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Developmental Biology

Ex Vivo Cultura de polluelo cerebelosos Rebanadas y espacialmente focalizadas Electroporación de gránulos precursores celulares

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53421
Automatic Translation
1, 1, 2
1MRC Centre of Developmental Neurobiology, King's College London, 2School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary, University of London

Summary

La capa externa del gránulo del cerebelo es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para orientar la modificación genética a esta capa en el pico de la proliferación mediante electroporación ex vivo y la cultura de las rebanadas del cerebelo a partir de embriones Día 14 embriones de pollo.

Abstract

La capa externa del gránulo cerebelosa (EGL) es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo, y un excelente modelo para el estudio de la proliferación y diferenciación neuronal. Además, las modificaciones evolutivas de su capacidad proliferativa han sido responsables de la dramática expansión del tamaño del cerebelo en los amniotas, por lo que el cerebelo un excelente modelo para estudios de evo-devo del cerebro de los vertebrados. Las células que constituyen el EGL, progenitores granulares del cerebelo, también representan una célula importante de origen para el meduloblastoma, el tumor neuronal pediátrica más frecuente. Después de la amplificación de tránsito, los precursores de gránulos migran radialmente en la capa granular interna del cerebelo donde representan la mayor población neuronal en el cerebro mamífero maduro. En polluelo, el pico de la proliferación EGL se produce hacia el final de la segunda semana de gestación. Con el fin de apuntar a la modificación genética a esta capa enel pico de la proliferación, hemos desarrollado un método para la manipulación genética a través ex vivo electroporación de rebanadas cerebelo de embriones Día 14 embriones de pollo. Este método recapitula varios aspectos importantes de desarrollo in vivo de las neuronas gránulo y será útil en la generación de un conocimiento profundo de la proliferación de células granulares del cerebelo y la diferenciación, y por lo tanto del desarrollo del cerebelo, la evolución y la enfermedad.

Introduction

El cerebelo se encuentra en el extremo anterior de la parte posterior del cerebro y es responsable de la integración de procesamiento sensorial y motora en el cerebro madura, así como la regulación de los procesos cognitivos superiores 1. En los mamíferos y las aves, posee una morfología elaborado y está fuertemente foliada, un producto de la extensa amplificación de tránsito de progenitores durante el desarrollo que produce más de la mitad de las neuronas en el cerebro adulto. El cerebelo ha sido objeto de estudio para los neurobiólogos durante siglos y en la era molecular asimismo ha recibido mucha atención. Esto se refiere no sólo a su biología inherentemente interesante, pero también al hecho de que está fuertemente implicado en la enfermedad humana, incluyendo trastornos genéticos del desarrollo tales como trastornos del espectro autista 2 y lo más prominente que el cáncer cerebelosa, meduloblastoma 3, que es el cerebro pediátrica más frecuente tumor. Es importante destacar que es un excelente sistema modelo dentro which para estudiar la asignación de destino y la neurogénesis durante el desarrollo cerebral 4. En los últimos años, también se ha establecido como un sistema modelo para el estudio comparativo del desarrollo del cerebro, debido a la gran diversidad de formas de cerebelo visto a través de la filogenia de los vertebrados 10.5.

El cerebelo se desarrolla desde el medio dorsal de rhombomere 1 en el cerebro posterior 11 y su desarrollo se compone de dos poblaciones progenitoras primarias, el labio rómbico y la zona ventricular. El labio rómbico se extiende alrededor de la región dorsal del neuroepitelio del cerebro posterior en la frontera con la placa de techo. Es el lugar de nacimiento de las neuronas excitadoras glutamatérgicas del cerebelo 12.14. La zona ventricular da lugar a las neuronas del cerebelo GABAérgicas inhibitorias, lo más prominente las neuronas de Purkinje grandes 14,15. Más adelante en el desarrollo (desde aproximadamente el día embrionario 13,5 en el ratón; e6 en chick 16), Progen glutamatérgicaITORS migran tangencialmente desde el labio rómbico y formar una capa pial de progenitores: una zona progenitor secundaria llamada la capa de gránulos externa (EGL). Es esta capa que sufre la extensa amplificación de tránsito que lleva a la gran cantidad de neuronas granulares se encuentran en el cerebro maduro.

Proliferación en el EGL larga se ha relacionado con la localización sub-pial que resulta de la migración tangencial desde el labio rómbico 17, con el interruptor de salida del ciclo celular y la diferenciación neuronal de células progenitoras que se asocia con su salida de la capa de EGL exterior hacia el centro EGL 18. La migración tangencial extensivo de células granulares post-mitótico en el eje medial-lateral se produce en el medio y EGL interior 19, antes de la migración radial definitiva en la capa de gránulos interior de la corteza cerebelosa maduro. La migración de células del labio rómbico sobre la superficie cerebelosa es dependiente de la señalización de CXCL12 de la pia 20-22 de 23-25. Curiosamente, los estudios de microscopía electrónica 17 han sugerido que las células EGL con una morfología proliferativa mantienen contacto pial, que une el comportamiento celular con capacidad proliferativa en una forma que recuerda de los progenitores basales de la corteza de mamíferos 26. Esto se refleja en la estratificación antes mencionado de la EGL en tres subcapas que se definen por ambientes extracelulares distintos y donde los precursores de los gránulos tienen distinta expresión génica signaturas 18.

Proliferación de los progenitores en el oEGL se produce con una distribución normal de tamaños de clones de tal manera que cuando los progenitores son individualmente marcadas genéticamente al final del desarrollo embrionario en el ratón, dan lugar a un promedio de 250-500 g mediana de postmitoticneuronas ranule 27,28. Proliferación depende de la señalización de SHH mitogénica de las neuronas de Purkinje subyacente 29-32. La capacidad de responder a SHH ha demostrado ser totalmente dependiente de la expresión autónoma de células del factor de transcripción Atoh1, tanto in vitro como in vivo 33 34,35. Del mismo modo, salida del ciclo celular y la diferenciación se ha demostrado que dependen de la expresión del factor de transcripción aguas abajo NeuroD1 36, que es probable que un represor directa de Atoh1 37.

A pesar de este progreso, y un considerable avance en el desciframiento de la base biológica de células de salida del ciclo celular 38 a 42, el mecanismo molecular fundamental (s) que subyacen a la decisión de salir del ciclo celular y la transición de un progenitor a una neurona diferenciación y la la migración tangencial postmitotic asociada en el EGL interior, así como el interruptor de tardea la migración radial, siendo incompleta entendido. Esto es en gran medida debido a la intratabilidad experimental de la EGL: se está desarrollando tarde, y difícil de dirigir genéticamente ya que muchas de las mismas moléculas neurogénicos también son cruciales antes en la vida de los precursores de gránulos en el labio rómbico. Para superar este problema, numerosos autores han desarrollado in vivo y ex vivo electroporación como un método para dirigir el cerebelo postnatal en roedores 43-48. Aquí, pioneros en el uso de la electroporación ex vivo en chick para estudiar la EGL, que representa considerables ventajas en términos de coste y conveniencia. Nuestro método de electroporación y cultivo ex vivo rebanada de tejido cerebeloso chica utiliza el tejido diseccionado a partir del día embrionario 14 pollitos en el pico de la proliferación de EGL. Este método permite la orientación genética de la EGL independientemente del labio rómbico y será el escenario para la disección genética de la transición del gránuloprogenitoras de neuronas gránulo postmitotic en el cerebelo.

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Protocol

Nota: Todos los experimentos se realizaron con arreglo a la del Kings College de Londres, Reino Unido y las pautas de cuidado de animales Reino Unido Home Office.

1. Disección de e14 Cerebelo

  1. Incubar huevos marrones gallina embrionados a 38 ° C para el día embrionario 14.
  2. Con una tijera de huevo decapitan embrión de pollo in ovo y quitar la cabeza a una placa de Petri que contiene el hielo frío PBS (Figura 1).
  3. Con unas pinzas estándar, hacer incisiones detrás de cada ojo todo el camino a través del tejido, la eliminación de los ojos y la mandíbula superior. Hacer una segunda incisión todo el camino a través de la faringe retirar la mandíbula inferior (Figura 1B).
  4. Con unas pinzas estándar, quitar toda la piel de la superficie del cráneo pelando lejos (Figura 1C) y retirar los huesos frontal y parietal, revelando cerebro.
  5. Desde un aspecto ventral, eliminar el cartílago de la faringe y el mesénquima auxiliar.
  6. Desde una cara dorsal, cuidadoly eliminar dorsal mesénquima al cerebro posterior teniendo cuidado de no dañar pia, y el cerebro entero separado (Figura 1D).
  7. Hacer incisión todo el camino a través del tejido entre el cerebro medio y cerebro posterior y el cerebro posterior separada incluyendo cerebelo (Figura 1E).
  8. Al hacer incisiones todo el camino a través del tejido en ambos cruces laterales del cerebelo y la placa alar del cerebro posterior, retire toda cerebelo, teniendo cuidado de mantener la integridad de la pia en toda la disección (Figura 1F). Retire la formación de plexo coroideo (Figura 1G).
  9. Mueva el cerebelo diseccionado en hielo frío HBSS.

2. Cortar Cultura de e14 Cerebelo

  1. Transferir todo el cerebelo a la plataforma estéril de un tejido Chopper usando una espátula o una pipeta Pasteur 3 ml con la punta cortada para ensanchar la abertura. Retire el exceso de líquido con una pipeta.
  2. Cortar toda cerebelo todo en tque requiere orientación a 300 micras de espesor usando el cortador de tejidos ajuste a una velocidad de corte a 50% del máximo. La integridad del tejido es más fácil de conserva en corte sagital; Sin embargo, la orientación es también una consideración importante para el análisis de células (células de Purkinje dendritas se sagitalmente alineados, mientras que los axones de células granulares corren transversalmente, perpendicular al plano de las dendritas células de Purkinje).
  3. Utilizando una pipeta Pasteur de 3 ml, cubra el cerebelo en rodajas en el hielo frío HBSS.
  4. Transfiera las rebanadas en HBSS a una placa de Petri de 60 mm que contiene hielo frío fresco HBSS usando una pipeta Pasteur 3 ml con punta de corte.
  5. Bajo un microscopio de disección iluminado con una fuente de luz de fibra óptica, que exista una separación de las rebanadas individuales utilizando fórceps relojero. Identificar las rebanadas que se electroporación, basada en su integridad del tejido y la posición medio-lateral.
    Nota: Cada disección del embrión a través de cortar la incubación en medio de cultivo tarda alrededor de 10 a 20 minutos dependiendo upoexperiencia n. Realizar disecciones uno a la vez para asegurar que cerebella pasar cantidad mínima de tiempo entre decapitación y cultivo ex vivo.

3. La electroporación de Slices

  1. Construir una cámara de electroporación mediante la fijación del ánodo de un electroporador a la base de un 60 mm placa de Petri con cinta aislante. Añadir aproximadamente 1 ml de HBSS para cubrir el electrodo.
  2. Coloque un inserto de 0,4 micras cultura en la parte superior del electrodo cubierto en HBSS. Deje que el inserto de la cultura para descansar en el electrodo asegurándose de que no siempre es el contacto entre el inserto y el electrodo.
    Nota: En esta configuración, el inserto de cultivo con las rodajas descansará sobre la superficie de la solución, manteniendo el circuito pero permitiendo la orientación espacial del cátodo.
  3. Rebanadas identificados transferencia (hasta cinco por la cultura de inserción) sobre inserto de cultivo utilizando 3 ml pipeta Pasteur con la punta de corte. Separar y dejar reposar en inserto de cultivo en un sagittorientación al.
  4. Con una pipeta, eliminar el exceso de HBSS para que las rebanadas ya no son bañados en solución.
  5. Utilizando una punta de pipeta P10, el ADN de la pipeta (a una concentración de 1 g / l) diluido con 20% verde rápido sobre la superficie de la región de orientación de una rebanada. 20% verde rápido asegura solución de ADN viscoso y evita prohibitivamente amplia dispersión de ADN. Añadir aproximadamente 5 ADN l / solución verde rápido para cada sector (Figura 2B).
  6. Coloque el cátodo sobre tejido objetivo deseado y electroporar con 3 x 10 V, 10 pulsos mseg de duración. Evitar el contacto directo del cátodo con el tejido. En lugar de ello, se aprovechan de la tensión superficial del líquido para mantener la conductancia (colocar el cátodo tan cerca del tejido como sea posible sin tocar realmente el tejido).
  7. Repita la entrega de ADN y la electroporación a múltiples regiones de EGL en cada rebanada cerebelosa individuo si lo deseas.
  8. Al término de la electroporación, inse cultura transferenciart a 30 mm placa de Petri.
  9. Para cada cultivo, añadir 1 ml de medio de cultivo precalentado (medio basal de Eagle, 0,5% (w / v) D - (+) - glucosa, 1% de suplemento de B27, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina) por debajo de la inserción de cultivo de tal manera que el inserto de cultivo está en contacto con el medio, pero rodajas no se bañan en ella.
  10. Incubar los cultivos a 37 ° C / 6% de CO 2 durante un máximo de 3 días. Reemplace todo el medio de cultivo cada 24 hr con medio precalentado fresco.
  11. A raíz de la cultura, fijar las rebanadas en la cultura inserta durante 1 hora en paraformaldehído al 4% (o O / N a 4 ° C) en un nuevo plato de 30 mm sin medios de cultivo.

4. Obtención de imágenes de cerebelosos Rebanadas

  1. Después de la fijación, lavar rebanadas 3 veces durante 5 min en PBS.
  2. El uso de una hoja de afeitar, diseccionar cada rebanada cerebelosa electroporación y culta de la inserción del cultivo cortando alrededor de la porción y la eliminación de la división y la región de inserción que se adhiere a. HacerNo intente extraer la rebanada de la superficie de inserción del cultivo.
  3. Mount rodajas de aproximadamente 1 ml de medio de montaje que contiene DAPI (si se desea) bajo un cubreobjetos con cuidado de no introducir burbujas, y la imagen mediante escaneo láser microscopía confocal.
    Nota: los parámetros de imagen se pueden variar de acuerdo con las construcciones de electroporación, y a discreción del usuario individual.

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Representative Results

En esta sección se ilustra ejemplos de los resultados que se pueden obtener mediante electroporación y la cultura del cerebelo rebanada de embriones Día 14 pollitos. La disección del cerebelo se ilustra en la Figura 1 y la cámara de electroporación establecido se muestra en la Figura 2. Se demuestra que es posible para electroporar y con éxito rebanadas cerebelares de cultivo, que retienen su estructura y morfologías celulares in vitro (Figura 3A). Electroporación apuntado a folia individuales se logra fácilmente (Figura 3B). Nos éxito electroporar un número de diferentes plásmidos en las células de EGL y demostrar que es posible i) para marcar las células con el reportero construye para observar su comportamiento (Figura 3C), ii) para probar posibles regiones genómicas para la funcionalidad en las células del cerebelo (Figura 3D ), y iii) para manipular genéticamente lacélulas en el EGL por misexpressing proteínas de interés (Figura 3E). Además, son posibles manipulaciones farmacológicas en rebanadas electroporadas (resultados no mostrados). Después de cultivar es posible realizar análisis de tejido adicional, tal como ensayos de inmunohistoquímica o proliferación (Figura 3F). Realizamos análisis de salud de los tejidos por calbindina y PH3 inmunotinción y demostrar que la integridad del tejido se mantiene durante al menos 3 div después del cultivo (Figura 4). Estos resultados demuestran que la EGL es ahora una estructura accesible y fácil de manipular que puede ser totalmente examinó y genéticamente alterado en el sistema modelo de pollo.

Figura 1
Figura 1. Disección del cerebelo de embriones de pollo E14. (A) decapitar al polluelo en el huevo y quite la cabeza intplato oa Petri con PBS helado. Retire la mandíbula inferior y los ojos al hacer la incisión detrás de los ojos y la faringe (línea discontinua). (B) Retire la piel de la superficie del cráneo. (C) Retire los huesos frontal y parietal y (D) retire el cerebro desde el mesénquima y el cartílago que lo rodea. (E) En virtud de un microscopio de disección identificar la ubicación del cerebelo en el extremo posterior del cerebro. Cortar entre el cerebro medio y cerebro posterior (líneas de puntos) que se queda con el cerebelo y cerebro posterior ventral. (F) hacer incisiones en las uniones laterales (pedúnculos) del cerebelo para separar el cerebelo del cerebro posterior (línea discontinua). (G) Retire el plexo coroideo (asterisco) de la parte ventral del cerebelo, hasta que se quedan con un cerebelo todo intacto con el pia adjunto. Transferir el cerebelo en helada HBSS antes de preparar las rebanadas con un chopp tejidoer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. La cámara de electroporación para este compromiso. (A) Una imagen de la cámara de electroporación a medida. La cámara consta de un ánodo de un electroporador colocado de forma segura en la base de un 60 mm placa de Petri. El plato contiene aproximadamente 1 ml de HBSS para cubrir el electrodo. El inserto de cultivo debe descansar sobre el electrodo con un contacto constante entre el inserto y el electrodo, manteniendo el circuito pero permitiendo la orientación espacial del cátodo, que es manipulado por la mano. (B) Una foto de rebanadas siendo electroporación. Rebanadas están cubiertos con la solución verde ADN / rápido. Las rodajas se electroporación como el deseod: la electroporación puede ser dirigido a uno folium o varias ubicaciones. Después de la electroporación el inserto se coloca en un plato Petri 30 mm con medio de cultivo pre-calentado y se cultivaron en la incubadora. 1. El ánodo 2. El cátodo 3. inserto Cultura 4. placa de Petri con 1 ml de HBSS 5. microscopio de disección 6. rebanadas individuales de cortador de tejidos 7. solución de ADN con el tinte verde rápido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

figura 3
Figura 3. Los resultados representativos. (A) Una imagen de bajo aumento de un electroporación control de un plásmido que codifica RFP en el EGL en múltiples ubicaciones. El tejido conserva su estructura y células electroporadas son claramente visibles en una capa de espesor subpial del cerebelo. (B) Unejemplo de una electroporación con un plásmido dirigido GFP control. El folium objetivo se indica con un asterisco. Barra de escala AB = 500 micras. (C) Un ejemplo donde una construcción que codifica GFP impulsado por un promotor de Atoh1 ha sido electroporación en la EGL. La expresión de Atoh1 define a los precursores de células granulares en el EGL. Diversas morfologías celulares son claramente visibles a los 3 div y comportamiento de las células pueden ser monitoreados. (D) Un ejemplo de etiquetado después de la electroporación de una construcción que contiene un elemento putativo conservado no codificante (CNE) del gen NeuroD1 conducción GFP. La CNE reporta actividad en las células esperados en base a la expresión endógena NeuroD1 sugiriendo un papel activo de este CNE en el desarrollo. NeuroD1 expresión se correlaciona con la iniciación de la diferenciación de células granulares. (E) Un ejemplo donde el tejido puede ser manipulado genéticamente por misexpression de la proteína NeuroD1 y un cambio en behav de células granularestamiento se puede observar. (F) Un ejemplo donde el tejido a electroporación (control plásmido GFP) se puede fijar y se tiñeron para los marcadores de células proliferantes, tales como fosfohistona H3 (PH3). Barra de escala CF = 50 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. integridad tisular y proliferación en cultivo. (A - C) Calbindin tinción de E14 tejido cerebelar a electroporación con un plásmido GFP control en 1-3 días in vitro (div). Tinción Calbindin muestra que la integridad del tejido se mantiene en cultivo durante al menos 3 div. La capa de células de Purkinje no forma una monocapa en esta etapa en el desarrollo del polluelo, pero se ve claramente la formación de una capa debajo de laEGL donde se encuentran las células granulares (verde). (D) fosfohistona H3 (PH3) tinción en el tejido cerebeloso cultivaron durante 2 div. Tinción PH3 es visible en las EGL (flechas), sino también en otras regiones del cerebelo (puntas de flecha). Esta tinción es representativa de todas las etapas de la cultura examinados (1-3 div). Barra de escala AD = 50 micras Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo informó aquí describe un método para la disección, la electroporación y cultivo de rebanadas de embrionario Día 14 cerebelo del polluelo. Este protocolo permite la focalización de electroporación para pequeñas regiones focales de la EGL, incluyendo aislados focalización de los lóbulos del cerebelo individuales. Permite el análisis genético y de imagen en alta resolución y conveniencia, ya un bajo costo en comparación con las técnicas establecidas en roedores 43-47. Este análisis no es posible en la actualidad in vivo debido al largo período de desarrollo del tiempo, la escasez de posibilidades EGL-específicos de orientación genética en el ratón y el carácter común de los mecanismos moleculares entre el labio rómbico y el EGL, lo que significa que las alteraciones que pueden afectar EGL biología con frecuencia no se puede analizar ya que afectan la neurogénesis labio rómbico y derogar la formación EGL 49. Por lo tanto nuestro sistema representa un gran avance en términos de focalización modificación genética a la EGL specifically, y anticipamos que será aplicable a otras especies más allá de la chica que tal vez de interés comparativo, como mamíferos no modelo y reptiles.

En la realización de la técnica de electroporación cultura rebanada, una serie de consideraciones técnicas son de suma importancia. En primer lugar, la robustez de las rebanadas de sobrevivir en cultivo sin por una parte extensa de someterse a la muerte celular o en el otro integridad estructural perder limita el espesor de la rebanada a 300 micras en nuestras manos. Una segunda consideración importante es la viscosidad de la solución de ADN, lo que asegura la electroporación de ADN en concentraciones que son lo suficientemente alta como para inducir niveles pertinentes visibles o de modificación genética. En electroporación in ovo de soluciones de ADN se inyecta en el cerebro posterior temprana embrionaria, las concentraciones de tinte verde rápido de aproximadamente 1% son típicos. Sin embargo, en nuestro protocolo, se suelen utilizar concentraciones de verde rápido del 20%. Esto asegura una suficiente vissolución de ADN cous para prevenir la dispersión de la DNA siguiente pipeteo pero antes de la electroporación, pero suficientemente diluir una para mediar la conducción eléctrica eficiente.

Además de estas consideraciones técnicas, se observó que el comportamiento proliferativo que observamos ex vivo hace no precisamente partido que predice a partir de los estudios in vivo debido, probablemente, a la integridad pial ser interrumpido por la preparación del tejido. Bajo tales condiciones, cuando se sometió a electroporación una construcción de expresión GFP, una gran proporción de células electroporadas parece haber dejado el ciclo celular después de sólo un día de cultivo, a juzgar por la tinción de PH3 (Figura 3F). Esto no se correlaciona con el comportamiento esperado proliferativa EGL, donde la proliferación de clones de ratón y de pollo se extiende durante un período de tiempo grande 27. La implicación de que la pia modula la proliferación es apoyada por la observación de que cuando nos electroporar una construc reporterot con un elemento regulador de la expresión motriz NeuroD1 de GFP todas las células electroporadas expresan GFP después de un día de la cultura (Figura 3D). En vivo, esta construcción espejos expresión NeuroD1 endógena en marcar células del EGL interior que son post-mitótico 36,37, mientras que la longitud completa NeuroD1 es suficiente para conducir la diferenciación celular (Figura 3E). Esto sugiere que bajo ciertas condiciones, la capacidad proliferativa de las células puede no ser mantenida como lo es en la EGL exterior en las etapas equivalentes en vivo. Tinción PH3 embargo, no sugieren que hay una gran cantidad de la proliferación en la cultura, a menudo localizado en el área de EGL (Figura 4D). Amplia proliferación fuera del EGL indica posiblemente reforzada gliogenesis o la proliferación de precursores Pax2 GABAérgicas en la materia blanca. La implicación es que la interpretación de cualquier procedimiento experimental tendrá que tomar el en cuenta la proliferativ anteriorcomportamiento e, el hecho de que las células de Purkinje no forman una monocapa hasta E18 en polluelo y que el desarrollo normal puede verse comprometida después de la preparación rebanada (por ejemplo, debido a la falta de interacción con la escalada de fibras etc.)

A pesar de estas limitaciones, nuestro protocolo representa un importante paso adelante en relación con el estudio de muchos aspectos de la biología de células granulares. La ventaja fundamental de permitir espacial y temporalmente el etiquetado específico de la EGL a diferencia del labio rómbico facilitará múltiples exámenes del tanto de la biología de las células de progenitores granulares y la regulación genética que sustenta de una manera que no es posible en la actualidad en vivo. Nuestra técnica en chick complementará vivo de la cultura y de electroporación protocolos existentes ex en roedores 43-48 y lleva a las considerables ventajas en costo y la conveniencia que se asocian con el polluelo. Además, representa un avance significativo con respectolas técnicas existentes de progenitores cultivo granulares 39. Si bien complementará en lugar de sustituir a éste, nuestro protocolo se abrirá el control de la diferenciación gránulo neurona a una amplia variedad de tratamientos farmacéuticos y para la diversidad de las manipulaciones genéticas de células autónomas que son posibles en el pollo. Proporciona una base para el examen de biología de células granulares en un detalle sin precedentes.

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Acknowledgments

El método presentado en este artículo surgió de un trabajo financiado por el BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) y una beca de doctorado MRC (MH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Ltd Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco) Life Technologies 41010-026
L-glutamine Sigma G7513
penicillin/streptomycin Sigma P4333
0.4 μm culture insert Millipore PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator  Intracel 01-916-02 Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.

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Biología del Desarrollo Número 106 el cerebelo el desarrollo polluelo capa granular externa la cultura rebanada células granulares células de Purkinje electroporación.
<em>Ex Vivo</em> Cultura de polluelo cerebelosos Rebanadas y espacialmente focalizadas Electroporación de gránulos precursores celulares
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Hanzel, M., Wingate, R. J. T.,… More

Hanzel, M., Wingate, R. J. T., Butts, T. Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors. J. Vis. Exp. (106), e53421, doi:10.3791/53421 (2015).

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