Summary
Au cours de la mouche des fruits combats, les comportements observés, combattre la dynamique, et l'apprentissage et la mémoire associée sont influencés par les conditions expérimentales. Le protocole présenté ici décrit une nouvelle procédure qui élimine entièrement la manipulation des mouches pendant les expériences. Cela améliore la dynamique de combat et permet la formation d'effets de «perdant» forts.
Abstract
Le comportement agressif chez Drosophila melanogaster est composé de l'expression séquentielle des comportements stéréotypés (par analyse, voir 1). Ce comportement complexe est influencée par des facteurs génétiques, hormonaux et environnementaux. Comme dans de nombreux organismes, l'expérience de précédents combats influe sur la stratégie de lutte contre les mouches et les résultats des concours ultérieurs: perdre un combat augmente la probabilité de perdre des concours plus tard, révélant des effets de «perdant» qui impliquent probablement apprentissage et la mémoire 2-4. L'apprentissage et la mémoire qui accompagne l'expression de comportements sociaux complexes tels que l'agression, est sensible à la pré-test de la manipulation des animaux 5,6. De nombreux protocoles expérimentaux sont utilisés dans différents laboratoires pour étudier agression 7-9, cependant, pas systématiquement protocole utilisé qui exclut la manutention de vol est actuellement disponible. Nous rapportons ici un nouvel appareil de comportement qui élimine la manipulation de mouches, en utilisant instead leurs réponses négatives geotactic innées de déplacer les animaux dans ou hors des chambres de combat. Dans ce protocole, les petites arènes de combat circulaires contenant une tasse de nourriture sont divisés en deux moitiés égales par une coulisse amovible en matière plastique avant l'introduction des mouches. Les mouches entrent chambres de leurs flacons d'isolement de la maison via des portes coulissantes de chambre et géotaxie. Lors de l'enlèvement de curseurs en plastique, les mouches sont libres d'interagir. Après des périodes déterminées, les mouches sont de nouveau séparés par curseurs pour l'expérimentation ultérieure. Tout cela se fait facilement, sans manipulation de mouches individuelles. Cet appareil offre une nouvelle approche pour étudier l'agression et l'apprentissage et la mémoire associée, y compris la formation d'effets de «perdant» dans les combats de la mouche. En outre, ce nouvel appareil de comportement d'usage général peut être utilisé pour étudier d'autres comportements sociaux des mouches et devrait, en général, être d'intérêt pour l'étude des changements liés à l'expérience dans les processus comportementaux fondamentaux.
Introduction
Agression dans les systèmes d'animaux est fortement associée à l'acquisition et la détention de ressources telles que la nourriture, le territoire et compagnons. Compte tenu du rôle important que joue dans l'aptitude des individus, il est surprenant que l'agression ne a évolué à travers le règne animal. Comme un trait adaptatif qui bénéficie directement des individus, une forte composante d'apprentissage et la mémoire est associée à l'agression. En concurrence pour le rang social, l'expérience de combat précédent influence le résultat de concours ultérieurs. En général, l'expérience augmente perdantes antérieures, et l'expérience gagnante diminue, la probabilité de perdre concours ultérieurs (appelés «perdant» et les effets «gagnants»). Effets "Loser" ont été observés dans un large éventail d'espèces, et certains rapports suggèrent que ceux-ci peuvent durer plusieurs jours tandis que les effets «gagnants» sont généralement de plus courte durée 2,10,11.
Le premier rapport du comportement agressifdans les mouches des fruits (D. ampelophila) était par Sturtevant en 1915 dans un document concerné avec la reconnaissance du sexe et de la sélection du sexe 12. Un demi-siècle plus tard, des examens plus complets de fruits Male volez agression ont été faites, qui décrit la plupart des comportements observés lors des combats de mouches des fruits. Ces expériences ont été principalement effectués dans de petits groupes de mouches mâles et femelles observées au cours heures 13-15. Récemment, avec l'ajout d'outils génétiques puissants, dyadiques simples configurations de combat du sexe et des temps plus courts de l'observation, D. melanogaster est apparue comme un important système modèle pour l'étude de la biologie de l'agression 1,16. Analyse des combats entre les mêmes paires de sexe de mouches mâles et femelles a démontré que l'agression implique comportements stéréotypés que la transition de l'un à l'autre d'une manière statistiquement fiable 1,17. Certains des modèles comportementaux observés sont spécifiques sexe tandis que d'autres sont observés dans la luttes dans les deux sexes. Combats masculins vont à des niveaux d'intensité plus élevés que les combats féminins et entraîner la formation de relations de dominance avec les «gagnants» et «perdants clairs". À l'heure actuelle, de nombreux laboratoires ont commencé à enquêter sur l'biochimique 18, neuronal 7,19-21, et génétiques 22 fondements d'agression. Malheureusement, une méta-analyse des études pour mieux comprendre la dynamique du combat et de la formation et le maintien des relations de dominance est problématique en raison de l'utilisation d'une multiplicité de procédures expérimentales dans des laboratoires différents. Essentiellement toutes les techniques décrites dans la littérature impliquent la manipulation et la manipulation des mouches pour les introduire dans les arènes 19,23,24 et pendant l'expérience comportementale 3,4 pour transférer les mouches des arènes. Aspiration douce est la façon la plus courante de manipuler les mouches 3,4,23-25, mais froides ou CO 2 anesthésie sont également utilisés 9,26, même si previous études ont déjà rapporté que ces procédures ont des effets délétères sur le comportement à la mouche 27,28. Une période d'au moins 24 heures est recommandée après l'utilisation de tous les anesthésiques pour minimiser leurs effets sur le comportement 29,30.
Mouches apprendre de l'expérience de combat précédent et modifier leur utilisation du modèle de comportement dans des situations nouvelles, ce qui suggère que l'apprentissage et la mémoire accompagnent et sont des conséquences de rencontres agonistes. En ce sens, volent combats ressemblent à des situations d'apprentissage de conditionnement opérant dans laquelle vole apprendre qu'une stratégie a fonctionné et ensuite l'utiliser de plus en plus souvent lors de rencontres ultérieures. Les mouches changent leurs stratégies de lutte après des relations de dominance ont été établis pendant les combats, avec des gagnants se fend plus en plus et les perdants de moins en moins. Après une période de séparation, les perdants précédents montrent un comportement beaucoup plus soumis et sont très susceptibles de perdre 2 ème combat lorsque jumelé avec fl naïves ou les précédents lauréats 3,4. Cependant, l'absence d'une procédure expérimentale qui exclut la manipulation des mouches a fait des études détaillées des effets de «perdant» difficiles. Dans une étude récente, nous avons comparé deux procédures expérimentales utilisées en routine dans les laboratoires (aspiration et froid anesthésie) à introduire des mouches dans les chambres de comportement à la nouvelle procédure qui élimine la manipulation. Les résultats ont montré que l'anesthésie froid avait beaucoup plus des effets négatifs sur l'agression de l'aspiration, mais même aspiration réduit le niveau d'agressivité par les mouches. Aspiration n'a, toutefois, causer des effets très importants sur l'apprentissage et la mémoire qui accompagnent l'agression. Après protocole identique avec deux procédures expérimentales (d'aspiration et aucune manipulation), un effet robuste "perdant" n'a été observée lorsque le traitement des mouches a été éliminé de la procédure expérimentale 5,6.
Idéalement, les études de la drosophile à l'agression labotoires devraient inclure des situations environnementales qui vole normalement rencontrent dans la nature (compétition pour les ressources, pour défendre le territoire et l'espace pour échapper). En outre, les conditions expérimentales devraient être optimisés pour induire de manière fiable, observer et interpréter le comportement en cours d'examen (tentent de minimiser la manipulation des animaux, de limiter l'utilisation du CO 2 comme anesthésique, et de normaliser les procédures expérimentales). En tentant de répondre à la plupart ou la totalité de ces questions, nous avons conçu un nouvel appareil de comportement qui élimine la manipulation de mouches avant, pendant et après les initiant aux arènes de comportement. Avec ces appareils, les mouches utilisent leurs géotaxie négatifs innées à être déplacés et transférés dans et hors des chambres de combat. En éliminant la manipulation de mouches, le protocole vise à: (a) réduire la variabilité de comportement chez les individus; (b) réduire le temps nécessaire pour les mouches d'interagir et de générer des rapports de dominance claires (mâles); et (c) induisent fiable assez forte behavioRAL changements pour permettre la formation d'effets de «perdant».
Ce protocole décrit un nouvel appareil expérimental et une procédure étape par étape pour analyser l'agression et à permettre la formation d'un fort effet "perdant" dans D. melanogaster. Nous nous attendons à ce que cet appareil comportementale peut être facilement adapté pour l'étude d'autres comportements sociaux présentés par les mouches des fruits.
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Protocol
Remarque: Ce qui suit est une description étape par étape du protocole expérimental que nous utilisons pour permettre le déclenchement de l'agression fiable entre des paires de mouches des fruits mâles (D. melanogaster). Cette procédure induit la formation d'un effet de "perdant". En utilisant ce protocole, un court-terme effet de "gagnant" a également été récemment rapporté 5,6. La figure 1 montre la chronologie des expériences comportementales.
Figure 1. Chronologie de l'expérience de l'agression. Au jour 1, mâle pupes en fin de ligne (quand ailes deviennent noirs) sont isolés dans des flacons d'isolement fraîchement préparés. Au jour 5 après avoir émergé comme des adultes, quatre jours vieilles mouches mâles sont anesthésiés avec CO 2 et peints avec des couleurs différentes pour des fins d'identification. Au jour 7, tasses alimentaires et les chambres de combat sontprêt à mettre en place les expériences comportementales. Deux 6-7 mâles adultes un jour sont chargés dans les chambres et sont capables d'interagir. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
1. Jour 1: isolement social des chrysalides
- Augmenter et de maintenir les stocks de voler dans un 12 heures de lumière / 12 h incubateur cycle d'obscurité à environnement contrôlé à 25 ° C et 50% d'humidité relative.
- Préparer flacons d'isolement: chauffer des aliments à la mouche fraîche jusqu'à ce que fondu. Avec une pipette Pasteur, transférer environ 1,5 ml de fondu alimentaire à la mouche en simples tubes à essai en verre vides (1,6 x 10 cm). Laisser la nourriture se solidifier.
- Isoler les pupes: Avec un pinceau fin, retirez délicatement un mâle nymphe en fin de ligne (quand ailes deviennent noirs) à partir du stock flacon et le placer sur le côté d'un aliment contenant tube à essai fraîchement préparée. Fermer isolement flacons avec du coton (figure 2).
Figure 2. Isolement social. Un mâle nymphe en fin de ligne est placé sur le côté sur un flacon d'isolement fraîchement préparé. Flacons d'isolement contenant nymphe sont placés dans le 12 heures de lumière / 12 h incubateur obscurité à 25 ° C et 50% d'humidité relative. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
2. Jour 5: Peinture mouches pour l'identification individuelle des fins
- Effectuez cette étape au jour 5 avec 4 mouches mâles un jour et deux jours avant les expériences comportementales afin de minimiser l'effet négatif de CO 2 anesthésie.
- Anesthésier mouche avec CO 2. Avec une amende cure-dent, placez un petit point de la peinture acrylique sur le thorax. Évitez de placer la peinture sur la tête, les ailes, l'abdomen ou les jambes (figure 3).
- Laissez la peinture sécher pendant environ 10 secondes, et de transférer en douceur mouches à leurs flacons d'isolement originaux.
- Retour flacons d'isolement pour les 12 heures de lumière / 12 h incubateur obscurité à 25 ° C et 50% d'humidité relative.
Figure 3. Identification individuelle. Après anesthésie avec une mouche CO 2, une petite goutte de la peinture acrylique est appliquée sur le thorax. Aux fins d'identification individuelle, différentes couleurs sont utilisées (blanc et bleu ici). Voir discussion ci-dessous sur l'utilisation du CO 2 à cette étape. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figuré.
3. Jour 7: Préparation de l'appareil
- Préparer Coupes alimentaires:
- Chauffer des aliments frais à la mouche jusqu'à ce qu'il fonde.
- Avec une pipette Pasteur, transférer environ 0,8 ml de nourriture pour le couvercle d'un flacon avec bouchon à vis (1,5 cm de diamètre, 1 cm de hauteur) et laisser refroidir. Évitez les bulles d'air.
- Faire la pâte de levure fraîche en mélangeant la levure sèche avec quelques gouttes d'eau. Lorsque épaisseur, appliquer une petite goutte de pâte de levure par rapport au centre de la surface de coupe des aliments avec un cure-dent (figure 4).
Figure 4. Préparation de la Coupe de la nourriture. Une tasse de nourriture est préparée avec de la nourriture à la mouche frais. Après la solidification de la nourriture, un point de pâte de levure est placé au centre de la surface de coupe des aliments. S'il vous plaît cliquez ici pour vIEW une version plus grande de cette figure.
- Préparer Chambers de combat individuelles:
- Lavez-vous soigneusement les appareils et de lutte contre l'individu chambres avec de l'eau avant de l'utiliser à chaque fois. Sécher avec une serviette en papier avant de l'utiliser.
- Placez une tasse de nourriture dans le centre de chaque chambre combats et fixer avec une goutte de mastic.
- Couvrir chambres de combat avec le couvercle de l'appareil (figure 5).
- Placez l'appareil dans un environnement à haute humidité (60%) à 25 ° C.
- Placez une source de lumière au-dessus de l'appareil pour illuminer les chambres de combat et de mettre une caméra vidéo pour enregistrer d'en haut.
Figure 5. Préparer la chambre de combat individuel. La coupe de la nourriture fraîchement préparée avec un point de pâte de levure sur la surface est fixé dans les fi lavécombats chambres. Chambers sont fermés avec le couvercle en deux parties permettant l'insertion d'un diviseur plastique opaque dans des chambres individuelles de combat. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
4. Jour 7: Expérience comportementale
- Effectuez les expériences comportementales avec 6-7 jours d'âge mouches mâles.
- Insérez séparateurs en plastique dans chaque chambre combats.
- Retirer le bouchon de coton à partir du tube d'isolation et positionner le tube en dessous d'un trou ouvert sur le côté de l'appareil.
- Laissez la volée entrer dans la chambre de combats par géotaxie négatifs, généralement en quelques secondes.
- Fermez la paroi coulissante après la mouche a quitté le tube et entré dans la chambre.
- Répétez la procédure pour introduire la deuxième volée dans la chambre de lutte de l'autre côté de l'appareil.
- Placez l'appareil de retour dans le videotapi illuminéela position ng.
- Commencez l'enregistrement vidéo et enlever le diviseur en plastique pour permettre à vol d'interagir.
- Pour les expériences d'agression:
- Dans ces expériences, fiche bat pour au moins 20 minutes pour assurer la formation de relations de dominance fortes.
- Après le temps désiré, arrêter l'enregistrement vidéo.
- Retirer le vol des chambres de combat en inversant la procédure décrite ci-dessus.
- Laver soigneusement l'appareil comportementale avec un détergent doux et de l'eau après chaque utilisation et rinçage.
- Pour «perdant» Expériences d'effet:
Remarque: Dans ces expériences, premiers combats sont considérés comme la phase de conditionnement et deuxième combats que la phase de test. La période de repos entre les combats peuvent différer, mais 10 min permet la formation d'un fort effet de «perdant».- Suivez la procédure décrite ci-dessus pour effectuer un premier combat.
- Étape cruciale: pour induire la formation d'un «perdant» mentalité, eNsure que les premiers combats sont au moins 20 min à long afin d'établir des relations de dominance fortes. Après 20 min, ré-insérer le diviseur en plastique dans des chambres de combat pour séparer les mouches.
- Après une période de 10 min de repos, retirez délicatement le diviseur en plastique pour permettre à vol d'interagir pour les deuxièmes combats.
- A la fin de la deuxième lutte de 20 min, arrêter l'enregistrement vidéo.
- Retirer mouches de chambres de comportement que ci-dessus.
- Une fois de plus, bien nettoyer l'appareil comportementale.
- Pour les expériences d'agression:
5. Analyse comportementale
- Transfert Films
- Connectez les caméras à l'ordinateur.
- Autre mouches .MTS à .mov mouches et rejoindre les films clips ensemble, en utilisant un logiciel de conversion vidéo et l'option "joindre les clips sélectionnés".
- Observer et analyser chaque film avec un logiciel de lecture vidéo.
- Marquant Comportement
Remarque: cela peut être fait manuellement ou de nousing logiciel de programme d'analyse comportementale, si disponible. L'illustration ci-dessous décrit une analyse manuelle possible pour un effet de «perdant».- Note moment de la première rencontre entre les mouches sur la coupe de la nourriture (des rencontres sont les interactions entre les paires de mouches qui durent au moins 2 secondes) et le moment de l'apparition de la première fente (un modèle de comportement dans lequel une mouche monte haut sur son pattes de derrière et mousquetons vers le bas sur et tente de saisir l'adversaire). Ensuite, marquer le temps de latence à fente (l'intervalle entre la première rencontre et la première fente).
- Comptez le nombre total de rencontres et les mouvements brusques lors d'un combat.
Remarque: Si désiré, on peut aussi marquer d'autres comportements, comme la menace de l'aile, la boxe, l'escrime, la retraite ou le nombre de rencontres avant la première fente, par exemple. - Note moment de l'établissement de la domination (temps entre la première rencontre et le moment où une mouche retraites trois fois de suite au large de la Coupe de l'arrière de la nourritureer fentes de réception). Remarque qui volent est le vainqueur et qui est le perdant de la lutte.
- Le calcul d'un effet de "Loser"
- Divisez le nombre de combats dans lesquels les perdants précédentes perdent 2 ème combats (Losers qui perdent: LL) par le nombre total de combats, et multiplier par 100. Le pourcentage obtenu représente l'effet de «perdant»:
[(# Vole LL) / (# lutte totale)] x 100 - Utilisez un test du chi carré pour comparer si l'effet «perdant» est statistiquement différente de la valeur attendue de 50%.
- Divisez le nombre de combats dans lesquels les perdants précédentes perdent 2 ème combats (Losers qui perdent: LL) par le nombre total de combats, et multiplier par 100. Le pourcentage obtenu représente l'effet de «perdant»:
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Representative Results
Cette section présente la conception de la chambre de comportement et l'analyse d'un ensemble d'expériences typique de comportement suivant le protocole décrit ci-dessus mesure agression et la formation d'un effet de «perdant». Également illustrés sont des échantillons d'autres comportements qui peuvent être mesurés en utilisant cet appareil.
La figure 6 montre une représentation schématique de l'appareil de nouveau. L'appareil est composé de trois puits cylindriques (dimension: 22,86 mm de diamètre, hauteur 17 mm) qui sont les chambres de combat. Le couvercle en deux parties ferme les chambres de combat sur le dessus et permet l'insertion d'un diviseur plastique opaque mince qui sépare les chambres en deux parties égales. De chaque côté de l'appareil, des parois de coulissement avec trois trous (diamètre 15,88 mm) de permettre le chargement du vol dans les chambres de combat par géotaxie négatifs directement à partir de leurs flacons d'isolement. Après mouches entrent dans les chambres de combat, les parois coulissantes sont utilisationd pour fermer les côtés des chambres de tous. À ce stade, les deux mouches sont dans les arènes de combat, mais ne peuvent pas interagir en raison des diviseurs. En supprimant ces, les mouches sont libres d'interagir et les comportements suivants peuvent être observés et notés.
Expériences Agression: 38 combats entre des paires de type sauvage mâles CS ont été effectuées. Différents paramètres comportementaux ont été marqués tandis mouches étaient sur des tasses de nourriture et de la dynamique des combats ont été analysés (tableau 1). Une moyenne de 24 rencontres (brèves rencontres entre mouches), 54 se fend (un indicateur de l'intensité de combats plus élevé) ont été observées au cours d'une période de 20 min, avec la 1ère fente généralement livrés au cours de la 2 ème rencontre. En moyenne, la 1 ère rencontre, le 1 er fente et le temps d'établir une position dominante ont été vus 2, 4 et 8 minutes après le début de l'enregistrement. Dans la plupart des cas, les 12 dernières minutes de combats sont constitués de séquences répétitives d'Enco de haute intensitéUnters avec des animaux subordonnés approche, être attaqué et de recul, le renforcement de la domination ou de l'état de soumission de chaque animal.
«Perdant» des expériences d'effet: Afin de rechercher la formation d'un effet de «perdant», 21 1 st combats de 20 min durée ont été réalisées entre des paires de type sauvage mâles CS. La chambre de coulissement diviseur puis a été inséré pour séparer les mouches. Après 10 min, 2 e 20 min combats ont été effectuées entre (a) les précédents gagnants et des perdants familiers ou (b) des perdants et des gagnants précédents inconnus et ceux-ci ont été analysés comme ci-dessus (figure 7). Dans les deux conditions, 20 perdants précédentes ont perdu leurs 2 ème combats (95,5%), démontrant un effet robuste "perdant". Les résultats de combat ont été comparés à la valeur attendue de 50-50 avec une analyse du chi carré bilatéral et un effet très significatif "perdant" a été trouvé. Autres changements de comportement ont été observés dans la perte de personnesentre le 1 er et 2 ème combat accompagnant la formation de l'effet de «perdant» 5.
D'autres comportements que l'agression peuvent être étudiés dans l'appareil: pour illustrer, des expériences de séduction et de locomotion ont été effectuées (T mesure 2). Pour la cour, les mouches mâles et femelles ont été chargés par géotaxie négatifs dans les chambres de comportement, diviseurs ont été enlevés et les modèles de comportement de cour ont été marqués. 34 expériences ont été réalisées et les latences au tribunal (temps entre le 1er rencontre et le comportement de cour 1er = 7 sec) et de copuler (temps entre le 1er rencontre et la copulation = 4 min) ont été analysés. Seuls les 2 hommes ne parvenaient pas à copuler pendant le temps de 15 min d'observation. L'indice Vigor Courtship (la fraction de temps que les hommes a passé courtiser les femelles au cours d'une période de 15 minutes après la 1ère cour modèle de comportement) a été marqué à 75% (tableau 2). Pour locomotion soit le péchéGLE vole ou un groupe de 10 mouches ont été introduits dans les chambres et le nombre total de passages de la ligne médiane pendant 5 min ont été comptés. Mouches seul croisement de la ligne médiane de la chambre en moyenne 73 fois pendant 5 min, tandis que les mouches individuels dans les groupes traversent la ligne médiane en moyenne 45 fois / 5 min (tableau 2). Cette diminution observée lorsque les mouches sont en groupe peut être expliquée par l'espace réduit disponible Per Fly et par le temps qu'ils passent à interagir les uns avec les autres au lieu d'explorer le territoire.
Figure 6. Représentation schématique de la chambre de comportement. (A) Vue de côté de l'appareil. Le nouvel appareil est composé de trois parties distinctes: (a) un bloc plastique contenant trois individus de défense chambres; (b) deux parois coulissantes avec trois trous (15,88 mm de diamètre) dans chaque; et (c) le couvercle en deux pièces sur le dessus. (B) Hautvue de l'appareil. Les dimensions du bloc en matière plastique (a) sont de 36,83 mm 123,19 mm. Chaque chambre de combat individu a un diamètre de 22,86 mm et une hauteur de 17 mm. Trous sur le côté qui permettent le chargement des mouches ont un diamètre de 15,88 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. La formation d'un effet robuste "perdant". Un effet significatif "perdant" (pourcentage de perdants qui perdent 2 ème combat est observé lorsque perdants précédents ont été jumelés (a) avec les gagnants familiers (n = 21, *** p <0,0001) ou (b) avec les gagnants inconnus pour leur 2 e combats (n = 21, *** p <0,0001) (Lose: 95,5%, Win:. 4,5%, Non nuls) Plfaciliter cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Paramètres comportementaux | Unité | Temps (s) | n |
| Des rencontres | 24 ± 2 | 38 | |
| Fentes | 54 ± 6 | 38 | |
| Nombre de rencontres avant le 1er fente | 2 ± 0,3 | 38 | |
| Durée de la 1ère rencontre | 145 ± 20 | 38 | |
| Durée de la 1ère fente | 229 ± 26 | 38 | |
| Temps de position dominante | 475 ± 56 | 34 | |
| Latence à fente | 87 ± 20 | 38 | |
| Latence à la domination | 342 ± 51 | 34 |
Tableau 1:. Dynamique des interactions entre des paires d'agonistes mouches mâles valeurs moyennes ± SEM sont calculées pour chaque paramètre reçu en tant qu'indicateurs de l'agressivité. Le nombre total de rencontres et de fentes, et le nombrede rencontres avant le 1er fente ont été marqués. Temps de la 1ère rencontre, 1er fente et de la domination, et les temps de latence à fente et à la domination sont présentés dans sec ± SEM (n> 34).
| Paramètres comportementaux | Temps (s) | Unité | (%) | n |
| Parade nuptiale | ||||
| Latence au tribunal | 7 ± 3 | 34 | ||
| Latence de copuler | 273 ± 62 </ td> | 32 | ||
| Courtship Indice Vigor | 75 ± 0,05 | 34 | ||
| Locomotion | ||||
| Nombre de croix de la ligne médiane (la mouche seule) | 73 ± 4 | 48 | ||
| Nombre de croix de la ligne médiane (groupe de mouches) | 45 ± 3 | 20 |
Tableau 2:. Analyse du comportement de cour et de la locomotion valeurs moyennes ± SEM sont calculés pour les latences au tribunal et copuler (en sec). Un indice de la cour vigueur(en% du temps consacré à la cour après le 1er parade nuptiale) a été marqué après mâles et les femelles ont été chargés dans des chambres de comportement par géotaxie négatifs (n> 32). Locomotion, lorsque les mouches ou les groupes de 10 mouches simples ont été chargés dans les chambres, a été marqué par le comptage du nombre total de passages de la ligne médiane pendant 5 min (n = 48 et 20).
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Discussion
L'ère moderne de l'utilisation de la drosophile avec ses méthodes génétiques puissants comme un organisme modèle pour l'étude de l'agression a commencé il ya environ une dizaine d'années avec l'introduction de nouvelles arènes expérimentales dans lesquelles le comportement de combat fiable n'a pu être obtenu avec des paires simples de mouches 1,7, 8,17,19. Ces arènes inclus ressources souhaitées (une tasse de nourriture, des partenaires potentiels) et un espace de perdant vole de se retirer dans. Lorsque les résultats obtenus avec ces arènes ont été ajoutés à la connaissance précédente au sujet du comportement de combat de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster a été fermement établi comme un système modèle hautement souhaitable pour examiner un comportement complexe comme l'agression et est utilisé dans de nombreux laboratoires. Les résultats obtenus ont révélé que résumées: (a) vole exposition agression en compétition pour les ressources alimentaires, l'accès à des partenaires ou pour la défense du territoire 14,15; (b) les combats sont composées d'une série séquentielle de comportements stéréotypés 1; (c)mouches mâles et femelles se battent dans les mêmes couples de sexe (certains modèles sont spécifiques mâle, certaines sont spécifiques des femmes et certains sont partagés par les deux sexes) 17; (d) les seuls combats masculins vont à des niveaux de haute intensité et entraînent la formation de relations hiérarchiques avec clairement «gagnant» et «perdant» vole 17; (e) d'un seul gène infructueuses, de la hiérarchie de la détermination du sexe, détermine si les mouches se battent comme des mâles ou des femelles et 16 (f) de substances hormonales multiples y compris les amines et les peptides influencent l'agressivité chez les mouches des fruits 7,8,19,20.
Ici, une nouvelle approche est décrite pour l'étude de la mouche des fruits agression dans laquelle la manipulation de vol au cours d'expériences est éliminé. Cela offre une amélioration significative dans le protocole expérimental que toutes les mesures comportementales sont améliorées 5,6, de nouvelles informations concernant le comportement a été acquise et de l'apprentissage et la mémoire qui accompagnecombats de mouches mâles est grandement améliorée. A titre d'illustration, seules deux études précédentes ont indiqué la formation d'effets de «perdant» dans le présent 3,4 système modèle. Dans ces deux, grandes chambres que celles décrites dans le présent protocole ont été utilisés, les mouches ont été transférés dans et hors des arènes de combat par aspiration, et des durées de combat et heures d'intervalle entre les combats étaient nécessaires pour générer des effets clairs "perdant". Notre étude récente a démontré que l'élimination de la manipulation du protocole expérimental, des relations de dominance claires entre les paires de D. mouches melanogaster mâles sont observés après seulement 20 min de l'interaction. Ce laps de temps est suffisant pour induire des changements importants dans les stratégies de lutte contre les mouches dans les deux cours de 1 er combats et d'observer de manière fiable la formation de forts effets de «perdant» dans 2 nd combats. En outre, pour la première fois, à court terme clairement les effets de «gagnants» ont également été observés au cours de 2 ème5,6 combat.
Pour le succès en utilisant ce protocole, certains points critiques doivent être notées. Pour induire et observer robustes modèles de comportement agressifs, nous recommandons utilisant 6-7 mouches mâles un jour qui ont été détenus dans l'isolement social depuis le stade de pupe tard. En général, la disponibilité des ressources qui vole sont prêts à concurrencer plus (nourriture, compagnons) est hautement souhaitable afin d'obtenir un comportement de combat solide et l'établissement de relations de dominance. Au cours de ce protocole, les mouches sont peintes après une anesthésie à l'aide de CO 2, et que peuvent être de préoccupation, car notre étude récemment publiée montrant que anesthésier les mouches gravement atteinte comportement ultérieur 5. Façons possibles pour éviter l'anesthésie pourrait être de ne pas peindre des animaux si elle est pas important de garder une trace des individus. Si la peinture est nécessaire, cependant, l'anesthésie doit être utilisé 48 heures avant que les animaux sont utilisés pour des expériences, ou des approches alternatives pour identifierles individus pourraient également être utilisés 31. Pour induire une forte «perdant» et les effets «gagnants», il est crucial que les mouches établir et maintenir une relation de domination au cours des premiers combats. Dans le protocole présenté ici, en utilisant la souche de type sauvage CS à 25 ° C, 20 min de l'interaction est suffisant pour générer des «gagnants» et «perdants clairs" et d'observer les changements dans les stratégies de lutte des deux personnes. Dans les expériences effectuées à différentes températures de 25 ° C ou avec d'autres génotypes que CS, cependant, le temps moyen pour établir une relation de domination robuste pourrait être différent. En conséquence, la période de combat doit être ajustée en effectuant des séries d'expériences préliminaires. Enfin, comment paires de mouches sont séparés après leurs premiers combats pourrait être important dans la préservation de la mémoire des résultats de combat. Il est probablement important de réduire le mouvement de l'appareil et d'être doux lors de l'introduction de la matière plastique afin diviseurde réduire au minimum les perturbations des animaux.
La conception de l'appareil et le couvercle en deux parties permettant la séparation des chambres de comportement en deux compartiments égaux, il est facile de séparer les deux mouches après premiers combats et d'introduire de nouveaux adversaires en 2 ème combats. En outre, comme le montre le tableau 2, avec de petits ajustements du protocole expérimental, le même appareil peut être utilisé pour étudier la cour, la locomotion ou même la plupart des comportements de mouches des fruits dans ce qui devrait être des conditions moins stressantes pour les animaux de laboratoire. D'autres améliorations éventuelles sur la procédure pourrait être d'introduire une certaine forme de contrôle thermostatique dans l'appareil (élément piézo-électrique ou d'une bobine à circuler le fluide à température contrôlée) pour permettre l'utilisation facile des réactifs sensibles à la température (shibire ts1, canal dTRPA1).
En résumé, nous avons mis au point un nouvel appareil qui offre une nouvelle stratégie pour l'étude de l'agression in mouches des fruits dans laquelle la manipulation de mouches avant, pendant et après des expériences a été éliminé. Toutes les mesures comportementales sont améliorées avec le nouvel appareil par rapport à plusieurs autres façons courantes de manipulation mouches. Peut-être un commentaire plus général à faire est que pratiquement toutes les expériences de comportement dans des environnements de laboratoire impliquent expérimentateurs ramasser ou par d'autres moyens, la manipulation des animaux. Malgré les efforts pour être doux dans cette manipulation, cela est susceptible d'être stressante pour les animaux. Il pourrait être utile d'élaborer des méthodes pour éliminer cette manipulation à chaque fois que possible, de sorte que les animaux pourraient être observées dans des conditions légèrement plus normales.
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Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par des subventions de l'Institut national des sciences médicales générales (GM099883 et GM074675) à EAK Les bailleurs de fonds ne jouaient aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Nous remercions les gens de notre magasin de la machine à la Harvard Medical School pour la conception de l'appareil comportementale (contact: http://mikesmachine.com).
Contributions Auteur: ST, BC conçus l'appareil comportementale. ST conçue et optimisée du protocole expérimental. ST et BC réalisées et analysées les expériences. ST, EAK et BC a écrit le papier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
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