Abstract
역기능 골격근의 미토콘드리아 노화, 비만과 형 당뇨병으로 관찰 변경된 대사의 역할을한다. 절연 미토콘드리아 제제로부터 미토콘드리아 호흡계 분석법은 약물 대사를 조절하는 단백질의 작용기구 (S)의 미토콘드리아 기능의 평가뿐만 아니라, 판정이 가능. 현재 분리 절차는 종종 호흡계 분석에 필요한 고품질 미토콘드리아를 수득 조직 대량을 요구한다. 본원에 제시된 방법 (~ 450 μg의)는 높은 처리량 호흡 측정에 사용하기 위해 마우스 골격근의 최소량 (~ 75-100 mg)을 분리 할 수있는 방법을 고품질로 정제 미토콘드리아 설명한다. 우리는 우리의 분리 방법은 분광 시트르산 합성 효소 활성을 측정하여 92.5 ± 2.0 %의 미토콘드리아 손상을 산출 것으로 판정. 또한, 고립 된 미토콘드리아의 웨스턴 블롯 분석은 cytoso의 희미한 식의 결과LIC 단백질, GAPDH 및 미토콘드리아 단백질, COXIV의 강력한 표현. 단리 된 미토콘드리아에 띄는 GAPDH 밴드의 부재는 분리 과정 동안 비 미토콘드리아 소스로부터 조금 오염을 나타낸다. 가장 중요한 것은, O (2) 소비 마이크로 플레이트 기반 기술과 속도와 고도의 결합을 보여줍니다 결합 호흡계 분석을위한 호흡 조절 비율 (RCR) 결정의 측정 (RCR을, 모든 분석을위한> 6) 및 기능 미토콘드리아. 결론적으로, 별도의 닦지 단계 첨가 및 상당히 이전에보고 된 방법의 모터 구동 균질화 속도를 감소시키는 것은 높은 기능 호흡 고도로 결합 미토콘드리아 결과 마우스 골격근의 소량으로부터 고품질 정제 미토콘드리아의 분리를 허용했다 마이크로 기반 respirometirc 분석 중.
Protocol
동물 실험 기관 동물 관리에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 버지니아 폴리 테크닉 연구소 및 주립 대학에서위원회를 사용했다.
1. 설정 (시간 : ~ 45 분)
- 37 ° C의 물을 욕조에 미토콘드리아 (IBM) 1 IBM2 0.25 % 트립신, 절연 버퍼의 해동 냉동 저장합니다.
- 유리 및 고순도 물 다음 70 % 에탄올에 해부 악기를 씻어.
- 4 부 IBM1 1 부 트립신을 희석하여 0.25 % 트립신 재고에서 0.05 % 트립신 솔루션을 준비합니다.
- 스크류 캡과 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 : (100 비율 1) 세포 용해 버퍼와 단백질 분해 효소와 포스 파타 아제 억제제 칵테일을 섞는다.
- 분취 량 5 ml를 15 ml의 플라스틱 튜브에 0.05 % 트립신 (5 ㎖ / 마우스).
- 설정된 모터 80 RPM으로 조직 균질기를 구동.
골격근 미토콘드리아 2. 분리 (시간 : ~ 90 분)
- CO 2로 마우스를 안락사
- 다음 단계에 설명 된대로 가자미근 (~ 75-100 mg의 총)을 포함하는 대퇴사 두근과 비복근 근육, 붉은 근육을 제거합니다 :
- 마우스쪽으로 피부 껍질.
- 대퇴사 두근 원점을 통해 지방 패드를 제거합니다. 뾰족한 가위로 슬개골에 부착 된 대퇴사 두근 건을 잘라.
참고 : 대퇴사 두근은 근위 대퇴골의 앞쪽 부분에 자사의 해부학 적 위치로 식별됩니다. - 뼈에서 대퇴사 두근을 해방, 대퇴 동맥을 피하면서 천천히, 뼈와 대퇴사 두근의 건막을 싹둑. 대퇴사 두근 근육을 해방하고 냉장 PBS의 대퇴사 두근 근육을 배치 대퇴골에 원점에서 뾰족한 가위로 힘줄을 잘라.
- 가위로 대퇴사 두근을 통해 눈에 보이는 지방 조직을 제거합니다. 그래서 대퇴골 위에 놓인 된 근육의 부분이 U를 향하도록 통해 대퇴사 두근 플립피. 패닝의 움직임에 집게로 대퇴사 두근 근육을 엽니 다. 냉각 IBM1 5 mL를 넣은 비커에 뾰족한 가위와 장소 각 로브에서 두 개의 눈에 보이는 붉은 근육 부분을 제거합니다.
참고 : 대퇴사 근육 각 엽의 측면 가장자리 근처에있는 붉은 근육의 스트립 두 엽으로 나타납니다. - 뾰족한 가위로 아킬레스 건을 덮는 피부를 잘라 마우스 향해 피부를 벗겨. 노출 아킬레스 건을 잘라 마우스의 몸으로 근육 껍질.
- 비복근을 해방하고 냉장 PBS에 그 힘줄에 부착 된 비복근을 배치 할 뾰족한 가위로 대퇴골의 외측과 내측 과두의 힘줄을 잘라.
- 이상 비복근 플립과 가자미 근육을 벗겨 차게 IBM1 5 mL를 포함하는 비커에 넣습니다. 팬 비복근을 엽니 다. 뾰족한 가위로 3 종류의 시각적 붉은 근육 부분 (두 측면과 하나의 내측 표면 빨간색 스트립)를 제거S 및 냉장 IBM1 5 ㎖을 함유하는 비이커에 옮긴다.
- (단계 2.2에 기재된 바와 같이) 마우스의 다른 레그에서 적색 근육의 또 다른 ~ 75 내지 100 mg의 분리하고 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 및 세포 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, 1 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 배치 mM의 EDTA, 150 mM의 염화나트륨, 1 % 소듐 도데 실 설페이트, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 1 % 폴리 옥시 에틸렌 (9) 노닐 페닐이. 즉시 블 롯팅 웨스턴에서 나중에 사용하기 위해 액체 질소에서이 제 2 샘플을 플래시 동결 분지 (단계 6.1 참조).
- 큰 양동이에 얼음에 미리 냉장, 평면 플라스틱 표면을 놓습니다. 플라스틱 표면에 IBM1 한 방울을 붓고 IBM1 방울의 단면 붉은 근육 (단계 2.2.4과 2.2.7)을 모두 배치 핀셋을 사용합니다. 변경 면도기 3 단일 에지 면도날마다 40 초를 사용하여 2 분 동안 근육 조직을 말하다.
- 제 위에 플라스틱 표면을 유지함으로써 새로운 IBM1 5 ㎖와 새로운 비이커 다진 조직을 이동시켜전자 비커와 면도날로 비커에 근육을 긁어. 이 솔루션을 가지고 50 ML 원뿔 튜브에 배치 된 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 배출.
- 섬세한 작업 와이퍼와 조직을 가릴 후 0.05 % 트립신 용액 5 ㎖로 옮긴다. 작업 와이퍼에서 조직을 제거하는 핀셋을 사용합니다.
- 0.05 % 트립신 용액에서 30 분 동안 얼음에 근육 조직을 배양한다.
- 4 ℃에서 3 분 동안 200 XG에 15 ML 원뿔 튜브 포함 트립신 / 근육 혼합물을 스핀.
- 폐기물 용기에 트립신 뜨는을 붓고 얼음 3 ㎖ 차가운 IBM1와 펠렛을 재현 탁. 45 ㎖의 유리 균질 튜브에 조직을 전송합니다. 나머지 샘플을 수집하고 유리 균질 관이를 추가하는 또 다른 1.5 ml의 IBM1에 15 ml의에게 원뿔 튜브를 씻어.
- 유리 균질이 비커 내에서 최소한의 이동 때문에 얼음 비커 또는 플라스틱 용기 충전 중간에 유리 균질 튜브를 놓습니다.
- 새로운 15ml의 원뿔형 튜브에 조직 파쇄 옮기고 IBM1 6.5 ml의 균질화 유리 튜브를 헹군다. 조직 균질 물을 포함하는 15ml의 원뿔형 튜브에 IBM1 붓는다.
- 4 ° C에서 10 분 동안 700g로 15 ml의 원추형 튜브 스핀. 부드럽게 유리 고강도 원심 분리기 튜브에 뜨는을 부어 펠렛을 폐기합니다.
- 4 ℃에서 10 분 동안 8,000 XG에서 위의 단계에서 뜨는 스핀.
- IBM1 상층 액을 제거하고 천천히 IBM2 500 μl를 추가하여 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 피펫 팁의 끝을 잘라 부드럽게 혼합 운동을 교반 IBM2에 펠릿을 균질화. 펠렛가 완전히 정지 한 후 혼합물에 IBM2의 또 다른 4.5 ML을 추가합니다.
T와 같은 더 큰 펠릿 조각을 파괴하면서 과도한 분쇄를 피하십시오 : 주자신은 미토콘드리아의 세포막에 손상을 줄 수 있습니다. - 4 ° C에서 10 분 동안 8,000 XG에 IBM2 / 조직 파쇄 스핀.
주의 :이 단계는 총 단백질 함량에 기여할 수있다 잔류 BSA 4 단계 이후에 격리 미토콘드리아 단백질보다 정확한 정량 깨끗한 고강도 원심 분리 튜브에서 반복 될 수있다. - 부드럽게 뜨는 및 제거,하지만 완전히 차단의 포인트 피펫 팁과 IBM2의 두 25 μL 단위를 추가하여 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 부드럽게 저어 IBM2 25 μL를 각각 첨가 한 후 펠렛을 섞는다. 얼음이 미토콘드리아 주식을 놓습니다.
전체 조직 해물 3. 균질화 (시간 : ~ 45 분; 단계에서 수행 할 수 있습니다 7)
- 즉, 단계 230에서 액체 질소에 넣고에서 근육을 제거하고 완전 해동 될 때까지 실온에서 배양한다.
- 뾰족한 가위로 얼음 ~ 30 초 동안 조직을 말하다.
- Zirco의 두 100 μL 개만 추가다진 조직을 포함 단계 3.2에서 스크류 캡으로 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 천년 산화물 비즈. 4-6 (매체 설정)의 속도 설정에서 3 개의 5 분주기를 이용하여 비드 밀 조직 균질 기에서 균질화 조직.
- 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에 단계 3.3에서 혼합물을 스핀. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 스핀 및 전송 후 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 상층 액을 제거합니다. 펠렛을 취소하고 얼음에 뜨는을 배치합니다.
4. 단백질 결정 (시간 : ~ 30 분)
- 제조업체의 사양에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 전체 조직 용 해물 (단계 3.4) 및 미토콘드리아 스톡 (단계 2.17)의 단백질 농도를 결정한다.
5. 미토콘드리아 막 무결성; 구연산 합성 효소 (CS) 활동 (시간 : ~ 15 분)
- 고순도 물에 미토콘드리아 주식의 20 희석 : 두 개의 1을 확인합니다. 더하다하나의 샘플에 트리톤 100-X의 0.1 % 및 낮은 설정 (765 와트, 2의 진폭)에 그것을 초음파 처리. 얼음에 다른 희석 둡니다. 초음파 후 얼음에 샘플을 돌려줍니다.
- 시트 레이트 신타 제와 분석을 수행 모두 비 초음파 처리하고, 이전에 기술 된 바와 같이 (11, 12)을 분광 분석을 이용하여 미토콘드리아 희석액 초음파.
- 다음 식을 사용하여 그대로 미토콘드리아 막의 비율을 결정 :
(비 초음파 CS 활성 ÷ 초음파 CS 활성) * 100
N은 100- (퍼센트 위에서 달성)
6. 미토콘드리아 격리 품질; 웨스턴 블로 팅 (시간 : 실험실 프로토콜에 따라)
- 이전 12 설명 된대로 전체 조직 해물과 격리 된 미토콘드리아에 웨스턴 블로 팅을 수행합니다.
참고 : GAPDH에 대한 사용 차 항체 (1 : 1000 희석 5 %의 BSA / TBS-T) 및 COXIV (1 : 1,000 희석 5 % 무 지방우유 / TBS-T 각각 반 염소, 토끼 이차 항체 (1 다음에) : 10,000).
7. 호흡계 분석 실행 (시간 : ~ 90 분)
- 전술 한 바와 같이 마이크로 기반 O 2 소비량 측정 기술을 이용하여 원하는 분석을 수행 호흡계 (컴패니언 문서 및 로저스 외 8 참조).
- 주 4O (RCR)에 의해 상태 3 분할 또는 주 4O 의해 주 3U 나누어 호흡 조절 비율 (RCR)를 결정한다. RCR을 결정할 때 포인트 - 투 - 포인트 흔적에서 중간 (평균) 점, 또는 가장 높은 (주 3), 저렴한 가격 (주 섭씨 40도)를 사용합니다.
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Representative Results
시트 레이트 신타 제 활성은 시트 레이트 신타이 양막 미토콘드리아 현탁액으로 존재해서는 안 따라서 미토콘드리아 내막에 위치되고, 이후 막 무결성을위한 수단으로서 기능한다. (1)이 초음파에 비해 비 초음파 미토콘드리아 시료에 시트 레이트 신타 제 활성을 나타내는 도표 같은 격리에서 샘플. 시트 레이트 신타 제 활성의 유의 한 증가 미토콘드리아 결과 (P <0.01)를 초음파 처리. 중요한 것은, 미토콘드리아의 92.5 ± 2.0 %는 격리 다음 그대로 있었다.
도 2는 고립 된 미토콘드리아 및 전체 골격근 조직 파쇄물에서 GAPDH 및 COXIV 발현을 나타낸다. GAPDH는 세포질에있는 단백질이지만 COXIV는 미토콘드리아 내막에있는 단백질 동안 또한 후에 핵 전좌에서 찾을 수있다. GAPDH와 COXIV의 발현은 전체 담배 마는에서 분명 있습니다UE 해물. GAPDH의 희미한 밴드 명백 동안 격리 된 미토콘드리아에서는 COXIV의 발현이 관찰된다. 이러한 연구 결과는 분리 절차를 수행하는 동안 비 미토콘드리아 구성 요소에서 약간의 오염과 좋은 미토콘드리아 아이솔레이션을 나타냅니다.
도 3은 이러한 프로토콜을 사용하여 단리 및 마이크로 기반 O 2 소비 기술로 수행 미토콘드리아에서 수행 결합 분석에 대한 O 2 소비율 (OCR) 대 시간 (10 mM의 피루브산 / 5mM의 말산)의 대표적인 추적이다. 각 패널은 O에게 기회와 윌리엄스 (13)에 의해 설명 된대로 다른 미토콘드리아 주에서 2 소비를 나타냅니다. 첫 번째 패널은 ADP의 주입 후 기초 O (2) 소비, 또는 주 2 두 번째 패널을 나타내는 oligomycin의 분사 (복합 V의 억제제), represe 후, 최대한의 커플 호흡, 또는 주 3. 세 번째 패널을 나타내는양성자 누출, 또는 주 섭씨 40도에 따른 국세청의 호흡. 네 번째 패널은 FCCP의 주사 후, 최대 비 결합 호흡, 또는 상태 3U를 나타냅니다. 마지막으로 다섯 번째 패널은 Antimycin의 주사 후, 산화 호흡의 억제를 나타냅니다. 호흡 조절 비율 (RCR), 미토콘드리아 기능 (1)의 측정은,이 프로토콜에서 미토콘드리아 수율로 수행 될 수있다 대안 적 기질 결합 분석법 4 리포트를 주 4O. 표에 의해 평균 RCR 값을 상태 3을 나누어 계산 하였다. 중요하게는, O 2 소비 추적 및 높은 RCR 값이 높은 기능과 결합 된 미토콘드리아 나타낸다. 본원에보고 된 RCR 값은 이전에 따라서이 절차 동안 격리 미토콘드리아의 높은 품질을 강조, 뮤린 골격근 7,14,15 유사한 분리 프로토콜을 사용하여보고 된 것보다 더 높거나 유사하다.
그림 1 : 구연산 합성 효소 활동. 비 초음파 및 초음파 미토콘드리아 최상의 상태로 준비에 분광 결정 구연산 합성 효소의 효소 활성. 값은 SEM ± 평균으로 표현된다. ** P <0.01. 데이터는 N = 3 생물 복제를 짝과 단백질 mg의 상대를 표명 나타냅니다. 
그림 2 :. 세포질과 격리 된 미토콘드리아와 전체 조직 해물에서 미토콘드리아 단백질 발현 고립 미토콘드리아 및 전체 조직 해물을 모두 COXIV와 GAPDH 항체와 immunoblotted했다. 미토콘드리아 단백질, COXIV 그러나 GAPDH는 희미하게 분명 격리 된 미토콘드리아에 있었다, 두 샘플에서 분명했다. 일의 저명한 GAPDH 밴드의 부재전자 절연 미토콘드리아 분리 과정 동안 비 미토콘드리아 소스로부터 조금 오염을 나타낸다.
도 3 :. 마우스 골격근에서 분리 미토콘드리아와 결합 분석의 대표 추적 10 mM의 피루브산 / 5mM의 말산 2 O 소비 멀티 웰 측정에 의해 결정되는 바와 같이 미토콘드리아 호흡 분석 트레이싱 결합. 값은 평균 ± 표준 편차로 표현된다. 잘 당로드 미토콘드리아 단백질은 2.5 μg의했다. OCR은 O (2) 소비 속도 =; ADP = 아데노신 디 포스페이트; 올리고 = Oligomycin; FCCP = 카르보닐기 시안화물 (4) - (트리 플루오 로메 톡시) 페닐; 안티 = Antimycin A를
| 시약 | 주식 농도 | | 최종 권 | 대량 추가 | |
| (엠) | (G / 몰) | (㎖) | (지) | |
| 트리스 / 염산, pH 7.4의 | (2) | 157.56 | (250) | 78.8 |
| 트리스 / 염산, pH 7.4의 | 1 | 157.56 | (250) | 39.39 |
| KCL | 1 | 74.55 | (500) | 37.28 |
| 트리스 자료 | 1 | 121.14 | (100) | 12.11 |
| EDTA, pH가 8 | 0.5 | 416.2 | 100 ㎖ (1 M 트리스 자료) | 20.81 |
| EGTA, pH가 7.2 | 0.1 | 380.35 | 100 (1 M 트리스 자료) | 3.801 |
표 1 : 주식 솔루션의 준비.
| 시약 | 주식 농도 | 대량 추가 | 최종 몰 농도 / 비율 |
| (엠) | (g 또는 ㎖) | ||
| 자당 | - | 11.47 G | 67 mM의 |
| 트리스 / HCL에, pH가 7.4 | (2) | 12.5 ml의 | 50 mM의 |
| KCL | 1 | 25 ml의 | 50 mM의 |
| EDTA / 트리스 자료, pH가 8 | 0.5 | 10 ml의 | 10 mM의 |
| 기본적으로 FA 무료 BSA | - | 1g | 0.20 % |
| pH가 7.4, 500 ml의 : 나누어지는 50 mL 및 동결 | |||
표 2 : 미토콘드리아 1 단열 버퍼 (IBM1)의 준비.
| 시약 | 주식 농도 | 대량 추가 | 최종 몰 농도 / 비율 |
| (엠) | (g 또는 ㎖) | ||
| D- 만니톨 | - | 10.9 g의 | 200 밀리미터 |
| 자당 | - | 7.188 g의 | 70 mM의 |
| EGTA / 트리스 자료 | 0.1 | 15 ml의 | 5 밀리미터 |
| 트리스 -HCl, pH 7.4의 | 1 | 3 ㎖ | 10 mM의 |
| pH가 7.4, 300 ml의 : 나누어지는 15 mL 및 동결 | |||
표 3 : 미토콘드리아 2 단열 버퍼 (IBM2)의 준비.
| 기판 중간 | 최종 농도 | RCR |
| 피루브산 / 말라 테 | 10 월 / 5 밀리미터 | 16.2 ± 4.6 |
| 숙시 네이트 / 로테 | 10 월 / 2 μm의 | 10.6 ± 3.8 |
| 팔미 토일 L- 카르니틴 / 말라 테 | 40 μm의 / 1 mM의 말라 테 | 6.7 ± 0.6 |
| 글루타민산 / 말라 테 | 10 월 / 10 mM의 | 8.6 ± 0.4 |
표 4 :. 먼저 최대 커플 호흡을 나눈 다음에 마이크로 기반 호흡계 분석과 O (2) 소비 속도를 측정하여 결정으로 결합 미토콘드리아 호흡 분석 실험 호흡 제어 비율에 대한 호흡 제어 비율 호흡으로 인해 양자 누출 (ADP 자극 된 상태 3) (Oligomycin 응답 상태 섭씨 40도). 값은 내게로 표현± SE. 잘 당로드 미토콘드리아 단백질은 팔미 토일 L- 카르니틴 / 말 산염 및 글루타메이트 / 말산 분석에 잘 당 미토콘드리아 단백질의 피루브산 / 말 레이트 및 숙시 네이트 / 로테 분석 2.5 μg의, 3.5 μg의했다.
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Discussion
본원에 제시된 방법은 마우스 골격근의 최소량 (~ 75-100 mg)을 미토콘드리아로부터 분리 절차의 상세한 설명을 제공한다. 이 분리 절차는 O 2 소비율, RCR 값, 최대 시트 레이트 신타 제 활성 및 면역에서 단백질 발현에 의해 입증되는 바와 같이 높은 작동, 순수한 미토콘드리아 (~ 450 μg의)을 수득 할 수있다. 중요한 것은,이 과정에서 분리 된 미토콘드리아는 높은 처리량을 가능 마이크로 기반 O 2 소비 기술 respirometirc 여러 분석에 사용될 수있다.
골격근의 미토콘드리아의 분리는 종종 결합 조직과 구조 단백질 7,16 주변에서 미토콘드리아를 해방 가혹한 방법을 필요로한다. 결과적으로, 미토콘드리아 막에 따라서 후속 respirome 미토콘드리아 동안 O 2 소비 활동 (및 정확도) 손상, 파괴 될 수있는⚻에 정해진 분석. 전술 한 프로토콜을 (7)에 조직 절제 후 면도날을 사용하여 조직의 닦지 추가 단계를 포함하여, 모터 구동 균질화 상당히 감소 로터 속도 (RPM 대 80 1,600 RPM) 수 있었다. 분리 절차에 따라, 시트 레이트 신타 제 활성 평가에서 이러한 완만 균질화 및 부유 기법, 양막 (92.5 ± 2.0 %)과 미토콘드리아의 높은 비율로 이끈다. 우리의 연구 결과는 Asmann 등. (17), 인간의 골격 근육에서 분리 다음 90-95% 그대로 미토콘드리아 준비 사이의보고와 일치한다. 이것은 시트르산 신타 활성을 측정하는 미토콘드리아 막의 물리적 무결성을 측정하는데 더 적합하고 절연 미토콘드리아 기능의 무결성을 평가하는 데 사용되어서는 안된다는 것이 중요하다. 한편, 이러한 분석에서 2 O 소비 분석법 및 RCR의 판정은 MEA에 표기격리 된 미토콘드리아 (1)의 기능을 확인하십시오. 또한, RCR은 또한 결합 된 미토콘드리아의 지표로 사용될 수있다. 따라서, 피루브산 / 말산 분석법 8 및 호흡계의 다양한 분석으로부터 얻은 RCR 높은 값에서 일반적인 범위 OCR 및 미토콘드리아 상태는이 프로토콜로부터 유도 된 미토콘드리아가 단단히 결합 된 고기능되는 것을 나타낸다.
그대로 순수 미토콘드리아의 분리 respirometic 분석에 대한 중요한 의미를 가지고있다. 최종 미토콘드리아 준비 비 미토콘드리아 단백질의 오염 따라서 미토콘드리아의 다른 제제를 사용하여 실험 중 어떤 비교의 정확성을 수행 감소, 잘 O (2) 소비 측정시 각 미토콘드리아 단백질의 불평등 한 양로드 될 수 있습니다. 또한, 다른 respiring 세포 소기관으로 미토콘드리아 준비의 오염 (예를 들어, 퍼 옥시 솜) CAN 2 O 상기 소비 측정의 정확도를 감소시킨다. 내부 미토콘드리아 단백질, COXIV, 우리 격리 미토콘드리아 제조 다음 면역의 세포질 (잠재적 핵) 단백질, GAPDH의 두드러진 밴드의 부재의 존재는 분리 과정 동안 비 미토콘드리아 소스로부터 조금 오염 나타낸다 .
이는 미토콘드리아 정제 제제의 분리는 상기 언급에 대한 중요하지만 미토콘드리아 무결성의 유지가 호흡 분석에서 가장 중요한 점을 유념해야한다. 외부 미토콘드리아 막 쉽게 분리 버퍼 시토크롬 C의 탈출 선도 따라서 O 2 소비와 ATP 합성 18시 속도 제한되고, 분리 과정 중에 손상 될 수있다. 따라서, 고립 된 미토콘드리아의 무결성은 더 cytochrom을 정량화하여 평가 될 수있다(이전에 재 부유 단계 2.15)과 웨스턴 블로 팅에 고립 된 미토콘드리아에있는 미토콘드리아 준비의 상층 액의 EC 단백질 발현. 미토콘드리아 막을 분리 절차에 따라 그대로있는 경우 시토크롬 C는 미토콘드리아 준비 상층 액에 존재하지 않아야합니다.
이 프로토콜의 모든 단계는 그러나이 프로토콜에 세 가지 중요한 단계가있다, 중요하다. 이 단계가 균질화 단계 (단계 2.11) 동안에 느린 회전 속도를 허용하기 때문에 처음 세 가지 면도날 (스텝 2.4)과 적색 골격근의 닦지 중요하다. 둘째, 얼음 또는 냉장 버퍼에 여러 단계의 성능은 종래 마이크로 호흡계 기반 분석법에 휴지 상태로 미토콘드리아를 유지하는 것이 중요하다. 마지막으로, IBM2에 미토콘드리아 펠릿의 부드러운 부유은 매우 중요하다. 부드러운 혼합 정확한 RESP에 대한 중요하다 미토콘드리아의 무결성을 유지irometic 분석.
이 기술의 몇 가지 제한 사항이 언급 할 가치가있다. 먼저, 장비가 필요 (예를 들면, 초 원심 분리기, 모터 구동 균질 기 등)를 수행하기 위해 분리 과정은 비용이 많이들 수있다. 또한, 다수의 품질 관리 방법은 깨끗하고 미토콘드리아 손상을 보장하기 위해 필요하다. 웨스턴 블롯, 효소 적 분석법, RT-PCR, PCR, H 2 O 2 분석법 : 연구자가 분리 절차 능숙 그러나, 일단, 고품질 미토콘드리아 그 포함한 측정의 다수에 사용 되나 이에 한정되지 수 수득된다 및 높은 처리량 마이크로 호흡기 측정. 그것은이 분리 절차 최적화 동일한 종으로부터 주어진 조직으로부터 분리 기술을 적용 할 때주의해야 마우스 골격근주의 소량 위해 변경되었음을 주목하는 것이 중요하다 (심지어 다른 종으로부터 동일한 조직 ) 다른 조직에 / 정시ES. 의도 된 조직 / 종에 가장 적합한 분리 방법을 발견 할 때 최적의 결과를 문헌을 검색하는 것이 최선의 선택이 될 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
| Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
| Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
References
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- Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
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