Высокая пропускная способность<em> Данио Rerio</em> Анализ Расход энергии
Summary
Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.
Abstract
Данио рерио являются важным модель организма с присущими преимуществами, которые имеют потенциал, чтобы сделать данио широко применяется модель для исследования энергетического гомеостаза и ожирения. Небольшой размер рыбок данио позволяет анализы на эмбрионах, которые будут проводиться в формате 96- или 384-луночного планшета, технологии Морфолино и CRISPR основе содействия легкость генетических манипуляций, и медикаментозное лечение путем применения ванны является жизнеспособным. Кроме того, данио идеально подходят для передних генетических экранов, позволяющих открытие нового гена. Учитывая относительную новизну данио в качестве модели ожирения, необходимо развивать инструменты, которые в полной мере использовать эти преимущества. Здесь мы опишем метод для измерения расхода энергии в тысячи эмбрионального данио одновременно. Мы разработали целый животных микропланшетов платформу, в которой мы используем 96-луночных изолировать отдельные рыбу и мы оцениваем совокупный НАДН 2 производства с использованием коммерчески доступной культуры клеток жизнеспособность Reагент AlamarBlue. В холоднокровных отношения между НАДН 2 производства и расхода энергии тесно связано. Эти расходы энергии анализ создает потенциал для быстрого экранировать фармакологические или генетические манипуляции, которые непосредственно изменяют расход энергии или изменяют реакцию на прикладной препарата (например сенсибилизаторов инсулина).
Introduction
Мышь в настоящее время преобладает модель ожирения исследований. Короткий промежуток поколения и генетических инструментов, доступных в мышь были непревзойденной на сегодняшний день. Тем не менее, данио также имеет короткий промежуток поколения (3 – 4 месяца) и превосходит даже мышь в простоте генетической манипуляции 1,2. Данио поддерживает почти 90% генов млекопитающих, в то время как намного превышает мыши в количестве потомства и потенциалом для использования в генетических и наркотиков экранах 3.
Чтобы выявить потенциал данио модели для изучения в ожирения, анализы должны быть разработаны, чтобы исследовать факторы, влияющие на вес тела регулирования, в том числе расходов энергии. Как метаболиты проходят через бета-окисления и кислорода цикла трикарбоновых кислот потребляется и НАДН 2 производится. Таким образом, NADH 2 является прямым показателем потока метаболитов через метаболических путей (окисления метаболит). В poikilotherms, Н + утечка через внутреннюю митохондриальную мембрану, которая расцепле- НАДН 2 окисление от синтеза АТФ, составляет 4 – 5 раз ниже, чем в теплокровным 4. Соответственно, в данио NADH 2 очень тесно связан с АТФ через окислительного фосфорилирования. Здесь мы опишем анализа, который измеряет НАДН 2 производства в личиночной рыбок данио в качестве прокси для расхода энергии 5.
Потребление кислорода является золотым стандартом для измерения расхода энергии. Тем не менее, лучше всего воспользоваться высокой пропускной потенциал рыбок данио, анализы расходов энергии должен поддаваться высокой пропускной. Системы потреблением кислорода, которые зависят от закрытой камере система циркуляции ограничены в пропускной способности по количеству камер, доступных 6. На открытом воздухе O 2 потребление / СО 2 производственные анализы также применяются в данио 5,7. Они под открытым небом 96-а опорная плитаD Systems поддаются высокой пропускной способностью. К сожалению, газообмен с окружающей средой ограничивает чувствительность этих анализов. Мы недавно опубликовал заявление анализе, который контролирует NADH 2 с помощью индикатора окислительно-восстановительный AlamarBlue 5. Этот анализ позволяет преодолеть ограничения пропускной способности и чувствительности, общей для анализа потребления кислорода в данио.
Данио становится все более важным модель для изучения всей энергетической тело гомеостаза. В частности, потому, что у рыбок данио поддаются для использования в передних генетических экранов и экранов с наркотиками. Кроме того, целевые генетические манипуляции, в том числе и нокдаун нокаут в, может быть быстро применяется. Ранее мы показали, что этот анализ может быть объединен с применением ванны наркотиков и генной нокдаун или нокаут для идентификации соединений и генов, которые изменяют скорость метаболизма 5. Кроме того, этот анализ предназначен для использования высоких преимущества, присущие пропускной данио. </р>
Protocol
Representative Results
Discussion
Загрязнение бактерий или грибков значительно ограничивают применение этого анализа. Метиленовое синего эмбриона среды E3 ограничивает возможность грибкового заражения. На протяжении эмбриона воспитания важно, что осторожность, чтобы удалить мертвые эмбрионы два раза в день. Кроме то…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).
Materials
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
- Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
- Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
- Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53, 161-168 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish, A practical approach. , (2002).
- Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
- Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
- Flynn, E. J., Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549 (2012).
- Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).
