Summary
Lo strato granulare esterno cerebellare è il sito della più grande amplificazione transito nel cervello sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo di indirizzare la modificazione genetica di questo strato al culmine della proliferazione usando ex vivo elettroporazione e la cultura di fette cerebellare da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo.
Abstract
Lo strato cerebellare granuli esterno (EGL) è il sito del più grande ampliamento di transito nel cervello in via di sviluppo, e un ottimo modello per studiare la proliferazione e la differenziazione neuronale. Inoltre, le modifiche evolutive della sua capacità proliferativa sono stati responsabili per la drammatica espansione delle dimensioni del cervelletto nei amnioti, rendendo il cervelletto un ottimo modello per gli studi evo-devo del cervello dei vertebrati. Le cellule che costituiscono il EGL, progenitori dei granuli cerebellari, rappresentano anche una cella significativo di origine per medulloblastoma, il più comune tumore pediatrico neuronale. A seguito di transito amplificazione, precursori dei granuli migrano radialmente nello strato granulare interno del cervelletto, dove essi rappresentano la più grande popolazione neuronale nel cervello dei mammiferi maturo. In pulcino, il picco di EGL proliferazione avviene verso la fine della seconda settimana di gestazione. Al fine di indirizzare la modificazione genetica di questo strato ail picco della proliferazione, abbiamo sviluppato un metodo per la manipolazione genetica ex vivo attraverso elettroporazione di fette cervelletto da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo. Questo metodo riassume alcuni aspetti importanti di in vivo granuli sviluppo dei neuroni e sarà utile per generare una conoscenza approfondita delle cerebellare proliferazione delle cellule dei granuli e la differenziazione, e quindi dello sviluppo del cervelletto, l'evoluzione e la malattia.
Introduction
Il cervelletto si trova all'estremità anteriore del romboencefalo ed è responsabile per l'integrazione di elaborazione sensoriale e motore nel cervello maturo e regolazione dei processi cognitivi elevati 1. Nei mammiferi e uccelli, possiede una morfologia complessa ed è fortemente lamellare, un prodotto di ampio amplificazione transito dei progenitori durante lo sviluppo che produce oltre la metà dei neuroni nel cervello adulto. Il cervelletto è stato oggetto di studio per neurobiologi da secoli e in epoca molecolare ha anche ricevuto notevole attenzione. Ciò si riferisce non solo alla sua intrinsecamente interessante biologia, ma anche per il fatto che essa è fortemente implicata nella malattia umana, compresa malattie genetiche dello sviluppo come disturbi dello spettro autistico 2 e più visibile il tumore cerebellare, il medulloblastoma 3, che è il cervello pediatrico più diffuso tumore. È importante sottolineare che si tratta di un ottimo sistema modello entro which per studiare l'allocazione destino e neurogenesi durante lo sviluppo cerebrale 4. Negli ultimi anni, è stato anche affermato come sistema modello per lo studio comparato di sviluppo del cervello, a causa della grande diversità di forme cerebellari visto attraverso la filogenesi dei vertebrati 5-10.
Il cervelletto si sviluppa dalla metà dorsale del rhombomere 1 in romboencefalo 11 ed evolutivamente comprende due popolazioni progenitrici primari, il labbro rombico e zona ventricolare. Il labbro romboidale si estende intorno alla regione dorsale del neuroepitelio del romboencefalo al confine con la lamiera del tetto. E 'il luogo di nascita dei neuroni eccitatori glutamatergici del cervelletto 12-14. La zona ventricolare suscita le inibitorie GABAergiche neuroni del cervelletto, il più prominente dei grandi neuroni Purkinje 14,15. Più tardi, in fase di sviluppo (da circa 13,5 giorno embrionali nel topo; e6 in pulcino 16), glutamatergico Progenmodifiche ai contenuti migrano tangenzialmente dal labbro romboidale e formano uno strato pial di progenitori: una zona progenitore secondaria chiamato lo strato esterno dei granuli (EGL). È questo livello che subisce l'ampia amplificazione di transito che conduce l'enorme numero di neuroni granulari presenti nel cervello maturo.
Proliferazione nel EGL è stata a lungo legata alla posizione sub-pial che deriva dalla migrazione tangenziale dalla rombico labbro 17, con l'interruttore di uscita del ciclo cellulare e la differenziazione neuronale di progenitori essendo associato con la loro uscita dallo strato esterno EGL in mezzo EGL 18. Extensive migrazione tangenziale di cellule granulari post-mitotici in asse mediale-laterale si verifica nel mezzo ed interno EGL 19, prima finale migrazione radiale nello strato granuli interno della corteccia cerebellare maturo. La migrazione delle cellule dal labbro rombico sulla superficie cerebellare dipende segnalazione CXCL12 dalla pia 20-22 23-25. Curiosamente, elettroni studi microscopici 17 hanno suggerito che le cellule EGL con una morfologia proliferativa mantenere il contatto piale, che collega il comportamento delle cellule con capacità proliferativa in un modo che ricorda i progenitori basali della corteccia dei mammiferi 26. Ciò si riflette nel summenzionato stratificazione della EGL in tre sottolivelli che sono definiti da distinti ambienti extracellulari e dove precursori dei granuli hanno genica distinto firme 18.
Proliferazione di progenitori nel oEGL avviene con una normale distribuzione delle dimensioni clone tale che quando progenitori sono singolarmente geneticamente etichettati al termine dello sviluppo embrionale nel topo, danno luogo ad una media di 250-500 mediana postmitotici gneuroni ranule 27,28. Proliferazione dipende segnalazione SHH mitogenic dal sottostante Purkinje neuroni 29-32. La capacità di rispondere a SHH ha dimostrato di essere interamente dipendente cella autonoma espressione del fattore di trascrizione Atoh1, sia in vitro che in vivo 33 34,35. Allo stesso modo, l'uscita del ciclo cellulare e la differenziazione ha dimostrato di essere dipendente dalla espressione del fattore di trascrizione a valle NeuroD1 36, che è probabilmente un repressore diretta di Atoh1 37.
Nonostante questi progressi, e un notevole avanzamento nel decifrare la cellula base biologica di uscita ciclo cellulare 38-42, i meccanismi molecolari fondamentali (s) che sono alla base della decisione di uscire dal ciclo cellulare e la transizione da un progenitore di un neurone di differenziazione, e la associato postmitotici migrazione tangenziale nel EGL interno così come l'interruttore dopoalla migrazione radiale, rimanere completamente sconosciuto. Questo è in gran parte a causa della intrattabilità sperimentale della EGL: si sta sviluppando tardi, e difficili da indirizzare geneticamente poiché molte delle stesse molecole neurogenici sono anche fondamentale precedenza nella vita dei precursori dei granuli al labbro romboidale. Per superare questo problema, numerosi autori hanno sviluppato in vivo e ex vivo elettroporazione come metodo per indirizzare il cervelletto postnatale nei roditori 43-48. Qui, la strada nell'uso di ex vivo elettroporazione in pulcino per studiare la EGL, che rappresenta notevoli vantaggi in termini di costi e convenienza. Il nostro metodo di elettroporazione e ex vivo della cultura fetta di tessuto cerebellare pulcino utilizza tessuto sezionato dal giorno embrionale 14 pulcini al culmine di EGL proliferazione. Questo metodo permette di targeting genetico della EGL indipendentemente dal labbro romboidale e porranno le basi per la dissezione genetica della transizione da granuliprogenitore di postmitotici neurone granello nel cervelletto.
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Protocol
Nota: Tutti gli esperimenti sono stati effettuati con conformità a King College di Londra, Regno Unito e le linee guida per la cura degli animali nel Regno Unito Home Office.
1. La dissezione di e14 cervelletto
- Incubare le uova marroni embrionate di gallina a 38 ° C e 14 ° giorno embrionale.
- Utilizzando le forbici uovo decapitano embrione di pollo in ovo e rimuovere la testa di una capsula di Petri contenente ghiaccio PBS freddo (Figura 1A).
- Utilizzando pinze standard, fare incisioni dietro ogni occhio tutto il percorso attraverso il tessuto, rimuovere gli occhi e mascella superiore. Effettuare una seconda incisione tutto il percorso attraverso la faringe rimuovere la mascella inferiore (Figura 1B).
- Utilizzando pinze standard, rimuovere tutta la pelle dalla superficie del cranio con il peeling via (Figura 1C) e rimuovere le ossa frontali e parietali, rivelando cervello.
- Dal punto di vista ventrale, rimuovere faringeo cartilagine e mesenchima ausiliario.
- Da un lato dorsale, attentoly rimuovere mesenchima dorsale per romboencefalo facendo attenzione a non danneggiare pia, e tutto il cervello separato (Figura 1D).
- Effettuare un'incisione tutto il percorso attraverso il tessuto tra mesencefalo e rombencefalo rombencefalo e separato tra cervelletto (Figura 1E).
- Facendo incisioni tutto il percorso attraverso il tessuto ad entrambe le giunzioni laterali del cervelletto e piatto alare del hindbrain, rimuovere tutta cervelletto, avendo cura di mantenere l'integrità del pia tutta dissezione (Figura 1F). Rimuovere la formazione plesso coroideo (Figura 1G).
- Spostare il cervelletto sezionato in freddo ghiaccio HBSS.
2. Fetta Cultura della E14 cervelletto
- Trasferire la cervelletto alla piattaforma sterile di un Tissue Chopper utilizzando una spatola o un 3 ml pipetta Pasteur con la punta asportate per allargare l'apertura. Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta.
- Tagliare tutto intero cervelletto in tha richiesto orientamento a 300 micron di spessore utilizzando il chopper tessuto impostare una velocità di taglio al 50% del massimo. L'integrità dei tessuti è più facilmente conservato in sezione sagittale; tuttavia, l'orientamento è anche un fattore importante per l'analisi delle cellule (cellule di Purkinje dendriti sono sagittalmente allineati, mentre assoni delle cellule granuli corrono trasversalmente, perpendicolare al piano di dendriti di cellule di Purkinje).
- Usando una pipetta Pasteur 3 ml, coprire il cervelletto tagliato a freddo ghiaccio HBSS.
- Trasferire le fettine in HBSS a una capsula di Petri 60 millimetri contenente ghiaccio fresco HBSS freddo con un 3 ml pipetta Pasteur con la punta tagliata.
- Sotto un microscopio da dissezione illuminato con una sorgente di luce a fibre ottiche, garantire la separazione delle singole porzioni utilizzando pinze orologeria. Identificare le fette da elettroporate, basato sulla loro integrità dei tessuti e la posizione medio-laterale.
Nota: Ogni dissezione dall'embrione attraverso tagliare incubazione in terreno di coltura dura circa 10-20 minuti a seconda upoesperienza n. Eseguire dissezioni una alla volta a garantire che cervelletti spendere quantità minima di tempo tra decapitazione ed ex vivo della cultura.
3. elettroporazione di fette
- Costruire una camera di elettroporazione fissando l'anodo di un elettroporatore alla base di una capsula di Petri 60 mm con nastro isolante. Aggiungere circa 1 ml di HBSS per coprire l'elettrodo.
- Collocare un inserto 0,4 micron cultura sopra dell'elettrodo rivestito in HBSS. Lasciare l'inserto cultura per riposare sull'elettrodo assicurandosi che c'è sempre il contatto tra l'inserto e l'elettrodo.
Nota: In questa configurazione, l'inserto di coltura con le fette poggerà sulla superficie della soluzione, mantenendo il circuito ma permettendo il targeting spaziale del catodo. - Fette identificati di trasferimento (fino a cinque per inserto cultura) sui inserto cultura con 3 ml pipetta Pasteur con la punta tagliata. Separati e lasciare riposare su inserto cultura in un sagittAl orientamento.
- Usando una pipetta, rimuovere l'eccesso di HBSS in modo che le fette siano più immersi in soluzione.
- Usando una pipetta punta P10, pipetta DNA (ad una concentrazione di 1 mg / mL) diluito con il 20% veloce verde sulla superficie della regione di destinazione di una fetta. 20% verde veloce assicura soluzione di DNA viscosa e impedisce proibitivamente ampia dispersione del DNA. Aggiungere circa 5 DNA microlitri / veloce soluzione verde per ogni sezione (Figura 2B).
- Posizionare il catodo, nel tessuto mirato desiderato e l'elettroporazione con 3 x 10 V, 10 impulsi di durata msec. Evitare il contatto diretto del catodo con il tessuto. Invece, usate tensione superficiale del liquido per mantenere conduttanza (posizionare il catodo più vicino al tessuto come possibile senza toccare il tessuto).
- Ripetere la consegna del DNA ed elettroporazione di più regioni di EGL su ogni singola porzione del cervelletto, se lo desideri.
- Al termine di elettroporazione, cultura trasferimento Insert a 30 mm piastra di Petri.
- Per ogni cultura, aggiungere 1 ml di terreno di coltura pre-riscaldato (basale medio Aquila, 0,5% (w / v) D - (+) - glucosio, 1% supplemento B27, 2 mM di L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina) sotto l'inserto cultura tale che l'inserto cultura è in contatto con il mezzo, ma fette non sono immersi in esso.
- Incubare culture a 37 ° C / 6% CO 2 fino a 3 giorni. Sostituire tutto il terreno di coltura ogni 24 ore con terreno fresco pre-riscaldato.
- Dopo coltura, fissare fette su inserti coltura per 1 ora a 4% paraformaldeide (o O / N a 4 ° C) in un piatto fresco 30 mm senza mezzi di coltura.
4. Imaging di cerebellari Fette
- Dopo fissazione, lavare fette 3 volte per 5 minuti in PBS.
- Utilizzando una lama di rasoio, sezionare ogni fetta cerebellare elettroporate e colta dall'inserto cultura tagliando intorno la fetta e la rimozione della fetta e la regione di inserto viene rispettato. FareNon tentare di rimuovere fetta dalla superficie dell'inserto cultura.
- Montare fette in circa 1 ml di mezzo di montaggio contenente DAPI (se lo si desidera) sotto un vetrino facendo attenzione a non introdurre bolle, e immagine utilizzando scansione laser microscopia confocale.
Nota: parametri di imaging possono essere variati secondo le costrutti elettroporate, ea discrezione del singolo utente.
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Representative Results
Questa sezione illustra esempi di risultati che si possono ottenere con la fetta elettroporazione e la cultura del cervelletto da embrionale Giorno 14 pulcino. La dissezione del cervelletto è illustrato nella figura 1 e la camera di elettroporazione impostato è mostrato in Figura 2. Si dimostra che è possibile per l'elettroporazione e con successo cultura fette cerebellare, che mantengono la loro struttura e morfologie cellulari in vitro (Figura 3A). Elettroporazione mirata ai singoli Folia è facilmente ottenibile (Figura 3B). Abbiamo l'elettroporazione di successo una serie di differenti plasmidi nelle cellule EGL e dimostrare che è possibile i) per etichettare le cellule con giornalista costrutti di osservare il loro comportamento (Figura 3C), ii) per testare le possibili regioni genomiche per la funzionalità delle cellule del cervelletto (Figura 3D ), e iii) per manipolare geneticamente lacellule nel EGL da misexpressing proteine di interesse (Figura 3E). Inoltre, manipolazioni farmacologiche su fette elettroporate sono possibili (risultati non mostrati). Dopo coltura è possibile effettuare analisi dei tessuti aggiuntive come immunoistochimica o proliferazione test (Figura 3F). Eseguiamo analisi salute dei tessuti da calbindina e PH3 immunostaining e dimostrare che l'integrità del tessuto è mantenuto per almeno 3 div dopo cultura (Figura 4). Questi risultati dimostrano che la EGL è ora una struttura accessibile e facilmente manipolabile che possono essere completamente esaminato e geneticamente modificata nel sistema modello pulcino.
Figura 1. Dissezione del cervelletto da E14 embrioni di pollo. (A) Decapitare il pulcino nell'uovo e rimuovere la testa intpiatto oa Petri con PBS freddo ghiaccio. Rimuovere la mascella inferiore e gli occhi facendo un'incisione dietro gli occhi e la faringe (linea tratteggiata). (B) Rimuovere la pelle dalla superficie del cranio. (C) Rimuovere il frontale e ossa parietali e (D) togliere il cervello dal mesenchima e la cartilagine che lo circonda. (E) Sotto un microscopio da dissezione identificare la posizione del cervelletto all'estremità posteriore del cervello. Tagliare tra il mesencefalo e romboencefalo (linee tratteggiate) per essere lasciato con il cervelletto e rombencefalo ventrale. (F) fare incisioni alle giunzioni laterali (peduncoli) del cervelletto di separare dal cervelletto romboencefalo (linea tratteggiata). (G) Rimuovere il plesso coroideo (asterisco) dal lato ventrale del cervelletto finché non si è lasciato con un intero cervelletto intatto con la pia allegato. Trasferire il cervelletto in ghiaccio-HBSS freddo prima di preparare le fette con un chopp tessutoer. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La camera di elettroporazione impostato. (A) Una foto della camera di elettroporazione misura. La camera consiste di un anodo di un elettroporatore saldamente posizionato sulla base di un piatto Petri 60 mm. Il piatto contiene circa 1 ml di HBSS per coprire l'elettrodo. L'inserto coltura deve appoggiare sul elettrodo con costante contatto tra l'inserto e l'elettrodo, mantenendo il circuito ma permettendo il targeting spaziale del catodo, che viene manipolato a mano. (B) Una foto di fette essere elettroporate. Fette sono coperti con il DNA / soluzione verde veloce. Le fette sono elettroporate come desideriod: elettroporazione può essere mirata a un folium o più sedi. Dopo elettroporazione l'inserto viene introdotto in una piastra di Petri con 30 mm pre-riscaldato terreno di coltura e coltivate in termostato. 1. L'anodo 2. Il piatto catodo 3. inserto Cultura 4. Petri con 1 ml di HBSS 5. dissezione microscopio 6. fette individuali da chopper tessuto soluzione di DNA 7. con veloce colorante verde. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figura.
Figura 3. Risultati rappresentativi. (A) Un quadro basso ingrandimento di un elettroporazione controllo di un plasmide codificante RFP in EGL in più posizioni. Il tessuto conserva la sua struttura e le cellule elettroporate sono chiaramente visibili in uno strato sottopiale spessore del cervelletto. (B) Unesempio di elettroporazione mirata con un plasmide di controllo GFP. Il folium di mira è indicato da un asterisco. Barra di scala AB = 500 micron. (C) Un esempio in cui un costrutto codifica GFP guidato da un potenziatore Atoh1 è stato elettroporate in EGL. L'espressione di Atoh1 definisce precursori delle cellule dei granuli all'interno della EGL. Vari morfologie di cellule sono chiaramente visibili a 3 div e il comportamento delle cellule possono essere monitorati. (D) Un esempio di etichettatura dopo l'elettroporazione di un costrutto contenente un elemento putativo conservato non codificanti (CNE) del gene GFP NeuroD1 guida. Il CNE riporta l'attività delle cellule attesi sulla base di espressione NeuroD1 endogena suggerendo un ruolo attivo di questo CNE in fase di sviluppo. Espressione NeuroD1 correla con l'inizio della differenziazione delle cellule dei granuli. (E) Un esempio in cui il tessuto può essere geneticamente manipolato da misexpression di proteine NeuroD1 e un cambiamento in granuli behav celluletamento può essere osservato. (F) Un esempio in cui il tessuto elettroporate (controllare GFP plasmide) possono essere fissate e colorate per i marcatori di cellule proliferanti, quali phosphohistone H3 (PH3). Scala bar CF = 50 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. integrità dei tessuti e la proliferazione in coltura. (A - C) calbindin colorazione dei tessuti E14 cerebellare elettroporate con un plasmide di controllo GFP a 1-3 giorni in vitro (div). Calbindin colorazione mostra che l'integrità del tessuto viene mantenuto in coltura per almeno 3 div. Lo strato di cellule di Purkinje non forma un monostrato in questa fase di sviluppo pulcino, ma si vede chiaramente formare uno strato sotto laEGL dove si trovano cellule granulari (verde). (D) Phosphohistone H3 (PH3) colorazione sul tessuto cerebellare in coltura per 2 div. PH3 colorazione è visibile nei EGL (frecce), ma anche in altre regioni cerebellari (frecce). Questa colorazione è rappresentativo di tutte le fasi di cultura esaminati (1-3 div). Barra di scala AD = 50 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui riportato descrive un metodo per dissezione, electroporating e coltura fette di embrionale Giorno 14 cervelletto dal pulcino. Questo protocollo permette di targeting di elettroporazione per piccole regioni focali della EGL, compreso isolato di mira singoli lobi cerebellari. Consente analisi genetica e di imaging ad alta risoluzione e convenienza, e ad un basso costo rispetto alle tecniche consolidate nei roditori 43-47. Tale analisi non è attualmente possibile in vivo a causa del lungo periodo di sviluppo di tempo, la scarsità di EGL-specifiche possibilità di targeting genetico nel topo, e la comunanza di meccanismi molecolari tra il labbro romboidale e la EGL, il che significa che le alterazioni che possono influenzare EGL biologia spesso non può essere analizzato in quanto influenzano rombico labbro neurogenesi e abolisce EGL formazione 49. Il nostro sistema rappresenta quindi un importante passo avanti in termini di targeting per modificazione genetica alla EGL specifically, e prevediamo che sarà applicabile ad altre specie oltre il pulcino che forse interessare comparativa, come i mammiferi non modello e rettili.
Nello svolgimento della tecnica di coltura fetta elettroporazione, una serie di considerazioni tecniche sono di primaria importanza. In primo luogo, la robustezza di fette di sopravvivere in cultura senza un lato sottoposto estesa morte cellulare o dall'altra integrità strutturale perdere limita lo spessore della fetta a 300 micron nelle nostre mani. Una seconda considerazione importante è la viscosità della soluzione di DNA, che assicura elettroporazione di DNA a concentrazioni che sono abbastanza alto da indurre livelli visibili o rilevanti di modificazione genetica. Nella elettroporazione ovo di soluzioni di DNA iniettati nella precoce rombencefalo embrionale, le concentrazioni di veloce colorante verde di circa l'1% sono tipici. Tuttavia, nel nostro protocollo, Usiamo tipicamente concentrazioni di verde veloce del 20%. Questo assicura una sufficiente vissoluzione di DNA cous per impedire la dispersione del DNA seguente pipettaggio ma prima elettroporazione, ma sufficientemente diluire uno mediare efficiente conduzione elettrica.
Oltre a queste considerazioni tecniche, abbiamo osservato che il comportamento proliferativo che osserviamo ex vivo non fa proprio match che ha previsto da studi in vivo, probabilmente a causa di integrità piale essere interrotto dalla preparazione dei tessuti. In tali condizioni, quando un costrutto di espressione GFP è elettroporate, una grande proporzione di cellule elettroporate sembra aver lasciato il ciclo cellulare dopo un giorno di coltura come giudicato da PH3 colorazione (Figura 3F). Questo non è correlato alle prospettive di EGL comportamento proliferativo, dove la proliferazione di cloni sia mouse e pulcino si estende su un ampio periodo di tempo 27. L'implicazione che la pia modula la proliferazione è sostenuta dall'osservazione che quando l'elettroporazione di una costru giornalistat con un NeuroD1 regolatorio elemento guida espressione di GFP tutte le cellule elettroporate esprimono GFP dopo un giorno di coltura (Figura 3D). In vivo, questo costrutto rispecchia endogena espressione NeuroD1 nelle cellule del EGL interno che sono post-mitotico 36,37 marcatura, mentre integrale NeuroD1 è sufficiente per guidare la differenziazione cellulare (Figura 3E). Ciò suggerisce che in certe condizioni, la capacità proliferativa delle cellule non può essere mantenuto in quanto è in EGL esterno in fasi equivalenti in vivo. PH3 colorazione ha tuttavia suggerisce che c'è un sacco di proliferazione in coltura, spesso localizzata alla zona EGL (Figura 4D). Proliferazione esteso al di fuori della EGL indica un possibile aumento gliogenesi o la proliferazione dei precursori Pax2 GABAergici nella materia bianca. L'implicazione è che l'interpretazione di qualsiasi procedura sperimentale dovrà prendere in considerazione la proliferativ soprae comportamento, il fatto che le cellule di Purkinje non formano un monostrato fino a E18 pulcino e che lo sviluppo normale può essere compromessa dopo la preparazione fetta (ad esempio, per mancanza di interazione con arrampicata fibre etc.)
Nonostante queste limitazioni, il nostro protocollo rappresenta un passo avanti significativo in relazione allo studio molti aspetti della biologia cellulare dei granuli. Il vantaggio fondamentale di permettere spazialmente e temporalmente etichettatura specifica della EGL come distinto dal labbro romboidale faciliterà più esami del sia della biologia cellulare dei progenitori dei granuli e la regolazione genetica alla base in un modo che non è possibile al momento in vivo. La nostra tecnica di pulcino integrerà ex vivo di cultura e di elettroporazione protocolli esistenti nei roditori 43-48 e porta i notevoli vantaggi in termini di costi e la convenienza che sono associati con il pulcino. Inoltre, esso rappresenta un progresso significativo rispettole tecniche esistenti di progenitori coltura granuli 39. Mentre sarà completare piuttosto che sostituire quest'ultima, il nostro protocollo aprirà il controllo del differenziamento granuli neurone ad un'ampia varietà di trattamenti farmaceutici e alla diversità delle cellule manipolazioni genetiche autonome che sono possibili nel pulcino. Esso fornisce una base per l'esame granello biologia cellulare con dettagli senza precedenti.
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Acknowledgments
Il metodo presentato in questo articolo è nata dal lavoro finanziato dalla BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) e un dottorato studentship MRC (MH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Ltd | Cut at 300 μm for best results. | |
| Basal Medium Eagle (Gibco) | Life Technologies | 41010-026 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | |
| 0.4 μm culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| TSS20 Ovodyne electroporator | Intracel | 01-916-02 | Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation. |
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