Abstract
Mitocondrias del músculo esquelético disfuncionales juegan un papel en el metabolismo alterado observado con el envejecimiento, la obesidad y la diabetes tipo II. Ensayos respirométricos mitocondrial de preparaciones mitocondriales aislados permiten la evaluación de la función mitocondrial, así como la determinación del mecanismo (s) de acción de los fármacos y las proteínas que modulan el metabolismo. Procedimientos de aislamiento actuales requieren a menudo grandes cantidades de tejido para producir las mitocondrias de alta calidad necesarias para los ensayos de respirométricos. Los métodos presentados en este documento describen cómo de alta calidad mitocondrias purificadas (~ 450 g) se puede aislar a partir de cantidades mínimas (~ de 75-100 mg) de músculo esquelético de ratón para su uso en mediciones respiratorias de alto rendimiento. Se determinó que nuestro método de aislamiento produce 92,5 ± 2,0% mitocondrias intactas midiendo la actividad de la citrato sintasa espectrofotometría. Además, el análisis Western blot en mitocondrias aisladas resultó en la expresión débil del cytosoproteína lic, GAPDH, y la expresión robusta de la proteína mitocondrial, COXIV. La ausencia de una banda de GAPDH prominente en las mitocondrias aisladas es indicativo de poca contaminación de fuentes no mitocondriales durante el procedimiento de aislamiento. Lo más importante, la medición de la tasa de consumo de O 2 con tecnología basada en micro-placa y la determinación de la relación del control respiratorio (RCR) para los ensayos de respirométricos acoplado muestra altamente acoplado (RCR;> 6 para todos los ensayos) y las mitocondrias funcionales. En conclusión, la adición de una etapa de picar carne separada y reduciendo significativamente impulsado por motor de velocidad homogeneización de un método reportado previamente ha permitido el aislamiento de alta calidad y mitocondrias purificada a partir de cantidades más pequeñas de ratón músculo esquelético que da como resultado en las mitocondrias altamente acoplados que respiran con alta función durante ensayos respirometirc basado en una microplaca.
Protocol
Los estudios en animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión en el Instituto Politécnico de Virginia y la Universidad Estatal.
1. Configuración (Tiempo: ~ 45 min)
- Tiendas Descongele de 0,25% de tripsina, Aislamiento Buffer de mitocondrias (IBM) 1 y IBM2 en un baño de agua a 37 ° C.
- Enjuague la cristalería y los instrumentos de disección en etanol al 70%, seguido de agua de alta pureza.
- Preparar una solución de tripsina al 0,05% desde 0,25% de tripsina stock de diluir 1 parte de tripsina en 4 partes IBM1.
- Mezclar proteasa e inhibidor de la fosfatasa cóctel con tampón de lisis celular (1: 100 ratio) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con tapón de rosca.
- Alícuota de 5 ml (5 ml / ratón) de 0,05% de tripsina en un tubo de plástico de 15 ml.
- Conjunto motor impulsado homogeneizador de tejidos a 80 RPM.
2. Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético (Tiempo: ~ 90 min)
- La eutanasia a un ratón por el CO 2
- Eliminar músculo rojo del músculo gastrocnemio y cuádriceps, que incluye el sóleo (~ de 75-100 mg total) como se describe en los siguientes pasos:
- Pelar la piel hacia el ratón.
- Retire la almohadilla de grasa por encima del punto de origen del cuádriceps. Cortar el tendón del cuádriceps que se adjunta a la rótula con unas tijeras de punta fina.
Nota: El cuádriceps se identifica por su posición anatómica en la parte anterior del fémur proximal. - Lentamente cortar la aponeurosis entre el hueso y el cuádriceps, evitando al mismo tiempo la arteria femoral, para liberar el cuádriceps de la médula. Cortar el tendón con tijeras de punta fina en el punto de origen en el fémur para liberar el músculo cuádriceps y colocar el músculo cuádriceps en PBS enfriado.
- Retire el tejido adiposo visible sobre los cuádriceps con tijeras. Voltear las cuádriceps de manera que la porción del músculo que se recubre el fémur se enfrenta up. Abra el músculo cuádriceps con fórceps en un movimiento en abanico. Retire las dos porciones musculares rojas visibles desde cada lóbulo con tijeras de punta fina y colocar en un vaso que contiene 5 ml de enfriado IBM1.
Nota: del músculo cuádriceps aparecen como dos lóbulos con una tira de músculo rojo situado cerca del borde lateral de cada lóbulo. - Cortar la piel que recubre el tendón de Aquiles con punta fina tijera y la cáscara de la piel hacia el ratón. Cortar el tendón de Aquiles expuesto y pelar el músculo hacia el cuerpo del ratón.
- Cortar el tendón en los cóndilos lateral y medial del fémur con tijeras de punta fina para liberar a los gemelos y colocar el gemelo unido a sus tendones en PBS frío.
- Da la vuelta al gastrocnemio una y pelar el músculo sóleo y colocarlos en el vaso que contiene 5 ml de enfriado IBM1. Fan abrir el gastrocnemio. Retire los tres porciones visuales rojos musculares (dos tiras rojas laterales y uno medial superficiales) con tijeras de punta finas y les traslado al vaso que contiene 5 ml de enfriado IBM1.
- Retire otra ~ 75-100 mg de músculo rojo de la otra pata del ratón (como se describe en el paso 2.2) y ponerlo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con proteasa e inhibidor de la fosfatasa cóctel y tampón de lisis celular (50 mM Tris-HCl, 1 EDTA mM, NaCl 150 mM, 1% de dodecilsulfato de sodio, 0,5% de desoxicolato de sodio, 1% de polioxietileno (9) nonilfeniléter, ramificada. Inmediatamente FLASH-congelar esta segunda muestra en nitrógeno líquido para su uso posterior en Western Blot (véase el paso 6.1).
- Coloque una superficie de plástico pre-enfriado, plana sobre hielo en un gran cubo. Vierta una gota de IBM1 sobre la superficie de plástico y utilizar pinzas para colocar toda la músculo rojo seccionado (paso 2.2.4 y 2.2.7) en IBM1 gotas. Picar el tejido muscular durante 2 minutos con 3 cuchillas de afeitar borde individuales cambiando las maquinillas de afeitar cada 40 seg.
- Transferir el tejido picado a un nuevo vaso de precipitados con 5 ml de IBM1 fresco mediante la celebración de la superficie de plástico sobre el the vaso de precipitados y raspando el músculo en el vaso de precipitados con una hoja de afeitar. Tome esta solución y drenarla a través de un filtro de células 100 micras colocado sobre un tubo cónico de 50 ml.
- Seque el tejido con un limpiador tarea delicada y luego transferirlo a 5 ml de la solución de tripsina 0,05%. Utilice pinzas para retirar el tejido del limpiaparabrisas tarea.
- Incubar el tejido muscular en hielo durante 30 min en solución de tripsina 0,05%.
- Haga girar los 15 ml tubo cónico de mezcla que contiene tripsina / muscular a 200 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Verter el sobrenadante de tripsina en un contenedor de residuos y resuspender el precipitado con 3 ml de hielo frío IBM1. Transferir el tejido a un tubo de vidrio de 45 ml homogeneizador. Enjuague los 15 ml tubo cónico con otro 1,5 ml IBM1 reunir cualquier muestra restante y agregar esto a el tubo homogeneizador de vidrio.
- Coloque el tubo homogeneizador de vidrio en un lleno hasta la mitad vaso o recipiente de plástico con hielo por lo que el homogeneizador de vidrio se mueve mínimamente dentro del vaso de precipitados.
- Transferir el homogeneizado de tejido a un nuevo tubo cónico de 15 ml y enjuagar el tubo homogeneizador de vidrio con 6,5 ml de IBM1. Verter la IBM1 en el tubo cónico de 15 ml que contenía homogeneizado de tejido.
- Haga girar el tubo cónico de 15 ml a 700 g durante 10 min a 4 ° C. Vierta suavemente el sobrenadante en un tubo de centrífuga de alta resistencia vidrio y desechar el sedimento.
- Girar el sobrenadante de la etapa anterior a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante IBM1 y volver a suspender el sedimento añadiendo lentamente 500 l de IBM2. Corte el extremo de una punta de pipeta y homogeneizar suavemente el pellet en IBM2 con mezcla y agitación movimientos. Añadir otros 4,5 ml de IBM2 a la mezcla después el sedimento está totalmente suspendida.
Nota: Evite la trituración excesiva mientras que romper pedazos de pellets de mayor tamaño como tsu puede dañar las membranas mitocondriales. - Haga girar el homogeneizado / tejido IBM2 a 8.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
Nota: Este paso puede repetirse en un tubo de centrífuga de alta resistencia limpia para la cuantificación de proteínas más precisa de mitocondrias aisladas en el paso 4 ya BSA residual puede contribuir al contenido total de proteínas. - Eliminar el sobrenadante y suavemente, pero totalmente volver a suspender el sedimento añadiendo dos incrementos de 25 l de IBM2 con una punta de pipeta con su punto de corte. Revuelva suavemente y mezclar la pastilla después de cada adición de 25 l de IBM2. Coloca esta población mitocondrial en hielo.
3. La homogeneización del Plenario del tejido lisado (Tiempo: ~ 45 min; se puede hacer durante el paso 7)
- Retire el músculo de que se colocó en el nitrógeno líquido desde el paso 2.3 y se incuba a temperatura ambiente hasta que esté completamente descongelado.
- Picar el tejido de ~ 30 seg en el hielo con unas tijeras de punta fina.
- Añadir dos cucharadas de 100 l de Zircoperlas de óxido nio al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con tapón de rosca desde el paso 3.2 que contiene el tejido picado. Homogeneizar los tejidos en un homogeneizador de tejidos molino de bolas utilizando dos o tres ciclos de 5 min con un ajuste de velocidad de 4-6 (posición media).
- Gira la mezcla de la etapa 3.3 a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante usando una punta de pipeta de 1.000 l después del giro y la transferencia en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Deseche la pastilla y colocar el sobrenadante en hielo.
4. Determinación de proteínas (Tiempo: ~ 30 min)
- Determinar la concentración de proteínas de todo el lisado de tejido (paso 3.4) y de la mitocondrial (paso 2,17) utilizando el kit de ensayo de proteína BCA de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
5. Las mitocondrias integridad de la membrana; Citrato sintasa (CS) Actividad (Tiempo: ~ 15 min)
- Haga dos separadas 1: 20 diluciones de la población mitocondrial en agua de alta pureza. Añadir0,1% de Triton X-100 a una muestra y sonicar que en un ajuste bajo (765 Watts, amplitud de 2). Deje el otro dilución en el hielo. Devuelva la muestra en hielo después de la sonicación.
- Realizar un ensayo de la citrato sintasa tanto con la no sonicado y se sonicó diluciones mitocondriales usando un ensayo espectrofotométrico como se describió previamente 11,12.
- Determinar el porcentaje de membranas de mitocondrias intactas mediante el uso de las siguientes ecuaciones:
(Actividad CS no sonicado ÷ sonicada CS actividad) * 100
100- N (porcentaje alcanzado desde arriba)
6. Las mitocondrias Calidad de aislamiento; Western Blot (Hora: De acuerdo con el Protocolo de Laboratorio)
- Realizar transferencia de Western en el lisado de tejido y mitocondrias aisladas como se ha descrito previamente 12.
Nota: Utilice los anticuerpos primarios para GAPDH (1: 1000 dilución en el 5% de BSA / TBS-T) y COXIV (1: 1000 dilución en el 5% sin grasaleche / TBS-T) seguido de anti-cabra y conejo anticuerpos secundarios, respectivamente (1: 10.000).
7. respirometría Ensayo Run (Tiempo: ~ 90 min)
- Realizar ensayos respirométricos deseados utilizando la tecnología de medición de consumo basado en una microplaca de O 2 como se ha descrito anteriormente (véase el artículo de compañía y Rogers et al 8).
- Determinar la relación de control respiratorio (RCR) dividiendo Estado 3 por 4o Estado (RCR) o dividir 3u Estado por Estado 4o. Utilice el punto medio (promedio), o el más alto (estado 3) y tarifas más bajas (4o Estado) a partir de los restos de punto a punto en la determinación de RCR.
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Representative Results
La actividad de la citrato sintasa sirve como medida para la integridad de la membrana desde la citrato sintasa se encuentra en la membrana mitocondrial interna, y por lo tanto no debe estar presente en las suspensiones de las mitocondrias con membranas intactas. La figura 1 representa la actividad de la citrato sintasa en muestras no se sonicaron mitocondriales en comparación con sonicado muestras de la misma aislamiento. Sonicando los resultados mitocondrias en un aumento estadísticamente significativo en la actividad de la citrato sintasa (P <0,01). Es importante destacar, 92,5 ± 2,0% de las mitocondrias estaban intactos tras el aislamiento.
La figura 2 muestra GAPDH y expresión COXIV en las mitocondrias aisladas y todo el lisado de tejido muscular esquelético. GAPDH es una proteína localizada en el citosol, pero también se puede encontrar en el núcleo después de la translocación, mientras que COXIV es una proteína localizada en la membrana mitocondrial interna. La expresión de GAPDH y COXIV son evidentes en todo el tisslisado ue. En las mitocondrias aisladas, se observa expresión de COXIV, mientras que sólo bandas débiles de GAPDH son evidentes. Estos hallazgos indican buenas aislamientos mitocondriales, con poca contaminación de componentes no mitocondriales durante el procedimiento de aislamiento.
Figura 3 es un trazado representativo de las tasas de consumo de O 2 (OCR) frente al tiempo para un ensayo de acoplamiento (10 mM piruvato malato mM / 5) realizadas a partir de mitocondrias aisladas utilizando este protocolo y realizados con tecnología de consumo basado en una microplaca O 2. Cada panel representa O 2 consumo en diferentes estados mitocondriales como se describe por casualidad y Williams 13. El primer panel representa basal consumo de O 2, o del Estado 2. El segundo panel, después de la inyección de ADP, representa el máximo junto respiración, o el Estado 3. El tercer panel, después de la inyección de oligomicina A (un inhibidor del complejo V), represents la respiración debido a la fuga de protones, o Estado 4o. El cuarto panel, después de la inyección de FCCP, representa el máximo de respiración desacoplado o 3u Estado. Finalmente, el quinto panel, después de la inyección de antimicina A, representa la inhibición de la respiración oxidativa. La proporción respiratoria control (RCR), una medida de la función mitocondrial 1, se calculó dividiendo Estado 3 Estado por 4o. Tabla 4 los informes de los valores medios de acoplamiento para los ensayos de RCR sustrato alternativos que se pueden realizar a partir del rendimiento mitocondrias de este protocolo. Es importante destacar que el consumo de O 2 rastreo y los altos valores RCR representan altamente funcionamiento y mitocondrias acopladas. Valores RCR registrados en ellas son más altos o similares que ya se ha informado a través de protocolos de aislamiento similares en el músculo esquelético murino 7,14,15, acentuando así la alta calidad de las mitocondrias aisladas durante este procedimiento.
Figura 1: citrato sintasa actividad. Citrato de actividad de la enzima sintasa como se determina espectrofotométricamente en Preps no sonicadas y se sonicó mitocondrias. Los valores se expresan como media ± SEM. ** p <0,01. Los datos representan n = 3 emparejado réplicas biológicas y expresa en relación a mg de proteína. 
Figura 2:. Citosólica y expresión de la proteína mitocondrial en mitocondrias aisladas y lisado de tejido completo Ambos mitocondrias aisladas y lisados de tejidos enteros se inmunotransfirieron con COXIV y anticuerpos GAPDH. La proteína mitocondrial, COXIV, fue evidente en ambas muestras, sin embargo GAPDH fue sólo débilmente evidente en las mitocondrias aisladas. La ausencia de una banda prominente GAPDH in the mitocondrias aisladas es indicativo de poca contaminación de fuentes no mitocondriales durante el procedimiento de aislamiento.
Figura 3:. Rastreo Representante de ensayo de acoplamiento con mitocondrias aisladas de músculo esquelético de ratón malato 10 mM piruvato / 5 mM junto mitocondriales trazados de ensayo de respiración tal como se determina mediante la medición de múltiples pocillos de O 2 consumo. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. Proteína mitocondrial cargado por pocillo fue de 2,5 g. OCR = O 2 Consumo Tarifa; ADP = difosfato de adenosina; Oligo = oligomicina A; FCCP = Carbonyl cianuro 4 - (trifluorometoxi) fenilhidrazona; Anti-A = antimicina A.
| Reactivo | Stock Concentración | | Volumen final | Misa Agregado | |
| (METRO) | (g / mol) | (ml) | (gramo) | |
| Tris / HCl, pH 7,4 | 2 | 157.56 | 250 | 78.8 |
| Tris / HCl, pH 7,4 | 1 | 157.56 | 250 | 39.39 |
| KCL | 1 | 74.55 | 500 | 37.28 |
| Tris Base | 1 | 121.14 | 100 | 12.11 |
| EDTA, pH 8 | 0.5 | 416.2 | 100 ml (de 1 M Tris Base) | 20.81 |
| EGTA, pH 7,2 | 0.1 | 380,35 | 100 (en 1 M Tris Base) | 3,801 |
Tabla 1: Preparación de las soluciones madre.
| Reactivo | Stock Concentración | Misa Agregado | Molaridad final / Porcentaje |
| (METRO) | (go ml) | ||
| La sacarosa | - | 11,47 g | 67 mM |
| Tris / HCl, pH 7,4 | 2 | 12,5 ml | 50 mM |
| KCL | 1 | 25 ml | 50 mM |
| EDTA / Tris Base, pH 8 | 0.5 | 10 ml | 10 mM |
| Esencialmente FA gratuito BSA | - | 1 g | 0,20% |
| pH 7,4, 500 ml: Alícuota 50 ml y congelación | |||
Tabla 2: Preparación de aislamiento Buffer para mitocondrias 1 (IBM1).
| Reactivo | Stock Concentración | Misa Agregado | Molaridad final / Porcentaje |
| (METRO) | (go ml) | ||
| D-Manitol | - | 10,9 g | 200 mM |
| La sacarosa | - | 7.188 g | 70 mM |
| EGTA / Tris Base | 0.1 | 15 ml | 5 mM |
| Tris-HCl, pH 7,4 | 1 | 3 ml | 10 mM |
| pH 7,4, 300 ml: Alícuota de 15 ml y congelación | |||
Tabla 3: Preparación de aislamiento Buffer para mitocondrias 2 (IBM2).
| Sustrato Medio | Concentración final | RCR |
| Piruvato / Malate | 10 mM / 5 mM | 16,2 ± 4,6 |
| Succinato / rotenona | 10 mm / 2 M | 10,6 ± 3,8 |
| Palmitoil L-Carnitina / Malate | 40 mM / mM Malate 1 | 6.7 ± 0.6 |
| El glutamato / Malate | 10 mM / 10 mM | 8.6 ± 0.4 |
Tabla 4: Ratios de control respiratorios para relaciones acoplados mitocondrial respiración Ensayos respiratorias de control que determine primero medir O 2 tasas de consumo con ensayos respirométricos basados microplacas, seguido dividiendo máxima junto respiración (ADP estimulada Estado 3) por la respiración debido a la fuga de protones (oligomicina. Un 4o respuesta del Estado). Los valores se expresan como youna SE ±. Proteína mitocondrial cargado por pozo fue de 2,5 mg para el piruvato / malato y succinato / ensayos de rotenona, y 3,5 g de proteína mitocondrial por pozo para el palmitoil L-carnitina / malato y ensayos de malato de glutamato /.
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Discussion
Los métodos presentados en este documento proporcionan una descripción detallada de un procedimiento de aislamiento mitocondrial a partir de cantidades mínimas (~ de 75-100 mg) de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento de aislamiento es capaz de producir de alto funcionamiento, las mitocondrias pura (~ 450 g) como lo demuestra O 2 tasas de consumo, valores RCR, máxima actividad de la citrato sintasa y de expresión de proteínas de inmunotransferencia. Es importante destacar que las mitocondrias aisladas de este procedimiento se puede utilizar para múltiples ensayos respirometirc con O 2 tecnología de consumo basado en una microplaca que permite un alto rendimiento.
El aislamiento de las mitocondrias del músculo esquelético a menudo requiere métodos duros para liberar a las mitocondrias del tejido conectivo circundante y las proteínas estructurales 7,16. En consecuencia, las membranas mitocondriales pueden quedar interrumpido, perjudicando así la actividad (y por lo tanto la exactitud) de mitocondrial consumo de O 2 durante el posterior respiromeensayos tric. Al incluir una etapa adicional de tejido picado usando cuchillas de afeitar después de la escisión del tejido a un protocolo previamente descrito 7, una velocidad de rotor reducida significativamente para la homogeneización accionado por motor era posible (80 rpm vs. 1.600 rpm). Estas técnicas de homogeneización y resuspensión más suaves conduce a un alto porcentaje de las mitocondrias con membranas intactas (92,5 ± 2,0%), según la evaluación de la actividad de la citrato sintasa siguiendo el procedimiento de aislamiento. Nuestros hallazgos son consistentes con Asmann et al. 17, que informan de entre el 90-95% Preparaciones mitocondriales intactas después del aislamiento a partir de músculo esquelético humano. Es importante tener en cuenta que la medición de la actividad de la citrato sintasa es más adecuado para la medición de la integridad física de las membranas mitocondriales y no debe utilizarse para evaluar la integridad funcional de las mitocondrias aisladas. Por otro lado, los ensayos de consumo de O 2 y la determinación de RCR de estos ensayos se deben utilizar para meaque la función de las mitocondrias aisladas 1. Además, RCR también se puede utilizar como un indicador de las mitocondrias acopladas. Por lo tanto, el OCR y estados mitocondriales dentro de un rango típico de la piruvato / ensayo malato 8, y los valores altos RCR obtenidos a partir de una variedad de ensayos respirométricos indica que las mitocondrias derivadas de este protocolo están estrechamente acoplados y altamente funcional.
El aislamiento de las mitocondrias intactas y puras tiene implicaciones importantes para los ensayos respirometic. La contaminación de proteínas no mitocondriales en la preparación mitocondrial final puede resultar en la carga de cantidades desiguales de proteína mitocondrial a cada pocillo durante las mediciones de consumo de O 2, disminuyendo así la exactitud de cualquier comparación entre los experimentos realizados utilizando diferentes preparaciones de mitocondrias. Además, la contaminación de la preparación mitocondrial con otros orgánulos que respiran (por ejemplo, los peroxisomas) can disminuir aún más la precisión de las mediciones de consumo de O 2. La presencia de la proteína mitocondrial interna, COXIV, y la ausencia de una banda prominente de la citosólica (y potencialmente nuclear) de proteínas, GAPDH, en nuestra preparación aislada mitocondrial siguiente inmunotransferencia es indicativo de poca contaminación de fuentes no mitocondriales durante el procedimiento de aislamiento .
Es importante tener en cuenta que, aunque el aislamiento de una preparación purificada mitocondrial es importante con respecto a la anteriormente mencionada, el mantenimiento de la integridad mitocondrial es de suma importancia en ensayos de respiración. La membrana mitocondrial externa puede ser dañado fácilmente durante el procedimiento de aislamiento, que conduce a la fuga de citocromo c en el tampón de aislamiento y convirtiéndose así en la limitación de velocidad durante el consumo de O 2 y la síntesis de ATP 18. Por lo tanto, la integridad de mitocondrias aisladas se puede evaluar aún más mediante la cuantificación de citocromoec expresión de la proteína en el sobrenadante de la preparación mitocondrial (paso 2,15, antes de la resuspensión) y en la mitocondria aislada con Western Blot. El citocromo c no debe estar presente en el sobrenadante preparación mitocondrial si las membranas mitocondriales están intactas después de los procedimientos de aislamiento.
Todos los pasos de este protocolo son importantes, sin embargo, hay tres pasos críticos a este protocolo. En primer lugar, el picado de músculo esquelético rojo con tres hojas de afeitar diferentes (paso 2.4) es fundamental, ya este paso permite velocidades de rotor más lentos durante la etapa de homogeneización (paso 2,11). En segundo lugar, el rendimiento de muchos pasos en el hielo o en tampones refrigerados es fundamental para mantener la mitocondria en un estado de reposo antes de los ensayos respirométricos basados microplacas. Por último, la resuspensión suave de la pelotilla mitocondrias en IBM2 es de suma importancia. Mezcla suave mantiene la integridad mitocondrial, que es crucial para resp exactaensayos irometic.
Algunas limitaciones de esta técnica son dignos de mención. En primer lugar, el equipo necesario (por ejemplo, ultracentrifugación, accionado por motor homogeneizador, etc.) para realizar el procedimiento de aislamiento puede ser costoso. Además, se necesitan métodos múltiples de control de calidad para garantizar la mitocondria limpios e intactos. Sin embargo, una vez que el investigador es competente en el procedimiento de aislamiento, las mitocondrias de alta calidad se produjeron que se puede utilizar en una multitud de mediciones incluyendo, pero no limitado a: Western blots, ensayos enzimáticos, RT-PCR, PCR, H 2 O 2 ensayos y mediciones respiratorias alta microplacas rendimiento. Es importante señalar que este procedimiento de aislamiento ha sido optimizado y modificado para pequeñas cantidades de ratón músculo esquelético y se debe tener cuidado cuando se trata de aplicar técnicas de aislamiento a partir de un determinado tejido de la misma especie (e incluso para el mismo tejido de diferentes especies ) a otros tejidos / especíes. Para obtener resultados óptimos, buscando la literatura será la mejor opción cuando se trata de encontrar el mejor método de aislamiento para los tejidos / especies destinadas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
| Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
| Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
References
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