Summary
Während Fruchtfliege Kämpfe, die Verhaltensmuster beobachtet, kämpfen Dynamik, und die damit verbundenen Lern- und Gedächtnis werden von experimentellen Bedingungen beeinflusst. Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt ein neues Verfahren, das vollständig eliminiert Handhabung von Fliegen während der Experimente. Dies verbessert Kampf Dynamik und ermöglicht die Bildung von starken "Verlierer" Effekte.
Abstract
Aggressives Verhalten in Drosophila melanogaster wird der sequentielle Expression der stereotype Verhaltensmuster zusammengesetzt (zur Analyse siehe 1). Dieses komplexe Verhalten durch genetische, hormonelle und Umweltfaktoren beeinflusst. Wie in vielen Organismen beeinflusst früheren Kampferfahrung die Kampfstrategie von Fliegen und das Ergebnis der späteren Wettbewerben: einem verlorenen Kampf erhöht die Wahrscheinlichkeit des Verlierens später Wettbewerbe und enthüllt "Verlierer" Auswirkungen, die wahrscheinlich beinhalten Lernen und Gedächtnis 2-4. Das Lernen und Gedächtnis, die die Expression von komplexen sozialen Verhaltensweisen wie Aggression begleitet, ist vor Test Umgang mit den Tieren 5,6 empfindlich. Vielen experimentellen Verfahren werden in verschiedenen Laboratorien verwendet, um Aggression 7-9 jedoch nicht routinemßig verwendete Protokoll das schließt Handhabung entfernt ist derzeit studieren. Hier berichten wir über eine neue Verhaltens Vorrichtung, die beseitigt Handhabung von Fliegen, mit instead ihre angeborene negativen geotactic Reaktionen auf Tiere in oder aus der Kampfkammern zu bewegen. In diesem Protokoll kleinen kreisförmigen Kampfarenen enthaltend ein Futternapf werden in zwei gleiche Hälften durch einen abnehmbaren Kunststoffschieber vor der Einführung der Fliegen unterteilt. Fliegen geben Kammern aus ihrer Heimat Isolierung Vials über Schleifkammertüren und Geotaxis. Nach dem Entfernen des Kunststoffgleitern, sind Fliegen frei zu interagieren. Nach bestimmten Zeitperioden werden entfernt wieder von Schiebereglern für die nachfolgenden Experimente getrennt. All dies wird leicht ohne Handhabung einzelner entfernt wurde. Dieses Gerät bietet einen neuartigen Ansatz zur Aggression und die damit verbundene Lernen und Gedächtnis, einschließlich der Bildung von "Verlierer" Effekte in fly Kämpfe zu studieren. Darüber hinaus kann dieses neue Mehrzweck-Verhaltens-Gerät verwendet, um andere soziale Verhaltensweisen von Fliegen lernen werden und sollte in der Regel sein, von Interesse für die Untersuchung von Erfahrungen im Zusammenhang mit Veränderungen in der grundlegenden Verhaltensprozesse.
Introduction
Aggression in der Tieranlagen ist stark mit dem Erwerb und der Besitz von Ressourcen wie Nahrung, Territorium und Kollegen verbunden. Angesichts der wichtigen Rolle dieses spielt in der Fitness von Individuen, ist es nicht verwunderlich, dass Aggression in der Tierwelt entwickelt. Als ein adaptives Merkmal, das direkt zugute Individuen wird eine starke Lernen und Gedächtnis-Komponente mit Aggression verbunden. Im Wettbewerb um die sozialen Rang, beeinflusst das Ergebnis der späteren Wettbewerben früheren Kampferfahrung. In der Regel vor Verlierer Erfahrung zu und gewinnen Erfahrung ab, die Wahrscheinlichkeit zu verlieren späteren Wettbewerben (so genannte "Verlierer" und "Gewinner" Effekte). "Loser" Effekte wurden in einer Vielzahl von Arten beobachtet worden, und einige Berichte deuten darauf hin, dass diese mehrere Tage dauern, während "Gewinner" Wirkungen sind in der Regel von kürzerer Dauer 2,10,11.
Der erste Bericht über aggressives Verhaltenin Fruchtfliegen (D. ampelophila) wurde durch Sturtevant 1915 in einer mit Sex Anerkennung und Geschlechtsselektion 12 betroffenen Papier. Ein halbes Jahrhundert später, vollständigere Untersuchung der männlichen Fruchtfliege Aggression wurden, dass die meisten der während der Fruchtfliege Kämpfe beobachtete Verhaltensmuster beschrieben. Diese Versuche waren meist in kleinen Gruppen von mehr als 13 bis 15 Stunden beobachtet, männliche und weibliche Fliegen durchgeführt. In jüngster Zeit mit der Zugabe von leistungsfähigen genetischen Werkzeuge, dyadische gleichgeschlechtlichen Kampf Setups und kürzere Zeiten der Beobachtung, D. melanogaster hat sich als wichtiges Modellsystem für das Studium der Biologie der Aggression 1,16 entstanden. Die Analyse der Kämpfe zwischen gleichgeschlechtlichen Paaren von männlichen und weiblichen Fliegen zeigten, dass Aggression beinhaltet stereotype Verhaltensmuster, die Übergang von einem zum anderen zu einer statistisch zuverlässige Weise 1,17. Einige der beobachteten Verhaltensmuster sind geschlechtsspezifisch, während andere im Kampf beobachtets bei beiden Geschlechtern. Männlich Kämpfe gehen zu höheren Intensitätsstufen als weibliche Kämpfe und führen zur Bildung von Dominanzverhältnisse mit klaren "Gewinner" und "Verlierer". Derzeit haben viele Labors begann die Untersuchung der biochemischen 18, neuronale 7,19-21 und genetische 22 Grundlagen der Aggression. Leider eine Meta-Analyse von Studien, um Einblick in Kampf Dynamik und die Bildung und Aufrechterhaltung der Dominanzbeziehungen ist problematisch aufgrund der Verwendung einer Vielzahl von experimentellen Verfahren in verschiedenen Labors erhalten. Im wesentlichen alle der in der Literatur beschriebenen Techniken beinhalten Handhabung und Manipulationen der Fliegen, um sie in Arenen 19,23,24 und während des Verhaltensexperiment 3,4 einzuführen Fliegen aus Arenen übertragen. Sanfte Aspiration ist der häufigste Weg, um Fliegen zu manipulieren 3,4,23-25, aber kalt oder CO 2 Anästhesie werden auch verwendet, 9,26, auch wenn previous Studien haben bereits berichtet, dass diese Verfahren haben schädliche Auswirkungen auf Flugverhalten 27,28. Ein Zeitraum von mindestens 24 h nach der Verwendung von Anästhetika empfohlen, ihre Auswirkungen auf das Verhalten 29,30 minimieren.
Fliegen lernen aus früheren Kampferfahrung und ihre Verhaltensmuster zu verändern Nutzung in neuen Situationen, was darauf hindeutet, dass Lernen und Gedächtnis zu begleiten und Folgen der agonistischen Begegnungen. In diesem Sinne, Fliegen Kämpfe ähneln operante Konditionierung Lernsituationen, in dem Fliegen zu lernen, dass eine Strategie hat funktioniert und es dann immer öfter bei der späteren Begegnungen. Fliegen ändern ihre Kampfstrategien nach dem Dominanzverhältnisse wurden während der Kämpfe etabliert, mit Gewinnern Longieren mehr und mehr und Verlierer immer weniger. Nach einer Zeit der Trennung vorherigen Verlierer zeigen viel mehr unterwürfige Verhalten und mit hoher Wahrscheinlichkeit 2. wenn gepaart mit naiven fl kämpft verlierenies oder vorherigen Gewinnern 3,4. Jedoch hat das Fehlen eines experimentellen Verfahrens gesetzt wird, das Handling von Fliegen detaillierte Studien "loser" Effekte erschwert. In einer aktuellen Studie verglichen wir zwei experimentellen Verfahren routinemäßig in Laboratorien (Aspiration und Kälte-Anästhesie) verwendet werden, um Fliegen in Verhaltenskammern an das neue Verfahren, das Handling eliminiert einzuführen. Die Ergebnisse zeigten, dass Kalt Anästhesie hatten viel größere negative Auswirkungen auf Aggression als Aspiration, sondern sogar Aspiration reduziert das Niveau der Aggressivität von Fliegen. Aspiration war jedoch zu hoch signifikante Auswirkungen auf das Lernen und Gedächtnis, die Aggression zu begleiten. Nach identischen Protokoll mit zwei experimentellen Verfahren (Aspiration und keine Behandlung), eine robuste "Verlierer" Effekt wurde nur beobachtet, wenn die Handhabung von Fliegen wurde von der Versuchsdurchführung 5,6 eliminiert.
Idealerweise Studium der Drosophila Aggression in labotorien sollten Umweltsituationen, die normalerweise in der Wildnis begegnen fliegt (Wettbewerb um Ressourcen, Territorium zu verteidigen und Raum zu entkommen) enthalten. Darüber hinaus sollten Versuchsbedingungen optimiert werden, um zuverlässig zu induzieren, zu beobachten und das Verhalten zu untersuch interpretiert werden (versuchen, die Behandlung der Tiere zu minimieren, die Verwendung von CO 2 als Narkosemittel zu begrenzen, und Standardisierung der experimentellen Verfahren). Bei dem Versuch, die meisten oder alle diese Probleme anzugehen, haben wir einen neuen Verhaltensgerät, das Handling von Fliegen beseitigt, bevor, während und nach den verhaltens Arenen ihre Einführung. Mit diesen Vorrichtungen verwenden Fliegen ihre angeborene negativen Geotaxis zu bewegt und in die und aus den Kampf Kammern übertragen werden. Durch den Wegfall der Handhabung von Fliegen, zielt darauf ab, das Protokoll an: (a) verringern die Verhaltens Variabilität zwischen Individuen; (b) verringern Sie die notwendige Zeit für Fliegen zu interagieren und erzeugen klare Dominanzverhältnisse (Männer); und (c) sicher zu induzieren stark genug behavioral Änderungen Bildung "Verlierer" Effekte erlauben.
Dieses Protokoll beschreibt eine neue experimentelle Vorrichtung und ein schrittweises Vorgehen, um Aggressionen zu analysieren und die Bildung einer starken "Verlierer" Effekt in D. ermöglichen melanogaster. Wir erwarten, dass dieser Verhaltensvorrichtung leicht für die Untersuchung von anderen sozialen Verhaltensweisen, die von Fruchtfliegen zeigte angepasst werden.
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Protocol
Hinweis: Nachfolgend finden Sie eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Versuchsprotokoll wir verwenden, um zwischen Paaren von männlichen Fruchtfliegen ermöglichen zuverlässige Auslösung der Aggression (D. melanogaster). Dieses Verfahren führt zur Bildung eines "loser" -Effekt. Über dieses Protokoll, um eine kurzfristige "Gewinner" Effekt wurde auch vor kurzem berichtet, 5,6. Abbildung 1 zeigt die Zeitleiste der Verhaltensexperimente.
Abbildung 1. Zeitleiste der Aggression Experiment. Am Tag 1 werden im Spätstadium männlichen Puppen (bei Flügeln werden schwarz) in frisch hergestellten Isolationsdurchstechflaschen isoliert. Am Tag 5 nach dem Austritt als Erwachsene, werden 4 Tage alten männlichen Fliegen mit CO 2 anästhesiert und mit verschiedenen Farben zur Identifikation lackiert. Am Tag 7, Lebensmittel Tassen und Kampfkammernbereit, die Verhaltensexperimente einzurichten. Zwei 6-7 Tage alten Männchen werden in die Kammern eingelegt und in der Lage sind, zu interagieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
1. Tag 1: Soziale Isolation der Puppen
- Raise und Pflege Fliegen Aktien in einer umwelt kontrollierten 12 Stunden Licht / 12 h Dunkel-Zyklus Brutschrank bei 25 ° C und 50% relativer Luftfeuchtigkeit.
- Bereiten Isolationsdurchstechflaschen: Erhitzen Sie frische fliegen Essen, bis sie geschmolzen. Verwendung einer Pasteur-Pipette etwa 1,5 ml geschmolzene Fliege Nahrung in Einzel leer Probiergläser (1,6 x 10 cm). Lassen Sie die Speisen zu verfestigen.
- Isolieren, Puppen: Mit einem feinen Pinsel, entfernen Sie vorsichtig eine Late-Stage-männliche Puppe (bei Flügeln werden schwarz) aus dem Vorratsröhrchen und legen Sie sie auf der Seite eines frisch hergestellten Lebensmittel, die Reagenzglas. Schließen Isolationsdurchstechflaschen mit Baumwolle (Abbildung 2).
Abbildung 2. Soziale Isolation. Eine Spätstadium männliche Puppe ist auf der Seite an einer frisch hergestellten Isolations Fläschchen gegeben. Isolation Fläschchen Puppe enthalten, sind in den 12 Stunden Licht / 12 Stunden Dunkelheit Brutschrank bei 25 ° C und 50% relativer Luftfeuchtigkeit aufgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. Tag 5: Malerei die Fliegen für individuelle Identifikationszwecken
- Führen Sie diesen Schritt am Tag 5 4 Tage alten männlichen Fliegen und zwei Tage vor der Verhaltensexperimente, um die negativen Auswirkungen der CO 2 Anästhesie zu minimieren.
- Anesthetize Fliege mit CO 2. Mit einem feinen Zahnstocher, legen Sie einen kleinen Punkt von Acrylfarbe auf den Brustkorb. Vermeiden Sie es, Farbe auf dem Kopf, Flügel, Bauch oder Beine (Abbildung 3).
- Lassen Sie Farbe trocken für etwa 10 sec, und sanft übertragen Fliegen zurück zu ihrer ursprünglichen Isolationsdurchstechflaschen.
- Return Isolationsdurchstechflaschen mit dem 12 Stunden Licht / 12 Stunden Dunkelheit Brutschrank bei 25 ° C und 50% relativer Luftfeuchtigkeit.
Figur 3. Individuelle Identifizierung. Nach Betäubung eines Fliege mit CO 2, einem kleinen Tropfen Acrylfarbe auf dem Thorax angelegt wird. Für individuelle Identifikations Zweck werden verschiedene Farben verwendet (weiß und hier blau). Siehe nachstehende Diskussion über die Verwendung von CO 2 bei diesem Schritt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses figu ansehenRe.
3. Tag 7: Vorbereitung der Vorrichtung
- Bereiten Sie Lebensmittel Cups:
- Erhitzen Sie frische fliegen Essen, bis es schmilzt.
- Verwendung einer Pasteur-Pipette, etwa 0,8 ml Lebensmittel an den Deckel eines Schraubdeckelfläschchen (1,5 cm Durchmesser, 1 cm Höhe) und abkühlen lassen. Vermeiden Sie Luftblasen.
- Machen Sie frische Hefe Paste durch Mischen von Trockenhefe mit ein paar Tropfen Wasser. Wenn dicke, wenden Sie einen kleinen Tropfen von Hefe-Paste auf der Mitte des Nahrungsmittelbecher Oberfläche mit einem Zahnstocher (Abbildung 4).
Abbildung 4. Vorbereiten der Nahrung Tasse. Ein Nahrungsmittelbecher mit frischen Fliege Essen zubereitet. Nach den Lebensmittel verfestigt wird ein Punkt von Hefe-Paste in der Mitte des Nahrungsmittelbecher Oberfläche platziert. Bitte klicken Sie hier, um die vIEW eine größere Version dieser Figur.
- Bereiten Individuelle Kämpfen Chambers:
- Mit Wasser gründlich waschen der Vorrichtung und individuellen Kampfkammern vor Gebrauch jedes Mal. Dry mit Papiertuch vor dem Gebrauch.
- Legen Sie ein Lebensmitteltasse in der Mitte jeder kämpft Kammer und fixieren mit einem Rückgang von Kitt.
- Bedeckung Löschkammern mit dem Vorrichtungsdeckel (Abbildung 5).
- Platzieren der Vorrichtung in einer Umgebung mit hoher Feuchtigkeit (60%) bei 25 ° C.
- Legen Sie eine Lichtquelle über dem Gerät, um die Kämpfe Kammern zu beleuchten und stellen Sie eine Videokamera für die Aufnahme von oben.
Abbildung 5. Vorbereitung der einzelnen Kampfraum. Das frisch zubereitete Speisen Tasse mit einem Punkt von Hefe-Paste auf der Oberfläche in gewaschen einzelnen fi FestKämpfe Kammern. Kammern mit der zweiteilige Deck das Einführen eines undurchsichtigen Kunststoffteiler in einzelne Kampfkammern geschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4. Tag 7: Verhalten Experiment
- Führen Sie die Verhaltensexperimente mit 6-7 Tage alten männlichen Fliegen.
- Legen Kunststoffteiler in jeden Kampf gegen Kammer.
- Entfernen Sie die Watte aus der Isolationsröhre und positionieren Sie den Schlauch unter einem offenen Loch auf der Seite des Geräts.
- Lassen Sie die Fliege in den Kampfraum gelangen durch negative Geotaxis, in der Regel innerhalb von wenigen Sekunden.
- Schließen Sie den Schiebewand nach der Fliege hat das Rohr nach links und die Kammer eingetragen.
- Wiederholen Sie den Vorgang, um die zweite Fliege in den Kampf Kammer auf der anderen Seite des Gerätes einführen.
- Legen Sie das Gerät wieder in den beleuchteten videotaping Position.
- Beginnen Sie Videoaufzeichnung und entfernen Sie die Plastikteiler, damit Fliegen zu interagieren.
- Für Aggression Experimente:
- In diesen Experimenten kämpft Rekord für mindestens 20 Minuten, um die Bildung von starken Dominanzverhältnisse zu gewährleisten.
- Nach der gewünschten Zeit, zu stoppen Videoaufzeichnung.
- Fliegen aus den Kämpfen Kammern entfernen durch die Umkehrung der oben beschriebenen Vorgehensweise.
- Gründlich Verhaltensgerät mit einem milden Reinigungsmittel und Wasser nach jedem Gebrauch spülen und waschen.
- Für "Loser" Effect Experimente:
Hinweis: In diesen Experimenten werden zunächst Kämpfe als der Konditionierungsphase und zweiten Kämpfe als der Testphase berücksichtigt. Die Zeit der Ruhe zwischen den Kämpfen kann unterscheiden, aber 10 Minuten ermöglicht die Bildung einer starken "Verlierer" Wirkung.- Folgen Sie dem oben beschriebenen, einen ersten Kampf durchführen Vorgehensweise.
- Entscheidender Schritt: Um die Bildung einer "Verlierer" Mentalität, e induzierenNsure, die ersten Kämpfe sind mindestens 20 min lang, um starke Dominanz Beziehungen aufzubauen. Nach 20 min Setzen Sie die Kunststoffteiler in Kampfkammern, um die Fliegen zu trennen.
- Nach 10 min Ruhezeit, entfernen Sie vorsichtig die Kunststoffteiler, damit Fliegen zum zweiten Kämpfe zu interagieren.
- Am Ende der zweiten 20 Minuten Kampf, stoppen Sie die Videoaufzeichnung.
- Fliegen aus Verhaltens Kammern wie oben entfernen.
- Wieder einmal gründlich den Verhaltensgerät reinigen.
- Für Aggression Experimente:
5. Behavioral Analysis
- Übertragen Filme
- Verbinden Kameras an den Computer.
- Konvertieren Fliegen .MTS um Fliegen .mov und kommen Filme Clips zusammen, mit Hilfe von Video-Konvertierungssoftware und die Option "beizutreten ausgewählten Clips".
- Beobachten Sie und jeden Film mit Video-Reader-Software zu analysieren.
- Scoring-Verhalten
Hinweis: Dies kann manuell durchgeführt werden oder mit unsing Verhaltensanalyse-Software-Programm, sofern verfügbar. Die folgende Abbildung beschreibt eine mögliche manuelle Analyse für einen "Verlierer" Wirkung.- Note die Zeit der ersten Begegnung zwischen den Fliegen an der Nahrungsmittelbecher (Begegnungen sind Wechselwirkungen zwischen Paaren von Fliegen, die mindestens 2 Sek halten) und dem Zeitpunkt des Auftretens der ersten Ausfallschritt (ein Verhaltensmuster, in dem eine Fliege erhebt sich hoch auf seiner Hinterbeine und schnappt nach unten auf und versucht, den Gegner zu greifen). Dann punkten die Latenz zu stürzen (das Intervall zwischen der ersten Begegnung und der ersten Ausfallschritt).
- Zählen Sie die Anzahl der Begegnungen und Ausfallschritte während eines Kampfes.
Hinweis: Falls gewünscht, kann man auch andere Verhaltensmuster punkten, wie Flügel Bedrohung, Boxen, Fechten, Rückzug oder die Zahl der Begegnungen, bevor die erste Ausfallschritt, zum Beispiel. - Note die Zeit der Gründung der Dominanz (Zeit zwischen der ersten Begegnung, und die Zeit, wenn man fliegen Exerzitien für drei Mal in Folge von der Food Tasse Achterer empfängt Ausfallschritte). Hinweis, die fliegen, ist der Gewinner und dem der Verlierer des Kampfes.
- Berechnung eines "Loser" Effect
- Teilen Sie die Anzahl der Kämpfe, in denen vorherige Verlierer verlieren 2. Kämpfe (Losers, die zu verlieren: LL) durch die Gesamtzahl der Kämpfe, und multiplizieren Sie mit 100. Das erhaltene Prozentsatz stellt die "Verlierer" Wirkung:
[(# Fliegt LL) / (# Gesamt Kampf)] x 100 - Verwenden Sie einen Chi-Quadrat-Test, um zu vergleichen, ob die "Verlierer" Effekt ist statistisch von dem Erwartungswert von 50%.
- Teilen Sie die Anzahl der Kämpfe, in denen vorherige Verlierer verlieren 2. Kämpfe (Losers, die zu verlieren: LL) durch die Gesamtzahl der Kämpfe, und multiplizieren Sie mit 100. Das erhaltene Prozentsatz stellt die "Verlierer" Wirkung:
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Representative Results
Dieser Abschnitt stellt das Design des Verhaltenskammer und die Analyse eines typischen Satz von Verhaltensexperimenten im Anschluss an die oben genannten Mess Aggression und die Bildung einer "Verlierer" Effekt beschriebenen Protokoll. Ebenfalls dargestellt sind Proben von anderen Verhaltensweisen, die unter Verwendung dieser Vorrichtung gemessen werden kann.
Figur 6 zeigt eine schematische Darstellung der neuen Vorrichtung. Das Gerät besteht aus drei zylindrischen Vertiefungen zusammengesetzt (Abmessung: 22.86 mm Durchmesser, 17 mm Höhe), dass die Kämpfe Kammern. Die zweiteilige Abdeckung schließt die Löschkammern auf der Oberseite und das Einsetzen eines dünnen opaken Kunststoff Teiler, die Kammern in zwei gleiche Abschnitte teilt. Auf jeder Seite der Vorrichtung, Schiebewände mit drei Löchern (15,88 mm Durchmesser) ermöglichen Einladung von Fliegen in die Kämpfe Kammern durch negative Geotaxis direkt aus ihrer Isolation Durchstechflaschen. Nach dem Fliegen geben Bekämpfung Kammern, sind Sie mit den Schiebewänded die Seiten der alle Kammern zu schließen. An diesem Punkt sind die zwei Fliegen in den Kampfarenen, kann aber nicht in Wechselwirkung treten aufgrund der Teiler. Durch das Entfernen von diesen sind die Fliegen frei, zu interagieren und die nachfolgenden Verhaltensmustern können beobachtet und protokolliert werden.
Aggression Experimente: 38 Kämpfe zwischen Paaren von Wildtyp CS Männern durchgeführt. Verschiedene Verhaltensparameter wurden erzielt, während Fliegen waren auf Nahrung Tassen und die Dynamik der Kämpfe wurden (Tabelle 1) analysiert. Während einer 20 min Zeitraum wurden durchschnittlich 24 Begegnungen (kurze Treffen zwischen entfernt), 54 Ausfallschritte (ein Indikator für höhere Intensität Bekämpfung) beobachtet, mit der 1. Ausfallschritt in der Regel während der 2. Begegnung geliefert. Im Durchschnitt wurden die 1. Begegnung, der 1. Ausfallschritt und die Zeit, um Dominanz zu etablieren 2, 4 und 8 min nach dem Start der Aufnahme zu sehen. In den meisten Fällen sind die letzten 12 min der Kämpfe aus repetitiven Sequenzen hoher Intensität encoUnters mit untergeordneten Tieren nähert, angegriffen und zurückziehenden, Verstärkung der Dominanz oder unterwürfigen Status jedes Tier.
"Loser" Effekt Experimente: Um sich für die Bildung einer "Verlierer" Effekt zu suchen, 21 1. Kämpfe von 20 min Dauer wurden zwischen Paaren von Wildtyp CS Männern durchgeführt. Die Kammer Schiebeteiler dann wurde eingeführt, um die Fliegen zu trennen. Nach 10 min wurden 2. 20 min Kämpfe zwischen (a) vorhergehende Verlierer und Gewinner vertraut oder (b) vorherige Verlierer und Gewinner nicht vertraut und diese wurden wie oben (Abbildung 7) analysiert, durchgeführt. In beiden Bedingungen, 20 vorherige Verlierer verloren ihre 2. Kämpfe (95,5%), was auf eine robuste "Verlierer" Wirkung. Die Kampf Ergebnisse wurden mit dem erwarteten Wert von 50 bis 50 mit einem zweiseitigen Chi-Quadrat-Analyse und einem hoch signifikanten "Verlierer" Effekt wurde festgestellt, verglichen. Weitere Verhaltensänderungen wurden in verlieren Individuen beobachtetzwischen dem 1. und 2. kämpft Begleit die Bildung der "Verlierer" Effekt 5.
Andere Verhaltensweisen als die Aggression in der Vorrichtung untersucht werden: um zu veranschaulichen, wurden Balz und Fortbewegung Experimente durchgeführt (T in der Lage 2). Für Werbung, wurden männliche und weibliche Fliegen durch negative Geotaxis in die Verhaltenskammern geladen wurden Trennwände entfernt und Verhaltens Balz Muster wurden erzielt. 34 Experimente wurden durchgeführt, und die Wartezeiten vor Gericht (Zeit zwischen der ersten Begegnung und der 1. Balzverhalten = 7 sec) und (zwischen dem 1. Begegnung und Kopulation = 4 min Zeit) kopulieren wurden analysiert. Nur 2 Rüden nicht in kopulierenden während der 15 Minuten Beobachtungszeit erfolgreich zu sein. Die Brautwerbung Vigor Index (der Bruchteil der Zeit, die verbracht Männchen umwerben Frauen während eines Zeitraum von 15 Minuten nach der ersten Brautwerbung Verhaltensmuster) wurde bei 75% (Tabelle 2) erzielt. Zur Fortbewegung sowohl single fliegt oder eine Gruppe von 10 Fliegen wurden in die Kammern eingebracht und die Gesamtzahl der Mittelliniendurchgänge während 5 min gezählt. Einzellinie überqueren die Mittellinie der Kammer im Durchschnitt 73 Mal während 5 min, während einzelne Fliegen in Gruppen überqueren die Mittellinie im Durchschnitt 45-mal / 5 min (Tabelle 2). Dieser Rückgang beobachtet, wenn Fliegen sind in Gruppen durch den reduzierten Platzangebot pro Fliege und von der Zeit verbringen sie miteinander interagieren, anstatt die Erkundung der Gebiet erklärt.
Abbildung 6. Schematische Darstellung des Verhaltenskammer. (A) Seitenansicht der Vorrichtung. Die neue Vorrichtung besteht aus drei getrennten Teilen: (a) ein Kunststoffblock, der drei Individuen Bekämpfung Kammern; (b) zwei Schiebewände mit drei Löchern (15,88 mm Durchmesser) in jedem; und (c) die zweiteilige Abdeckung auf der Oberseite. (B) nach obenAnsicht der Vorrichtung. Die Abmessungen des Kunststoffblocks (a) 36.83 mm von 123,19 mm. Jeder einzelne Löschkammer hat einen Durchmesser von 22,86 mm und einer Höhe von 17 mm. Löcher an der Seite, die das Laden der Fliegen zu ermöglichen haben einen Durchmesser von 15,88 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Die Bildung einer robusten "Verlierer" Wirkung. Eine signifikante "Verlierer" Effekt (Anteil der Verlierer, die 2. wird beobachtet, wenn vorherige Verlierer gepaart wurden kämpft verlieren (a) vertraut Gewinner (n = 21, *** p <0,0001) oder (b) mit unbekannten Gewinnern für ihre 2. Kämpfe (n = 21, *** p <0,0001) (Lose: 95,5%, Win:. 4,5%, No Remis) PlLeichtigkeit Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Verhaltensparameter | Einheit | Zeit (s) | n |
| Begegnungen | 24 ± 2 | 38 | |
| Lunges | 54 ± 6 | 38 | |
| Anzahl der Begegnungen vor dem 1. Ausfallschritt | 2 ± 0,3 | 38 | |
| Zeit der ersten Begegnung | 145 ± 20 | 38 | |
| Zeitpunkt des 1. Ausfallschritt | 229 ± 26 | 38 | |
| Zeit der Dominanz | 475 ± 56 | 34 | |
| Latency zu stürzen | 87 ± 20 | 38 | |
| Latenzzeit, um Dominanz | 342 ± 51 | 34 |
Tabelle 1:. Dynamik der agonistischen Interaktionen zwischen Paaren von männlichen Fliegen Mittelwerte ± SEM berechnet für jeden Parameter als Indikatoren für die Aggressivität erzielt. Die Gesamtzahl der Begegnungen und Ausfallschritte, und die Zahlvon Begegnungen, bevor die erste Ausfallschritt wurden erzielt. Zeiten des ersten Begegnung, 1. Ausfallschritt und Dominanz, und die Latenzzeiten zu stürzen und die Vorherrschaft in sec ± SEM dargestellt (n> 34).
| Verhaltensparameter | Zeit (s) | Einheit | (%) | n |
| Balzverhalten | ||||
| Latency vor Gericht | 7 ± 3 | 34 | ||
| Latency zu kopulieren | 273 ± 62 </ td> | 32 | ||
| Balz Vigor Index | 75 ± 0,05 | 34 | ||
| Fortbewegung | ||||
| Mittellinienkreuze Total (Fliege) | 73 ± 4 | 48 | ||
| Mittellinienkreuze Total (Gruppe entfernt) | 45 ± 3 | 20 |
Tabelle 2:. Die Analyse der Balzverhalten und Fortbewegungsmittelwerte ± SEM werden für die Latenzzeiten berechnet vor Gericht und kopulieren (in sec). Ein Balz Stärke-Index(in% der Zeit damit verbracht, den Hof nach dem 1. Balz) wurde erzielt nach Männern und Frauen wurden durch negative Geotaxis (n> 32) in Verhaltenskammern geladen. Fortbewegung, wenn einzelne Fliegen oder Gruppen von je 10 Fliegen wurden in Kammern gefüllt war, wurde durch Zählen der Gesamtzahl der Mittelliniendurchgänge während 5 min (n = 48 und 20) erzielt.
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Discussion
Das moderne Zeitalter der Verwendung von Drosophila mit seinen leistungsfähigen genetischer Methoden als Modellorganismus für das Studium der Aggression vor einem Dutzend Jahren begann etwa mit der Einführung der neuen experimentellen Arenen, in denen zuverlässige Kampfverhalten konnte mit einzelnen Paaren von Fliegen 1,7 erhalten werden kann, 8,17,19. Diese Arenen enthalten gewünschten Ressourcen (ein Nahrungsmittelbecher, potenziellen Partnern) und ein Raum für die Verlierer fliegt in zurückziehen. Wenn Ergebnisse mit diesen Arenen erhalten wurden zur vorherigen Wissen über Fruchtfliege Kampf Verhalten aufgenommen wurde Drosophila melanogaster fest als sehr wünschenswert Modellsystem zur Untersuchung eines komplexes Verhalten wie Aggression gegründet und ist in vielen Laboratorien eingesetzt. Die erhaltenen summierten Ergebnisse zeigten, dass: (a) fliegt Ausstellungs Aggression in Konkurrenz zur Nahrungsmittelressourcen, Zugang zu Kollegen oder für die Verteidigung des Territoriums 14,15; (b) Kämpfe einer sequentiellen Reihe von stereotype Verhaltensmuster 1 zusammengesetzt ist; (c)männliche und weibliche Fliegen kämpfen in gleichen Geschlechts-Paarungen (einige Muster männlich bestimmten, einige weibliche spezifisch sind, und einige sind von beiden Geschlechtern gemeinsam) 17; (d) nur männliche Kämpfe gehen, um mit hoher Intensität Ebenen und führen zur Bildung von hierarchischen Beziehungen mit klaren «Gewinner» und «Verlierer» fliegt 17; (e) ein einzelnes Gen fruchtlos, der Geschlechtsbestimmung Hierarchie bestimmt, ob Fliegen kämpfen wie Männchen oder Weibchen 16 und (f) mehrere Hormonen einschließlich Aminen und Peptiden beeinflussen Aggression in Fruchtfliegen 7,8,19,20.
Hier wird ein neuer Ansatz für die Untersuchung der Fruchtfliege Aggression bei denen Handhabung von Fliegen während der Experimente eliminiert beschrieben. Dies bietet eine wesentliche Verbesserung in der Versuchsprotokoll wie alle Verhaltensmessungen verbessert 5,6, neue Informationen in Bezug auf das Verhalten wurde gewonnen und das Lernen und das Gedächtnis, die begleitetMale Fliegen Kämpfen stark verbessert. Um zu veranschaulichen, haben nur zwei früheren Studien die Bildung von "Verlierer" Effekte in diesem Modellsystem 3,4 wiesen. In beiden wurden größere Kammern als die in diesem Protokoll beschriebenen verwendet, Fliegen wurden durch Aspiration in die und aus der Kampfarenen übertragen und mehr Kampf Zeiten und Pausenzeiten zwischen den Kämpfen müssen klare "Verlierer" Effekte zu erzeugen waren. Unsere kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass die Beseitigung der Handhabung aus dem Versuchsprotokoll, klare Dominanz Beziehungen zwischen Paaren von D. melanogaster männlichen Fliegen bereits nach 20 min der Interaktion beobachtet. Diese Zeit ist ausreichend, um signifikante Veränderungen in Kampfstrategien in beiden Fliegen während der 1. Kämpfe induzieren und zuverlässig zu beobachten, die Bildung von starken "Verlierer" Effekte im 2. Kämpfe. Darüber hinaus zum ersten Mal, klare kurzfristige "Gewinner" Effekte wurden im 2. beobachtetkämpft 5,6.
Für den Erfolg dieses Protokoll verwenden, müssen einige kritische Punkte zu beachten. Zu induzieren und beobachten robust aggressive Verhaltensmuster empfehlen wir 6-7 Tage alten männlichen Fliegen, die seit dem späten Puppenstadium in soziale Isolation gehalten wurden. Im Allgemeinen ist die Verfügbarkeit von Ressourcen, der fliegt bereit zu konkurrieren über (Lebensmittel, mates) sind ist, um starke Kampfverhalten und Einrichtung von Dominanzverhältnisse zu erhalten, sehr wünschenswert. Während dieses Protokoll werden entfernt nach der Narkose mit CO 2 gestrichen, und das kann von Bedeutung sein, wie unsere kürzlich veröffentlichte Studie zeigt, dass Betäubung entfernt ernsthaft stört Folgeverhalten 5. Mögliche Wege zur Anästhesie vermeiden könnte es sein, keine Tiere zu malen, wenn es nicht wichtig ist, den Überblick über Personen zu halten. Wenn Anstrich erforderlich ist jedoch die Anästhesie verwendet werden 48 Stunden bevor die Tiere für Experimente, oder ein alternativer Ansatz zur Identifizierung verwendetEinzelpersonen können auch verwendet werden, 31 werden. Um starke "Verlierer" und "Gewinner" Effekte zu induzieren, ist es entscheidend, dass Fliegen erstellt und betreibt ein Dominanz-Beziehung während der ersten Kämpfe. In dem Protokoll hier vorgestellten, mit dem Wildtyp-CS-Stamm bei 25 ° C, ist ausreichend, um klare "Gewinner" und "Verlierer" zu generieren und Änderungen in den Kampf-Strategien beider Individuen beobachten, 20 min von Interaktion. In Experimenten bei verschiedenen Temperaturen über 25 ° C oder mit anderen Genotypen als CS ausgeführt wird, aber die durchschnittliche Zeit für den Aufbau einer robusten Dominanz-Beziehung könnte anders sein. Dementsprechend sollte die Löschzeit durch Ausführen Sätze von vorläufigen Experimenten eingestellt werden. Schließlich, wie Paare von Fliegen werden nach ihrer ersten Kämpfe getrennt könnte in die Erinnerung an Kampf Ergebnisse von Bedeutung sein. Es ist wahrscheinlich wichtig, die Bewegung der Vorrichtung zu reduzieren und während der Einführung des Kunststoffteiler, um sanft zu seinum Störungen der Tiere zu minimieren.
Das Design des Geräts und die zweiteilige Abdeckung ermöglicht eine Trennung der Verhaltenskammern in zwei gleich große Fächer, machen es einfach, die zwei Fliegen nach dem ersten Kämpfe zu trennen und neue Gegner in der 2. Kämpfe vorstellen. Auch, wie in Tabelle 2, mit kleinen Anpassungen des Versuchsprotokoll dargestellt ist, kann die gleiche Vorrichtung verwendet werden, um Werbung, die Fortbewegung oder in der Tat die meisten Fruchtfliege Verhaltensweisen was weniger anstrengenden Bedingungen für die experimentellen Tieren zu untersuchen. Mögliche weitere Verbesserungen des Verfahrens könnte sein, irgendeine Form von Thermostatsteuerung in die Vorrichtung (piezoelektrisches Element oder eine Spule, um temperaturgesteuerte Fluid zirkuliert), um eine einfache Verwendung temperaturempfindliche Reagenzien (shibire ts1, dTRPA1 Kanal) ermöglichen einzuführen.
Zusammenfassend haben wir eine neue Vorrichtung, die für das Studium der Aggression i eine neue Strategie entwickelt, bietetn Fruchtfliegen in dem Handling von Fliegen vor, während und nach Versuchen wurde eliminiert. Alle Verhaltensmaßnahmen sind mit der neuen Vorrichtung im Vergleich zu einigen anderen gemeinsame Wege im Umgang mit Fliegen verbessert. Vielleicht eine weitere allgemeine Bemerkung zu machen, ist, dass im wesentlichen alle Verhaltensexperimenten in Laborumgebungen beinhalten Experimentatoren Aufnehmen oder auf andere Weise, Umgang mit Tieren. Trotz der Bemühungen, sanft zu sein in dieser Behandlung, ist dies wahrscheinlich Stress für die Tiere zu sein. Es könnte nützlich sein, Methoden zu entwickeln, um diese Behandlung zu eliminieren, wann immer möglich, so dass die Tiere möglicherweise bei etwas stärker normalen Bedingungen beobachtet werden können.
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Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institute of General Medical Sciences (GM099883 und GM074675) EAK Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und -analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Erstellung des Manuskripts unterstützt. Wir danken den Menschen aus unserer Maschinenhalle an der Harvard Medical School für den Entwurf des Verhaltensgerät (Kontakt: http://mikesmachine.com).
Autor Beiträge: ST, entworfen BC den Verhaltensgerät. ST ausgelegt und optimiert Das experimentelle Protokoll. ST und BC durchgeführt und die Versuche analysiert. ST, EAK und BC schrieb die Zeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
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