Summary
Tijdens fruitvlieg gevechten, de gedragspatronen waargenomen, vechten dynamiek, en de bijbehorende leren en geheugen worden beïnvloed door de experimentele omstandigheden. De hier gepresenteerde protocol beschrijft een nieuwe werkwijze die volledig elimineert hantering vliegen bij experimenten. Dit verbetert gevecht dynamiek en maakt de vorming van een sterke "verliezer" effecten.
Abstract
Agressief gedrag in Drosophila melanogaster bestaat uit de opeenvolgende expressie van stereotype gedragspatronen (analyse zie 1). Dit complex gedrag wordt beïnvloed door genetische, hormonale en omgevingsfactoren. Zoals in veel organismen, eerdere gevechten ervaring beïnvloedt de gevechten strategie van vliegen en het resultaat van latere wedstrijden: het verliezen van een gevecht verhoogt de kans op verlies later wedstrijden, onthullende "verliezer" effecten die waarschijnlijk te betrekken leren en geheugen 2-4. Het leren en geheugen dat de expressie van complexe sociale gedrag zoals agressie gepaard gaat, is gevoelig voor pre-test omgang met dieren 5,6. Vele experimentele procedures worden gebruikt in verschillende laboratoria agressie 09/07 echter geen routinematig gebruikte protocol dat uitsluit afhandeling van vliegen momenteel beschikbaar bestuderen. Hier melden wij een nieuwe gedrags-apparaat dat elimineert de behandeling van vliegen, met behulp instead hun aangeboren negatieve geotactic reacties op dieren te verplaatsen in of uit vechten kamers. In dit protocol zijn kleine ronde strijd arena's met een voedsel kopje verdeeld in twee gelijke helften door een verwijderbaar plastic slider voorafgaand aan het inbrengen van vliegen. Vliegen voer kamers van hun huis isolatie flesjes via schuifdeuren kamer deuren en geotaxis. Na verwijdering van plastic sliders, vliegen zijn vrij om te interageren. Na bepaalde tijd periodes, worden vliegen weer gescheiden door sliders voor verdere experimenten. Dit alles is eenvoudig te doen zonder de behandeling van individuele vliegen. Deze inrichting biedt een nieuwe benadering voor agressie en de bijbehorende leren en geheugen, zoals de vorming van "winnaar" effecten in vlieg gevechten bestuderen. Bovendien kan deze nieuwe general-purpose behavioral apparaat worden gebruikt om andere sociale gedrag van vliegen te bestuderen en moet, in het algemeen, van belang zijn voor het onderzoeken van ervaring gerelateerde veranderingen in de fundamentele gedrags-processen.
Introduction
Agressie in dierlijke systemen wordt sterk geassocieerd met het verwerven en houden van hulpbronnen zoals voedsel, grondgebied en vrienden. Gezien de belangrijke rol die deze speelt in de fitnessruimte van individuen, is het niet verwonderlijk dat de agressie zich heeft ontwikkeld over het dierenrijk. Als een adaptieve eigenschap die rechtstreeks ten goede mensen, is een sterke leren en geheugen component geassocieerd met agressie. In de competitie voor sociale rang, eerdere gevechten ervaring heeft invloed op de uitkomst van latere wedstrijden. In het algemeen eerdere verliezen ervaring toeneemt, en het winnen van ervaring vermindert de kans op verlies later wedstrijden (zogenaamde "winnaar" en "winner" effect). "Loser" effecten zijn waargenomen in een breed scala van soorten, en sommige rapporten suggereren dat deze kan duren voor meerdere dagen, terwijl "winner" effecten zijn meestal van kortere duur 2,10,11.
Het eerste verslag van agressief gedragin fruitvliegen (D. ampelophila) werd door Sturtevant in 1915 in een betrekking met seks erkenning en geslachtsselectie 12 papier. Een halve eeuw later, meer volledige onderzoek van de mannelijke fruitvlieg agressie werden gemaakt, dat de meeste van de gedragspatronen waargenomen tijdens fruitvlieg gevechten beschreven. Deze experimenten werden meestal uitgevoerd in kleine groepjes van mannelijke en vrouwelijke vliegen waargenomen gedurende 13-15 uur uitgevoerd. Onlangs, met de toevoeging van krachtige genetische hulpmiddelen, dyadische hetzelfde geslacht strijd opstellingen en kortere tijden van observatie, D. melanogaster is uitgegroeid tot een belangrijk model voor de studie van de biologie van agressie 1,16. Analyse gevechten tussen hetzelfde geslacht paren van mannelijke en vrouwelijke vliegen aangetoond dat agressie gaat stereotype gedragspatronen dat de overgang van de ene naar de andere in een statistisch betrouwbare wijze 1,17. Sommige van de gedragspatronen waargenomen zijn sekse-specifieke terwijl anderen zijn waargenomen in strijds in beide geslachten. Male gevechten naar hogere intensiteit dan vrouwelijke gevechten en leiden tot de vorming van dominantierelaties duidelijke "winnaars" en "verliezers". Op dit moment hebben veel laboratoria gestart onderzoek naar de biochemische 18, neurale 7,19-21, en genetische 22 onderbouwing van agressie. Helaas, een meta-analyse van studies om inzicht strijd dynamiek en de vorming en instandhouding van dominantierelaties problematisch krijgen door het gebruik van een veelheid van experimentele procedures in verschillende laboratoria. In wezen alle van de in de literatuur beschreven technieken omvatten behandeling en manipulatie van vliegen om ze te introduceren in arena's 19,23,24 en tijdens de gedrags-experiment 3,4 om vliegen te dragen uit arena's. Behoedzame aspiratie is de meest voorkomende manier om vliegen te manipuleren 3,4,23-25, maar koud of CO 2 anesthesie worden ook gebruikt 9,26, hoewel prige studies reeds hebben gemeld dat deze procedures hebben schadelijke effecten op vlieg gedrag 27,28. Een periode van ten minste 24 uur wordt aanbevolen na het gebruik van een verdovingsmiddel om hun effecten op het gedrag van 29,30 minimaliseren.
Vliegen leren van eerdere gevechten ervaring en hun gedragsproblemen gebruikspatroon in nieuwe situaties aan te passen, wat suggereert dat leren en geheugen te begeleiden en zijn de gevolgen van agonistische ontmoetingen. In die zin, vliegen gevechten lijken op operante conditionering leersituaties waarin vliegt leren dat een strategie heeft gewerkt en vervolgens gebruiken steeds vaker tijdens de daaropvolgende ontmoetingen. Vliegen veranderen hun gevechten strategieën na dominantie relaties tijdens gevechten zijn vastgesteld, met winnaars longeren meer en meer en verliezers minder en minder. Na een periode van scheiding eerdere losers toon meer onderdanig gedrag en zijn zeer waarschijnlijk verliezen 2e vecht wanneer gecombineerd met naïeve flies of eerdere winnaars 3,4. Echter, het ontbreken van een experimentele procedure die uitsluit hanteren van vliegen gedetailleerde studies van de "verliezer" effecten bemoeilijkt. In een recente studie vergeleken we twee experimentele procedures routinematig gebruikt in laboratoria (aspiratie en koud anesthesie) om vliegen te voeren in behavioral kamers om de nieuwe procedure die behandeling elimineert. De resultaten toonden aan dat koud verdoving had veel grotere negatieve effecten op agressie dan aspiratie, maar zelfs aspiratie verminderde het niveau van agressiviteit door vliegen. Aspiratie Wel veroorzaken zeer significante effecten op het leren en het geheugen dat agressie te begeleiden. Na identiek protocol met twee experimentele procedures (aspiratie en zonder behandeling), een robuuste "verliezer" effect werd alleen waargenomen wanneer de behandeling van vliegen werd geëlimineerd uit de experimentele procedure 5,6.
Idealiter studies van Drosophila agressie in laboratoria dienen milieu situaties die normaal vliegen tegenkomen in het wild (concurrentie voor de middelen, grondgebied te verdedigen en de ruimte om te ontsnappen) bevatten. Bovendien moet proefomstandigheden worden geoptimaliseerd betrouwbaar induceren observeren en het gedrag onderzochte interpreteren (proberen dier handling minimaliseren, beperken het gebruik van CO 2 als anestheticum en standaardiseren van de experimentele procedures). In een poging om de meeste of alle van deze problemen, hebben we een nieuwe gedrags apparaat dat bij de behandeling van vliegen elimineert vóór, tijdens en na het inzetten gedragsproblemen arena. Met deze inrichting, vliegen gebruiken hun aangeboren negatieve geotaxis te worden verplaatst en overgebracht naar en uit de strijd kamers. Doordat handling vliegen, het protocol beoogt: (a) reduceren de gedrags variabiliteit tussen individuen; (b) verlagen van de tijd die nodig is voor vliegen om te communiceren en het genereren van duidelijke dominantie relaties (mannen); en (c) op betrouwbare wijze te induceren sterk genoeg gedragsproblemenral veranderingen in de vorming van "verliezer" effecten mogelijk te maken.
Dit protocol wordt een nieuwe experimentele inrichting en een stapsgewijze procedure agressie analyseren en de vorming van een sterke "winnaar" effect in D. toestaan melanogaster. Wij verwachten dat deze gedragsproblemen inrichting gemakkelijk kan worden aangepast voor de studie van andere sociaal gedrag vertoond door fruitvliegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Het volgende is een stap-voor-stap beschrijving van het experimentele protocol dat we gebruiken om betrouwbare triggering agressie tussen paren mannelijke fruitvliegjes (D. melanogaster). Deze procedure leidt tot de vorming van een "winnaar" effect. Met behulp van dit protocol, een korte termijn "winner" effect ook is onlangs gemeld 5,6. Figuur 1 toont de tijdlijn van de gedragsexperimenten.
Figuur 1. Tijdlijn van agressie experiment. Op dag 1, laat stadium male poppen (als vleugels worden zwart) worden geïsoleerd vers bereid isolatie flesjes. Op dag 5 na opkomst als volwassenen, worden 4 dagen oude mannelijke vliegen verdoofd met CO 2 en geverfd met verschillende kleuren voor identificatiedoeleinden. Op dag 7, voedsel bekers en vechten kamers zijnbereid om het opzetten van de gedragsexperimenten. Twee 6-7 dagen oude volwassen mannen zijn in de kamers geplaatst en zijn in staat om samen te werken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Dag 1: Sociaal isolement van Poppen
- Heffen en vlieg voorraden aan te houden in een milieuvriendelijke gecontroleerde 12 uur licht / 12 uur donker cyclus incubator bij 25 ° C en 50% relatieve vochtigheid.
- Bereid isolatie flacons: Verwarm vers vlieg voedsel tot gesmolten. Met behulp van een Pasteur pipet ongeveer 1,5 ml gesmolten vlieg voedsel in enkele lege glazen reageerbuizen (1,6 x 10 cm). Laat het voedsel stollen.
- Isoleer poppen: Met een fijn penseel, verwijder voorzichtig een laat stadium mannelijke pop (wanneer de vleugels worden zwart) uit de voorraad flesje en plaats het op de zijkant van een vers bereide levensmiddelen die reageerbuis. Close isolatie flesjes met katoenen (figuur 2).
Figuur 2. sociaal isolement. Men laat stadium male pop wordt op de zijde van een vers bereide isolatie flacon. Isolatie flesjes die pop zijn in de 12 uur licht / 12 uur donker broedstoof geplaatst bij 25 ° C en 50% relatieve vochtigheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Dag 5: Het schilderen van de Vliegen voor individuele identificatie
- Voer deze stap op dag 5 met 4 dagen oude mannelijke vliegen en twee dagen voor de gedrags experimenten om de negatieve gevolgen van CO 2 anesthesie minimaliseren.
- Verdoven vlieg met CO 2. Met een fijne tandenstoker, plaats een kleine stip van acrylverf op de thorax. Plaats de verf op het hoofd, vleugels, buik en benen (figuur 3).
- Laat verf droog gedurende ongeveer 10 seconden en zacht overdracht vliegen terug naar hun oorspronkelijke isolatie flesjes.
- Terugkeer isolatie flacons naar 12 uur licht / 12 uur donker incubator bij 25 ° C en 50% relatieve vochtigheid.
Figuur 3. Individuele identificatie. Na verlamming vlieg met CO 2, een druppeltje acrylverf wordt aangebracht op de thorax. Voor individuele identificatie doel worden verschillende kleuren gebruikt (wit en blauw hier). Zie de uitleg hieronder over het gebruik van CO 2 bij deze stap. Klik hier om een grotere versie van deze Figu bekijkenopnieuw.
3. Dag 7: Voorbereiden van de Apparatuur
- Bereid Voedsel Cups:
- Verwarm vers vlieg voedsel tot het smelt.
- Met behulp van een Pasteur pipet ongeveer 0,8 ml voedsel aan het deksel van een schroefdop flacon (1,5 cm diameter 1 cm hoogte) en laat afkoelen. Vermijd luchtbellen.
- Maak verse gist pasta door het mengen van droge gist met een paar druppels water. Bij dik met een klein druppeltje gistpasta naar het midden van het voedselkop oppervlak met een tandenstoker (figuur 4).
Figuur 4. Het voorbereiden van het voedsel beker. Een voedingsmiddel beker is bereid met verse vlieg voedsel. Na het voedsel stolt, is een punt van gist pasta in het midden van het voedsel beker oppervlak. Klik hier om vIEW een grotere versie van deze figuur.
- Bereid Individuele Fighting Chambers:
- Grondig het apparaat en de individuele gevechten kamers met water voor gebruik elke keer. Droog met keukenpapier voor gebruik.
- Plaats een voedselkop in het midden van elke bestrijding kamer en fixeer met een druppel kit.
- Bedek vechten kamers met de inrichting klep (figuur 5).
- Plaats het apparaat in een omgeving met hoge vochtigheid (60%) bij 25 ° C.
- Plaats een lichtbron die boven het apparaat aan de gevechten kamers te verlichten en zet een videocamera voor het opnemen van boven.
Figuur 5. De voorbereiding van de individuele gevechten kamer. Het vers bereide gerechten kop met een punt van gist plakken op het oppervlak wordt bevestigd in gewassen individuele fivechtspel kamers. Chambers zijn gesloten met de twee-delige deksel waardoor het inbrengen van een ondoorzichtige plastic verdeler in afzonderlijke gevechten kamers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Dag 7: Behavioral Experiment
- Voer de gedragsexperimenten met 6-7 dagen oude mannelijke vliegen.
- Plaats plastic verdelers in elkaar vechten kamer.
- Verwijder de katoenen prop van de isolatie buis en plaats de buis onder een open gat aan de zijkant van de inrichting.
- Laat de vliegen te voeren in de strijd kamer door negatieve geotaxis, meestal binnen een paar seconden.
- Sluit de schuifwand na het viaduct de buis heeft verlaten en ging de kamer.
- Herhaal de procedure om de tweede vlieg in de strijd kamer te introduceren aan de andere kant van het apparaat.
- Plaats het apparaat weer in de verlichte videotaping positie.
- Beginnen met video-opname en verwijder de plastic verdeler te laten vliegen om te interageren.
- Voor Agressie Experimenten:
- In deze experimenten, opnemen strijdt gedurende tenminste 20 minuten om de vorming van sterke dominantierelaties waarborgen.
- Na de gewenste tijd, stopt de video-opname.
- Verwijder vliegen uit de gevechten kamers door het omkeren van de hierboven beschreven procedure.
- Grondig de gedrags-apparaat met zachte zeep en water na elk gebruik en spoelen.
- Voor "Loser" Effect Experimenten:
Opmerking: In deze experimenten, eerst gevechten beschouwd als de conditionerende fase en tweede gevechten als de testfase. De periode van rust tussen de gevechten kunnen verschillen maar 10 minuten maakt de vorming van een sterke "verliezer" effect.- Volg de hierboven beschreven om een eerste gevecht te voeren procedure.
- Kritische stap: Om de vorming van een "verliezer" mentaliteit, e inducerenNSure die eerste gevechten zijn minstens 20 minuten lang om sterke dominantie relaties. Na 20 min, opnieuw steek de plastic verdeler in gevechten kamers om de vliegen te scheiden.
- Na een 10 minuten periode van rust, verwijder voorzichtig de plastic verdeler te laten vliegen om samen te werken voor de tweede gevechten.
- Aan het einde van de tweede 20 min gevecht, stopt de video-opname.
- Verwijder vliegt van behavioral kamers als hierboven.
- Opnieuw grondig de gedrags inrichting.
- Voor Agressie Experimenten:
5. Behavioral Analysis
- Overbrengen Movies
- Sluit camera's aan op de computer.
- Omzetten MTS vliegt om vliegen .mov en meedoen films clips samen, met behulp van video omzetten van software en de optie "join geselecteerde clips".
- Observeren en elke film met video-reader software te analyseren.
- Scoren Gedrag
Let op: dit kan handmatig worden gedaan of met onsing gedragsanalyse programma software indien beschikbaar. De onderstaande afbeelding beschrijft een mogelijke handmatige analyse voor een "verliezer" effect.- Score tijde van de eerste ontmoeting tussen de vliegen op het eten beker (aard zijn wisselwerkingen tussen paren vliegen die ten minste 2 seconden duren) en het moment van verschijnen van de eerste uitval (een gedragspatroon waarbij een vlieg stijgt hoog op de achterpoten en klikt neer op en probeert de tegenstander te grijpen). Score dan de latentie longeren (het interval tussen de eerste ontmoeting en de eerste longe).
- Tel het totaal aantal ontmoetingen en lunges tijdens een gevecht.
Opmerking: Indien gewenst, men ook kan scoren andere gedragspatronen, zoals vleugel bedreiging, boksen, schermen, retraite of de nummers van ontmoetingen voor de eerste longe, bijvoorbeeld. - De score van de tijd van de oprichting van dominantie (tijd tussen de eerste ontmoeting en het tijdstip waarop men vliegt retraites gedurende drie opeenvolgende keer korting op het eten beker achterdeker ontvangen lunges). Notitie die vliegen is de winnaar en die de verliezer van de strijd.
- Berekenen van een "Loser" Effect
- Verdeel het aantal gevechten waarbij vorige verliezers verliezen 2e gevechten (Losers die verliezen: LL) door het totale aantal gevechten, en vermenigvuldig met 100. Het verkregen percentage vertegenwoordigt de "verliezer" effect:
[(# Vliegt LL) / (# totaal strijd)] x 100 - Gebruik een Chi-square test te vergelijken of de "winnaar" effect statistisch verschillend van de verwachte waarde van 50%.
- Verdeel het aantal gevechten waarbij vorige verliezers verliezen 2e gevechten (Losers die verliezen: LL) door het totale aantal gevechten, en vermenigvuldig met 100. Het verkregen percentage vertegenwoordigt de "verliezer" effect:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit gedeelte wordt het ontwerp van de gedrags-kamer en de analyse van een typische set van gedragsexperimenten de bovenstaande meten van agressie en de vorming van een "verliezer" effect beschreven protocol. Ook geïllustreerde zijn voorbeelden van andere gedragingen die kunnen worden gemeten met behulp van dit apparaat.
Figuur 6 toont een schematische voorstelling van de nieuwe inrichting. De inrichting bestaat uit drie cilindrische wells (afmeting: 22,86 mm diameter, 17 mm hoog) die de gevechten kamers zijn. De tweedelige afdekking sluit de gevechten kamers boven en maakt het inbrengen van een dunne ondoorzichtige plastic verdeler dat de kamers splitst in twee gelijke delen. Aan weerszijden van de inrichting, schuifwanden met drie gaten (15,88 mm) maken het laden van ongedierte in de strijd compartimenten door negatieve geotaxis vanaf hun isolement flacons. Na vliegen voer de gevechten kamers, de schuifwanden zijn gebruikd aan de zijkanten van alle kamers te sluiten. Op dit moment zijn de twee vliegen zijn in de strijd arena maar geen interactie vanwege de verdelers. Door het verwijderen van deze, de vliegen vrij om interactie en de daarop gedragspatronen kunnen worden afgelezen en geregistreerd.
Agressie experimenten: 38 gevechten tussen paren van wild type CS mannen werden uitgevoerd. Verschillende gedrags parameters werden gescoord tijdens het vliegen waren aan voedsel bekers en de dynamiek van de gevechten werden geanalyseerd (tabel 1). Een gemiddelde van 24 ontmoetingen (korte ontmoetingen tussen vliegen), 54 lunges (een indicator van hogere intensiteit vechten) werden waargenomen tijdens een 20 minuten tijd, met de 1e lunge tijdens de 2e ontmoeting meestal geleverd. Gemiddeld is de 1 ste ontmoeting, het 1 ste uitval en de tijd om dominantie waargenomen 2, 4 en 8 minuten na het begin van de opname. In de meeste gevallen, de laatste 12 min gevechten uit repetitieve sequenties van hoge intensiteit encoUnters met ondergeschikte dieren nadert, wordt aangevallen en zich terugtrekt, het versterken van de dominantie of onderdanige status van elk dier.
"Loser" effect experimenten: Om te zoeken naar de vorming van een "verliezer" effect, 21 1e gevechten van 20 min duur werden uitgevoerd tussen paren van wild type CS mannetjes uitgevoerd. De kamer schuifdeur werd daarna ingebracht om de vliegen scheiden. Na 10 minuten werden 2 nd 20 min uitgevoerd gevechten tussen (a) de voorafgaande verliezers en bekende winnaars of (b) voorafgaande verliezers en onbekende winnaars en deze werden geanalyseerd zoals hierboven (Figuur 7). In beide omstandigheden, 20 vorige verliezers verloren hun 2 e gevechten (95,5%), waaruit blijkt een robuuste "verliezer" effect. De strijd resultaten werden vergeleken met de verwachte waarde van 50-50 met een tweezijdige Chi-kwadraat analyse en een zeer significant "winnaar" effect gevonden. Andere gedragsveranderingen werden waargenomen in het verliezen van individuentussen de 1 e en 2 e vecht bij de vorming van de "verliezer" effect 5.
Ander gedrag dan agressie kan worden bestudeerd in het apparaat: te illustreren, werden verkering en motoriek experimenten uitgevoerd (T staat 2). Voor verkering, werden mannelijke en vrouwelijke vliegen door negatieve geotaxis geladen in de gedrags kamers, verdelers werden verwijderd en gedragsproblemen verkering patronen werden gescoord. 34 experimenten werden uitgevoerd en de latencies voor de rechter (tijd tussen de 1e ontmoeting en de 1e baltsgedrag = 7 sec) en paren (tijd tussen de 1e ontmoeting en paring = 4 min) werden geanalyseerd. Slechts 2 mannetjes slaagde er niet in copuleren tijdens de 15 min tijd van observatie. De vrijage Vigor Index (de fractie van de tijd dat mannen besteed vrijende vrouwen gedurende een periode van 15 min na de 1e verkering gedragspatroon) werd gescoord op 75% (tabel 2). Voor vervoer ofwel de zondegle vliegt of groep 10 vliegen werden in kamers en het aantal middellijn kruisingen gedurende 5 minuten geteld. Single vliegen steken de middellijn van de kamer gemiddeld 73 keer gedurende 5 min, terwijl de individuele vliegen in groepen steken de middellijn gemiddeld 45 keer / 5 min (tabel 2). Deze daling waargenomen wanneer vliegen zijn in groepen kan worden verklaard door de beperkte beschikbare ruimte per vlieg en door de tijd die ze besteden interactie met elkaar in plaats van het verkennen van het grondgebied.
Figuur 6. Schematische weergave van de gedragsmatige kamer. (A) Zijaanzicht van de inrichting. De nieuwe inrichting is opgebouwd uit drie afzonderlijke delen: (a) een kunststof blok met drie individuen bestrijding kamers; (b) twee verschuifbare wanden met drie gaten (15,88 mm diameter) in elk; en (c) de twee-delige deksel op de top. (B) Topvan de inrichting. De afmetingen van het kunststof blok (a) 36,83 mm bij 123,19 mm. Elke individuele fighting kamer een diameter van 22,86 mm en een hoogte van 17 mm. Gaatjes aan de zijkant dat de belading van de vliegen staan hebben een diameter van 15,88 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. De vorming van een solide "winnaar" effect. Een significant "winnaar" effect (percentage losers die 2 nd vecht wordt waargenomen wanneer previous verliezers werden gepaarde verliezen (a) met bekende winners (n = 21, p *** <0,0001) of (b) met onbekende winnaars voor hun 2e gevechten (n = 21, *** p <0,0001) (Lose: 95,5%, Win:. 4,5%, Remise) Plgemak klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gedrags parameters | Eenheid | (Sec) | n |
| Ontmoetingen | 24 ± 2 | 38 | |
| Lunges | 54 ± 6 | 38 | |
| Aantal ontmoetingen vóór 1 lunge | 2 ± 0,3 | 38 | |
| De tijd van de 1e ontmoeting | 145 ± 20 | 38 | |
| De tijd van de 1e longe | 229 ± 26 | 38 | |
| Tijd van overheersing | 475 ± 56 | 34 | |
| Latency te longeren | 87 ± 20 | 38 | |
| Latency dominantie | 342 ± 51 | 34 |
Tabel 1:. Dynamica van agonistische interacties tussen paren mannelijke vliegen gemiddelde waarden ± SEM berekend voor elke parameter gescoord als indicatoren agressiviteit. Het totaal aantal ontmoetingen en lunges, en het aantalvan ontmoetingen voor de 1e longe werden gescoord. Tijden van de 1e ontmoeting, 1 lunge en dominantie, en de latencies te longeren en dominantie worden gepresenteerd in sec ± SEM (n> 34).
| Gedrags parameters | (Sec) | Eenheid | (%) | n |
| Baltsgedrag | ||||
| Latency naar de rechter | 7 ± 3 | 34 | ||
| Latency te copuleren | 273 ± 62 </ td> | 32 | ||
| Verkering Vigor Index | 75 ± 0,05 | 34 | ||
| Voortbeweging | ||||
| Totaal middellijn kruisen (één vlieg) | 73 ± 4 | 48 | ||
| Totaal middellijn kruisen (groep vliegen) | 45 ± 3 | 20 |
Tabel 2:. Analyse van baltsgedrag en motoriek gemiddelde waarden ± SEM worden berekend voor de wachttijden voor de rechter en copuleren (in sec). Een vrijage daadkracht index(in% van de tijd besteed aan het hof na 1 vrijagevertoning) werd gescoord na mannetjes en vrouwtjes door negatieve geotaxis (n> 32) in behavioral kamers werden geladen. Voortbeweging, voor één vliegen of groepen 10 vliegen in kamers geladen werd gescoord door het tellen van het totaal aantal middellijn kruisingen gedurende 5 min (n = 48 en 20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het moderne tijdperk van het gebruik van Drosophila met zijn krachtige genetische methoden als modelorganisme voor de studie van agressie begon ongeveer een tiental jaar geleden met de introductie van nieuwe experimentele arena's waarin betrouwbare gevechten gedrag zou kunnen worden verkregen met een enkele paren van vliegen 1,7, 8,17,19. Deze arena's opgenomen gewenste middelen (een food cup, potentiële partners) en een ruimte voor verliezer vliegt terug te trekken in. Wanneer de resultaten verkregen met deze arena's werden toegevoegd aan voorkennis over fruitvlieg strijd gedrag werd Drosophila melanogaster stevig gevestigd als een zeer wenselijk modelsysteem voor het onderzoeken van een complex zoals agressie en wordt gebruikt in veel laboratoria. De opgetelde resultaten bleek dat: (a) vliegt vertonen agressie in de concurrentie voor voedsel middelen, toegang tot partners of voor de verdediging van het grondgebied 14,15; (b) gevechten bestaan uit een opeenvolgende reeks van stereotype gedragspatronen 1; (c)mannelijke en vrouwelijke vliegen vechten in hetzelfde geslacht paringen (sommige patronen zijn mannelijke specifieke, sommige zijn vrouwelijke specifieke en sommige zijn gedeeld door beide seksen) 17; (d) alleen mannelijke strijden naar hoge intensiteit en leiden tot de vorming van hiërarchische relaties duidelijke «winner" en "winnaar» vliegt 17; (e) een enkel gen vruchteloos, de geslachtsbepaling hiërarchie, bepaalt of vliegen vechten als mannen of vrouwen van 16 en (f) meerdere hormonale stoffen, waaronder aminen en peptiden beïnvloeden agressie bij fruitvliegen 7,8,19,20.
Hier wordt een nieuwe benadering beschreven voor de studie van fruitvlieg agressie waarin hantering vliegen bij experimenten wordt geëlimineerd. Dit biedt een aanzienlijke verbetering van het experimentele protocol alle gedragsmaten verbeterd 5,6, nieuwe informatie betreffende het gedrag is verkregen en het leren en het geheugen dat hoortmannelijke vlieg gevechten is sterk verbeterd. Ter illustratie zijn slechts twee eerdere studies de vorming van "winnaar" effecten in dit modelsysteem 3,4 gemeld. In beide, werden grotere kamers dan die beschreven in dit protocol gebruikt, vliegen werden in en uit de strijd arena's overgedragen door aspiratie, en langere strijd tijden en interval tijd tussen de gevechten nodig om duidelijk "verliezer" effecten genereren waren. Onze recente studie toonde aan dat het elimineren van de behandeling van de experimentele protocol, duidelijke dominantie relaties tussen paren van D. melanogaster mannelijke vliegen worden waargenomen na slechts 20 minuten van interactie. Deze tijd is voldoende om significante veranderingen in gevechten strategieën in beide vliegen veroorzaken tijdens de 1 ste gevechten en betrouwbaar te houden aan de vorming van sterke "verliezer" effecten in de 2 e gevechten. Bovendien, voor het eerst duidelijk kortdurende "winner" effecten werden ook waargenomen in 2 ndvecht 5,6.
Voor succes met dit protocol, moet een aantal kritische punten te worden opgemerkt. Te induceren en te observeren robuust agressieve gedragspatronen we raden het gebruik van 6-7 dagen oude mannelijke vliegen die zijn gehouden in een sociaal isolement sinds de late popstadium. In het algemeen is de beschikbare middelen die vliegt willen dan concurreren (voedsel, partners) zeer gewenst om sterke fighting gedrag en instelling van dominantierelaties verkrijgen. Tijdens dit protocol worden vliegen geschilderd na de anesthesie met behulp van CO 2, en die van belang kunnen zijn als onze onlangs gepubliceerde studie waaruit blijkt dat verlamming vliegen ernstig verstoort daaropvolgende gedrag 5. Mogelijke anesthesie voorkomen zou kunnen zijn om niet dieren schilderen als het niet belangrijk om bij individuen houden. Indien schilderen is echter nodig de anesthesie worden 48 uur voordat de dieren worden gebruikt voor experimenten of alternatieven voor identificatieOok individuen kunnen worden gebruikt 31. Sterke "verliezer" en "winnaar" effecten veroorzaken, is het cruciaal dat vliegen te vestigen en een dominantie relatie tijdens de eerste gevechten te houden. In de hier gepresenteerde protocol, met de wild-type stam CS bij 25 ° C, 20 min van interactie voldoende duidelijke "winnaars" en "verliezers" genereren en veranderingen in de strijd strategieën van zowel individuen waarnemen. In experimenten uitgevoerd bij verschillende temperaturen dan 25 ° C of met andere genotypes dan CS echter de gemiddelde tijd bestaan om een robuuste dominantieverhouding kunnen verschillen. Derhalve dient de gevechten periode ingesteld door het uitvoeren sets van voorlopige experimenten. Tot slot, hoe paren van vliegen worden gescheiden na hun eerste gevechten zou kunnen zijn belangrijk in de herinnering van de strijd resultaten. Het is waarschijnlijk belangrijk om beweging te beperken van de inrichting en zacht te zijn bij het invoeren van de kunststof verdeler teneindeom verstoring van de dieren zoveel mogelijk te beperken.
Het ontwerp van het apparaat en de twee-delige deksel waardoor de scheiding van de behavioral kamers in twee gelijke vakken, maken het gemakkelijk om de twee vliegen scheiden na de eerste gevechten en nieuwe tegenstanders te introduceren in 2e gevechten. Ook, zoals getoond in tabel 2, met kleine aanpassingen van het experimentele protocol, dezelfde inrichting kan worden gebruikt om vrijage, beweging of zelfs de meeste fruitvlieg gedragingen in welke dient minder stressvolle omstandigheden voor proefdieren te bestuderen. Mogelijke verdere verbeteringen aan de procedure zou kunnen zijn om enige vorm van thermostaat in het apparaat (piëzo-elektrisch element of spoel temperatuurgeregelde circuleren) om eenvoudig gebruik van temperatuurgevoelige reagentia (shibire TS1, dTRPA1 kanaal) toe te voeren.
Samengevat hebben we een nieuwe inrichting die een nieuwe strategie voor de studie van agressie i heeft ontwikkeldn fruitvliegen waarin handling vliegen vóór, tijdens en na de experimenten werd uitgeschakeld. Alle gedragsmaatregelen worden verbeterd met de nieuwe inrichting in vergelijking met enkele andere gemeenschappelijke manieren om met vliegen. Misschien een meer algemene opmerking te maken, is dat vrijwel alle behavioral experimenten in het laboratorium omgevingen te betrekken onderzoekers oppakken of op andere manieren met de dieren omgaat. Ondanks pogingen om zacht in deze behandeling, dit waarschijnlijk belastend voor de dieren. Het zou nuttig zijn om methoden te ontwikkelen om deze behandeling te elimineren indien mogelijk, zodat de dieren onder iets meer normale omstandigheden zou kunnen worden waargenomen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van het National Institute of General Medical Sciences (GM099883 en GM074675) naar EAK De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit te publiceren, of de bereiding van het manuscript. We bedanken de mensen van onze werkplaats aan de Harvard Medical School voor het ontwerp van de gedrags-apparaat (contact: http://mikesmachine.com).
Auteur bijdragen: ST, BC ontwierp de gedrags-apparaat. ST ontworpen en geoptimaliseerd het experimentele protocol. ST en BC uitgevoerd en de experimenten geanalyseerd. ST, EAK en BC schreef de krant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
- Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5664-5668 (2002).
- Hsu, Y., Earley, R. L., Wolf, L. L. Modulation of aggressive behaviour by fighting experience: mechanisms and contest outcomes. Biol Rev Camb Philos Soc. 81, 33-74 (2006).
- Yurkovic, A., Wang, O., Basu, A. C., Kravitz, E. A. Learning and memory associated with aggression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17519-17524 (2006).
- Penn, J. K., Zito, M. F., Kravitz, E. A. A single social defeat reduces aggression in a highly aggressive strain of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12682-12686 (2010).
- Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and 'loser' effect formation in Drosophila melanogaster. Learn Mem. 22, 64-68 (2015).
- Trannoy, S., Kravitz, E. A. Learning and memory during aggression in Drosophila: handling affects aggression and the formation of a ''loser'' effect. Journal of Nature and Science. 1 (3), e56 (2015).
- Alekseyenko, O. V., Chan, Y. B., Li, R., Kravitz, E. A. Single dopaminergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 6151-6156 (2013).
- Dierick, H. A., Greenspan, R. J. Serotonin and neuropeptide F have opposite modulatory effects on fly aggression. Nat Genet. 39, 678-682 (2007).
- Williams, M. J., et al. Regulation of aggression by obesity-linked genes TfAP-2 and Twz through octopamine signaling in Drosophila. Genetics. 196, 349-362 (2014).
- Chase, I. D., Bartolomeo, C., Dugatkin, L. A. Aggressive interactions and inter-contest interval: how long do winners keep winning? Anim. Behav. 48, 393-400 (1994).
- Goessmann, C., Hemelrijk, C., Huber, R. The formation and maintenance of crayfish hierarchies: behavioral and self-structuring properties. Behav Ecol Sociobiol. 48, 418-428 (2000).
- Sturtevant, A. H. Experiments on sex recognition and the problem of sexual selection in Drosophila. J Animal Behav. 5, 351-366 (1915).
- Jacobs, M. E. Influence of light on mating of Drosophila melanogaster. Ecology. 41, 182-188 (1960).
- Dow, M. A., von Schilcher, F. Aggression and mating success in Drosophila melanogaster. Nature. 254, 511-512 (1975).
- Hoffmann, A. A laboratory study of male territoriality in the sibling species Drosophila melanogaster and D. simulans. Anim. Behav. 35, 807-818 (1987).
- Vrontou, E., Nilsen, S. P., Demir, E., Kravitz, E. A., Dickson, B. J. fruitless regulates aggression and dominance in Drosophila. Nat Neurosci. 9, 1469-1471 (2006).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12342-12347 (2004).
- Fernandez, M. P., Kravitz, E. A. Aggression and courtship in Drosophila: pheromonal communication and sex recognition. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 199, 1065-1076 (2013).
- Alekseyenko, O. V., et al. Single serotonergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Current biology : CB. 24, 2700-2707 (2014).
- Asahina, K., et al. Tachykinin-expressing neurons control male-specific aggressive arousal in Drosophila. Cell. 156, 221-235 (2014).
- Andrews, J. C., et al. Octopamine neuromodulation regulates Gr32a-linked aggression and courtship pathways in Drosophila males. PLoS genetics. 10, e1004356 (2014).
- Zwarts, L., et al. Complex genetic architecture of Drosophila aggressive behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17070-17075 (2011).
- Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 2, 2712-2718 (2007).
- Wang, L., et al. Hierarchical chemosensory regulation of male-male social interactions in Drosophila. Nat Neurosci. 14, 757-762 (2011).
- Davis, S. M., Thomas, A. L., Nomie, K. J., Huang, L., Dierick, H. A. Tailless and Atrophin control Drosophila aggression by regulating neuropeptide signalling in the pars intercerebralis. Nat Commun. 5, 3177 (2014).
- Yuan, Q., Song, Y., Yang, C. H., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Female contact modulates male aggression via a sexually dimorphic GABAergic circuit in Drosophila. Nat Neurosci. 17, 81-88 (2014).
- Perron, J. M., Huot, L., Corrivault, G. W., Chawla, S. S. Effects of carbon dioxide anaesthesia on Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 18, 1869-1874 (1972).
- Joachim, D., Curtsinger, J. W. Genotype and anesthetic determine mate choice in Drosophila melanogaster. Behav Genet. 20, 73-79 (1990).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (1997).
- Cabral, L. G., Foley, B. R., Nuzhdin, S. V. Does sex trade with violence among genotypes in Drosophila melanogaster? PLoS One. 3 (4), e1986 (2008).
