הבאות:
(פעילות CS ללא sonicated ÷ sonicated CS פעילות) * 100
100 N (אחוזים הושגו מלמעלה)
6. איכות בידוד המיטוכונדריה; מערבי סופג (זמן: על פי פרוטוקול מעבדה)
- לבצע מערבי סופג בכל lysate הרקמה ומיטוכונדריה המבודדת כפי שתואר לעיל 12.
הערה: נוגדנים ראשוניים השתמש לGAPDH (1: 1,000 דילול ב 5% BSA / TBS-T) וCOXIV (1: 1,000 דילול ב 5% דל שומןחלב / TBS-T) ואחריו האנטי-עז, ונוגדנים משני ארנב, בהתאמה (1: 10,000).
7. Respirometric Assay הפעלה (זמן: ~ 90 דקות)
- לבצע מבחני respirometric רצויים באמצעות טכנולוגית microplate מבוססת O 2 צריכת מדידה כפי שתואר לעיל (ראה מאמר נלווה ורוג'רס ואח '8).
- לקבוע את יחס שליטה בדרכי הנשימה (RCR) על ידי חלוקת המדינה 3 על ידי המדינה 4O (RCR) או חלוקת 3U מדינה על ידי 4O המדינה. השתמש באחת נקודת האמצע (ממוצעת), או (3 המדינה) הגבוהה ביותר ומחירים נמוכים (4O מדינה) מעקבות נקודה לנקודה בעת קביעת RCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פעילות synthase ציטראט משמשת כמדד לשלמות קרום מאז synthase ציטראט ממוקם בקרום המיטוכונדריה הפנימי, ובכך לא צריך להיות נוכח במתלים של המיטוכונדריה עם קרומים. איור 1 מייצג פעילות synthase ציטראט בדגימות של המיטוכונדריה-sonicated הלא לעומת sonicated דגימות מאותו הבידוד. Sonicating תוצאות מיטוכונדריה בעלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית בפעילות synthase ציטרט (P <0.01). חשוב לציין, 92.5 ± 2.0% של המיטוכונדריה היו שלמים הבאים הבידוד.
איור 2 מתאר GAPDH וביטוי COXIV במיטוכונדריה המבודדת וכל lysate רקמת שריר השלד. GAPDH הוא חלבון הממוקם בcytosol, אבל ניתן למצוא גם בגרעין לאחר טרנסלוקציה, ואילו COXIV הוא חלבון הממוקם בקרום המיטוכונדריה הפנימי. ביטוי של GAPDH וCOXIV ניכרים בכל Tisslysate UE. במיטוכונדריה המבודדת, ביטוי של COXIV הוא ציין, בעוד שרק להקות קלושות של GAPDH ניכרות. ממצאים אלה מצביעים על בידודי המיטוכונדריה טובים, עם זיהום קטן ממרכיבים שאינן המיטוכונדריה במהלך הליך הבידוד.
איור 3 הוא מעקב נציג של שיעורי O 2 הצריכה (OCR) לעומת זמן לassay צימוד (פירובט / 5 Malate מ"מ 10 מ"מ) שבוצעו ממיטוכונדריה מבודדת באמצעות פרוטוקול זה והופיע עם טכנולוגית צריכת microplate מבוססת O 2. כל פנל מייצג O 2 הצריכה במדינות שונות במיטוכונדריה כפי שתיארו סיכוי ו -13 וויליאמס. הפנל הראשון מייצג O 2 הצריכה בסיסית, או מדינת הפנל השני 2., לאחר ההזרקה של ADP, מייצג נשימה מקסימלי בשילוב, או מדינת הפנל השלישי 3., לאחר ההזרקה של oligomycin (מעכב של V מורכב), represeהנשימה NTS בשל דליפת פרוטון, או המדינה 4O. הפנל הרביעי, לאחר ההזרקה של FCCP, מייצג נשימה מקסימלי נחק, או 3U המדינה. לבסוף, הלוח החמישי, לאחר ההזרקה של Antimycin, מייצג את העיכוב של נשימה חמצוני. יחס הנשימה השליטה (RCR), מדד לתפקוד המיטוכונדריה 1, היה מחושב על ידי חלוקת המדינה 3 על ידי מדינת 4O. לוח 4 דיווחי ערכי RCR הממוצע למבחני צימוד מצע חלופיים שניתן לבצע מתשואת המיטוכונדריה מפרוטוקול זה. חשוב לציין, צריכת O 2 ההתחקות וערכי RCR הגבוהים מייצגים מאוד לתפקד ומיטוכונדריה בשילוב. ערכי RCR דיווחו במסמך זה הם גבוהים יותר או דומים מאשר דווח בעבר תוך שימוש בפרוטוקולי בידוד דומים בשרירי שלד עכברי 7,14,15, ובכך מדגישים את האיכות הגבוהה של מיטוכונדריה מבודדת בהליך זה.
איור 1: ציטראט synthase פעילות. פעילות אנזים ציטראט synthase כפי שנקבע בspectrophotometrically preps מיטוכונדריה-sonicated שאינו וsonicated. הערכים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM. ** P <0.01. הנתונים מייצגים n = 3 לזווג משכפל ביולוגי והביע ביחס למ"ג של חלבון. 
איור 2:. Cytosolic וביטוי חלבון המיטוכונדריה במיטוכונדריה המבודדת וlysate רקמה כל שתי מיטוכונדריה מבודדת וlysates רקמות השלם היו immunoblotted עם COXIV ונוגדני GAPDH. חלבון המיטוכונדריה, COXIV, היה ברור בשתי הדגימות, לעומת זאת GAPDH היה רק קלוש ניכר במיטוכונדריה המבודדת. היעדר להקת GAPDH בולט בהמיטוכונדריה המבודדת הדואר מעידה על זיהום קטן ממקורות שאינן המיטוכונדריה במהלך הליך הבידוד.
איור 3:. מעקב נציג של assay צימוד עם מיטוכונדריה מבודדת משרירי שלד עכבר 10 Malate מ"מ פירובט / 5 מ"מ בשילוב העתקים assay הנשימה המיטוכונדריאלי כפי שנקבע על ידי מדידה רב גם של O 2 הצריכה. הערכים באים לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן. חלבון מיטוכונדריאלי העמוס בכל טוב היה 2.5 מיקרוגרם. OCR = O 2 שיעור הצריכה; ADP = diphosphate אדנוזין; אוליגו = Oligomycin; FCCP cyanide- = קרבוניל 4 - phenylhydrazone (trifluoromethoxy); אנטי-א = Antimycin
| מֵגִיב | ריכוז מניות | נפח סופי | מסה נוסף | |
| (M) | (G / mol) | (מיליליטר) | (ז) | |
| טריס / HCl, pH 7.4 | 2 | 157.56 | 250 | 78.8 |
| טריס / HCl, pH 7.4 | 1 | 157.56 | 250 | 39.39 |
| KCL | 1 | 74.55 | 500 | 37.28 |
| טריס בסיס | 1 | 121.14 | 100 | 12.11 |
| EDTA, pH 8 | 0.5 | 416.2 | 100 מיליליטר (1 M טריס בסיס) | 20.81 |
| EGTA, pH 7.2 | 0.1 | 380.35 | 100 (ב 1 M טריס בסיס) | 3.801 |
טבלת 1: הכנת פתרונות מניות.
| מֵגִיב | ריכוז מניות | מסה נוסף | Molarity הסופי / אחוזים |
| (M) | (ז או מיליליטר) | ||
| סוכרוז | - | 11.47 גרם | 67 מ"מ |
| טריס / HCl, pH 7.4 | 2 | 12.5 מיליליטר | 50 מ"מ |
| KCL | 1 | 25 מיליליטר | 50 מ"מ |
| EDTA / טריס בסיס, pH 8 | 0.5 | 10 מיליליטר | 10 מ"מ |
| בעיקרו של דבר FA BSA חינם | - | 1 גרם | 0.20% |
| pH 7.4, 500 מיליליטר: Aliquot 50 מיליליטר והקפאה | |||
טבלה 2: הכנת בידוד המאגר למיטוכונדריה 1 (IBM1).
| מֵגִיב | ריכוז מניות | מסה נוסף | Molarity הסופי / אחוזים |
| (M) | (ז או מיליליטר) | ||
| D-Mannitol | - | 10.9 גרם | 200 מ"מ |
| סוכרוז | - | 7.188 גרם | 70 מ"מ |
| EGTA / טריס בסיס | 0.1 | 15 מיליליטר | 5 מ"מ |
| טריס- HCl, pH 7.4 | 1 | 3 מיליליטר | 10 מ"מ |
| pH 7.4, 300 מיליליטר: Aliquot 15 מיליליטר והקפאה | |||
טבלה 3: הכנת בידוד המאגר למיטוכונדריה 2 (IBM2).
| מצע בינוני | ריכוז סופי | RCR |
| פירובט / Malate | 10 מ"מ / 5 מ"מ | 16.2 ± 4.6 |
| Succinate / Rotenone | 10/2 מיקרומטר מ"מ | 10.6 ± 3.8 |
| Palmitoyl-קרניטין / Malate | 40 מיקרומטר / 1 מ"מ Malate | 6.7 ± 0.6 |
| גלוטמט / Malate | 10 מ"מ / 10 מ"מ | 8.6 ± 0.4 |
לוח 4: יחסי בקרת נשימה ליחסים יחד מיטוכונדריאלי נשימת מבחני נשימה שליטה כפי שנקבעו על ידי מדידת O 2 שיעורי הצריכה במבחני microplate מבוססים respirometric, ואחרי חלוקת נשימה מקסימלי בשילוב הראשון (ADP המאולץ המדינה 3) על ידי נשימה עקב דליפת פרוטון (Oligomycin. 4O מדינת תגובה). הערכים באים לידי ביטוי כSE ±. חלבון מיטוכונדריאלי העמוס בכל טוב היה 2.5 מיקרוגרם לפירובט / Malate וsuccinate / מבחני rotenone, ו -3.5 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה לכל גם ל- קרניטין / Malate palmitoyl ומבחני Malate גלוטמט /.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות שהוצגו במסמך זה מספקים תיאור מפורט של הליך בידוד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות (~ 75-100 מ"ג) של שריר שלד עכבר. הליך בידוד זה מסוגל להניב בתפקוד גבוה, מיטוכונדריה הטהורה (~ 450 מיקרוגרם) כפי שמעיד O 2 שיעורי הצריכה, ערכי RCR, פעילות synthase ציטראט מקסימלי וביטוי חלבון מimmunoblotting. חשוב לציין, מיטוכונדריה מבודדת מהליך זה יכול לשמש למבחני respirometirc מרובים עם טכנולוגית microplate מבוססת O 2 הצריכה המאפשרת לתפוקה גבוהה.
הבידוד של המיטוכונדריה שריר שלד לעתים קרובות דורש שיטות קשות לשחרר את המיטוכונדריה מרקמות חיבור וחלבונים מבניים 7,16. כתוצאה מכך, קרומי המיטוכונדריה יכולים להפוך שיבשו, ובכך לפגוע בפעילות (ובכך הדיוק) של O 2 צריכת המיטוכונדריה במהלך respirome הבאמבחני ש-בש. על ידי הכללת צעד נוסף של הרקמה המיותרת באמצעות סכיני גילוח לאחר כריתת רקמה לפרוטוקול שתואר קודם לכן 7, מהירות הרוטור מופחתת באופן משמעותי ליצירת הומוגניות מונעת במנוע הייתה אפשרית (סל"ד לעומת 1,600 80 סל"ד). טכניקות הומוגניזציה וresuspension העדינות אלה מובילים לשיעור גבוה של מיטוכונדריה עם קרומים (92.5 ± 2.0%), כפי שהוערכו מפעילות synthase ציטראט הבאה הליך הבידוד. הממצאים שלנו עולים בקנה אחד עם Asmann et al. 17, שדיווחו בין הכנות המיטוכונדריה שלמות 90-95% בעקבות בידוד משרירי שלד אנושיים. חשוב לציין כי מדידת פעילות synthase ציטראט היא מתאימה יותר למדידת שלמות פיזית של קרומי המיטוכונדריה ולא צריך לשמש כדי להעריך שלמות תפקודית של המיטוכונדריה המבודדת. מצד השני, יש להשתמש O 2 מבחני הצריכה ונחישות של RCR ממבחנים אלה למאה שבטוח הפונקציה של מיטוכונדריה המבודדת 1. בנוסף, RCR יכול לשמש גם כמדד למיטוכונדריה בשילוב. לכן, OCR ומדינות המיטוכונדריה בטווח אופייני מפירובט / assay Malate 8, ואת ערכי RCR הגבוהים המתקבלים ממגוון רחב של מבחני respirometric מצביעים על כך שהמיטוכונדריה נגזרת מפרוטוקול זה בחוזקה בשילוב ומאוד פונקציונלית.
בידוד של המיטוכונדריה שלמה וטהורה יש השלכות חשובות על מבחני respirometic. הזיהום של חלבונים שאינן המיטוכונדריה בהכנת המיטוכונדריה הסופית יכול לגרום לטעינת כמויות שווה של חלבון המיטוכונדריה היטב כל אחד במהלך מדידות O 2 הצריכה, ובכך להקטין את הדיוק של כל השוואה בין ניסויים שבוצע באמצעות תכשירים שונים של המיטוכונדריה. יתר על כן, (, למשל peroxisomes) CA זיהום של הכנת המיטוכונדריה עם האברונים נושמים אחריםn נוסף להקטין את הדיוק של מדידות O 2 הצריכה. הנוכחות של החלבון הפנימי של המיטוכונדריה, COXIV, והיעדר בולט של להקת cytosolic (ופוטנציאל גרעיני) חלבון, GAPDH, בimmunoblotting הכנת המיטוכונדריה המבודד הבא היא מעיד על זיהום קטן ממקורות שאינן המיטוכונדריה במהלך הליך הבידוד .
חשוב לציין כי למרות בידודה של הכנת המיטוכונדריה מטוהרת חשוב ביחס להוזכר לעיל, התחזוקה של שלמות המיטוכונדריה היא בעל חשיבות עליונה במבחני נשימה. קרום המיטוכונדריה החיצוני עלול להיפגע בקלות במהלך הליך הבידוד, שהוביל לבריחה של ציטוכרום C לחיץ בידוד ובכך הופך שיעור הגבלה בO 2 הצריכה וסינתזת ATP 18. לכן, את השלמות של מיטוכונדריה המבודדת ניתן להעריך עוד יותר על ידי כימות cytochromביטוי חלבון בר בsupernatant של הכנת המיטוכונדריה (שלב 2.15, לפני resuspension) ובמיטוכונדריה המבודדת עם מערבי סופג. ציטוכרום C לא צריך להיות נוכח בsupernatant הכנת המיטוכונדריה אם קרומי המיטוכונדריה הם שלמים הבאים נהלי הבידוד.
כל הצעדים של פרוטוקול זה הם חשובים, עם זאת יש שלושה שלבים קריטיים לפרוטוקול זה. ראשית, ברר בשריר שלד אדום עם שלושה סכיני גילוח שונים (שלב 2.4) הוא קריטי משום שצעד זה מאפשר למהירויות הרוטור איטיות במהלך שלב הומוגניזציה (שלב 2.11). שנית, הביצועים של צעדים רבים על קרח או במאגרים מצוננים הוא קריטיים כדי לשמור על המיטוכונדריה במצב מנוחה לפני מבחני respirometric מבוססים microplate. לבסוף, resuspension העדין של גלולה מיטוכונדריה לIBM2 הוא בעל חשיבות עליונה. ערבוב עדין שומר על יושרה של המיטוכונדריה, שהוא חיוני לשו"ת מדויקמבחני irometic.
מגבלות מסוימות של טכניקה זו הן שווים אזכור. ראשית, כל הציוד הדרוש (למשל, ultracentrifuge, homogenizer מנוע מונע, וכו ') כדי לבצע את הליך הבידוד יכול להיות יקר. בנוסף, יש צורך בשיטות בקרה איכות מרובות כדי להבטיח מיטוכונדריה נקייה ושלמה. עם זאת, ברגע שהחוקר הוא בקיא בהליך הבידוד, מיטוכונדריה איכות גבוהה הניבה שניתן להשתמש במספר רב של מדידות כוללים, אך לא מוגבל ל: כתמים מערביים, מבחני האנזימטית, RT-PCR, PCR, H 2 O 2 מבחני , ומדידות בדרכי הנשימה microplate תפוקה הגבוהה. חשוב לציין כי הליך בידוד זה כבר מותאם ושונה לכמויות קטנות של עכבר שריר ושלד זהירות יש לנקוט כאשר מנסה ליישם טכניקות בידוד מרקמות ניתנו מאותו המין (ואפילו לאותה רקמה ממינים שונים ) לרקמות אחרות / ספציפיes. לקבלת תוצאות אופטימליות, חיפוש בספרות יהיה האפשרות הטובה ביותר כאשר מנסים למצוא את השיטה הטובה ביותר עבור בידוד הרקמה / מינים המיועדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
| Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
| Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
References
- Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746 (2011).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
- Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
- Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
- Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
