Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Ex Vivo Cultuur van Chick Cerebellaire Slices en Ruimtelijk Gerichte Elektroporatie van Korrel cel precursoren

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53421
Automatic Translation
1, 1, 2
1MRC Centre of Developmental Neurobiology, King's College London, 2School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary, University of London

Summary

Cerebellaire granule uitwendige laag is de plaats van de grootste doorvoer versterking in de zich ontwikkelende hersenen. Hier presenteren we een protocol voor genetische modificatie om deze laag te richten op het hoogtepunt van proliferatie via ex vivo elektroporatie en cultuur van cerebellaire plakjes uit embryonale dag 14 kippenembryo's.

Abstract

Cerebellaire granule uitwendige laag (EGL) is de plaats van de grootste doorvoer versterking in de zich ontwikkelende hersenen en een uitstekend model voor het bestuderen van neuronale proliferatie en differentiatie. Bovendien zijn evolutionaire modificaties van de proliferatieve capaciteit belast de intense beleving van cerebellaire grootte in de amnioten geweest, waardoor het cerebellum een ​​uitstekend model voor evo-devo studies van de gewervelde hersenen. De constituerende cellen van EGL, cerebellaire granule voorlopers, ook een belangrijke cel van oorsprong vormen voor medulloblastoom, de meest voorkomende pediatrische neuronale tumor. Na doorvoer amplificatie granule precursoren migreren radiaal in de interne granulaire laag van het cerebellum, waar zij de grootste neuronale populatie in het volwassen hersenen. In kuiken, de piek van EGL proliferatie optreedt aan het einde van de tweede week van de zwangerschap. Om genetische modificatie om deze laag te richten opde piek van proliferatie, hebben we een werkwijze voor genetische manipulatie door middel van ex vivo elektroporatie van cerebellum segmenten uit embryonale dag 14 kippenembryo's ontwikkeld. Deze werkwijze herhaalt verscheidene belangrijke aspecten van in vivo granule neuron ontwikkeling en zal bruikbaar zijn bij het ​​genereren van een grondig begrip van cerebellaire granule celproliferatie en differentiatie en dus van cerebellum ontwikkeling, groei en ziekte.

Introduction

Het cerebellum zit aan het voorste uiteinde van de achterhersenen en is verantwoordelijk voor de integratie van sensorische en motorische verwerking in de volwassen hersenen en regulering hogere cognitieve processen 1. In zoogdieren en vogels, bezit een uitgebreid morfologie en zwaar gelaagde, een resultaat van uitgebreid doorvoer amplificatie van progenitors in ontwikkeling die produceert dan de helft van de neuronen in de volwassen hersenen. Het cerebellum is een onderwerp van onderzoek geweest neurobiologists eeuwenlang en in de moleculaire tijdperk is ook veel aandacht gekregen. Dit heeft niet alleen zijn inherent interessant biologie, maar ook op het feit dat het zwaar is betrokken bij humane ziekten waaronder ontwikkelingsstoornissen genetische aandoeningen zoals autismespectrumstoornissen 2 en het meest opvallend de cerebellaire kanker, medulloblastoom 3, dat is de meest voorkomende pediatrische brain tumor. Belangrijk is een uitstekend modelsysteem binnen which allocatie lot en neurogenese studeren tijdens de ontwikkeling van de hersenen 4. De laatste jaren is ook vastgesteld als modelsysteem voor de vergelijkende studie van hersenontwikkeling, vanwege de enorme diversiteit van cerebellaire vormen gezien in de vertebraat fylogenie 5-10.

Het cerebellum ontwikkelt de dorsale helft van rhombomere 1 in de achterhersenen en ontwikkelingsgebied 11 omvat twee primaire progenitorpopulaties de ruitvormige lip en de ventriculaire zone. De ruitvormige lip strekt zich uit rond het dorsale gebied van de neuroepithelium van de achterhersenen aan de grens met de dakplaat. Het is de geboorteplaats van de glutamaat prikkelende neuronen van het cerebellum 12-14. De ventriculaire zone leidt tot de remmende GABAergic cerebellaire neuronen, het meest opvallend grote Purkinje neuronen 14,15. Later in de ontwikkeling (van ongeveer embryonale dag 13,5 in de muis; e6 in kuiken 16), glutamaat Progensatoren migreren tangentieel van de ruitvormige lip en vormen een pial laag van voorlopers: een secundaire voorlopercellen zone genaamd de externe korrel laag (EGL). Het is deze laag die de uitgebreide amplificatie doorvoer die leidt naar de grote aantallen granule neuronen in de volwassen hersenen ondergaat.

Proliferatie in de EGL is lang verbonden met de sub-pial plaats als gevolg van tangentiële migratie van de ruitvormige lip 17, de schakelaar celcyclus verlaten en neuronale differentiatie van voorlopercellen behoort bij het ​​verlaten van de buitenste EGL laag in het midden EGL 18. Uitgebreide tangentiële migratie van post-mitotische granule cellen in mediale-laterale as optreedt in het midden en binnenste EGL 19 vóór definitieve radiale migratie naar de binnenste laag van de korrel rijpe cerebellaire cortex. Migratie van cellen uit de ruitvormige lip over de cerebellaire oppervlakte is afhankelijk van CXCL12 signalering van de pia 20-22 23-25. Intrigerend elektronenmicroscopische studies 17 hebben gesuggereerd dat EGL cellen met een proliferatieve morfologie behouden pial contact, het koppelen van de cel gedrag proliferatieve mogelijkheden op een manier die doet denken aan de basale voorouders van de zoogdieren cortex 26. Dit komt tot uiting in de genoemde stratificatie van de EGL in drie sub-lagen die worden gedefinieerd door verschillende extracellulaire milieu en indien granule precursors hebben verschillende genexpressie handtekeningen 18.

Proliferatie van voorlopers in de oEGL optreedt met een normale verdeling van kloon afmetingen zodanig dat als voorlopers individueel genetisch gemerkt eind embryonale ontwikkeling bij de muis, geven aanleiding tot een mediaan gemiddelde van 250-500 g postmitotischeranule neuronen 27,28. Proliferatie is afhankelijk van mitogene SHH signalering van onderliggende Purkinje neuronen 29-32. Het vermogen om te reageren op SHH aangetoond volledig afhankelijk cell autonome expressie van de transcriptiefactor Atoh1 te zijn, zowel in vitro 33 en in vivo 34,35. Evenzo heeft celcyclus verlaten en differentiatie getoond afhankelijk van de expressie van het stroomafwaartse transcriptiefactor NeuroD1 36, die waarschijnlijk een directe repressor van Atoh1 37 zijn.

Ondanks deze vooruitgang, en de aanzienlijke vooruitgang in het ontcijferen van de celbiologische basis van de celcyclus exit 38-42, het fundamentele moleculaire mechanisme (s) dat de beslissing ten grondslag liggen aan de celcyclus verlaten en om de overgang van een voorloper van een differentiërende neuron, en de geassocieerde postmitotische tangentiële migratie in het binnenste EGL en de latere switchradiale migratie, blijft onvolledig begrepen. Dit is grotendeels vanwege het experimentele eigenzinnigheid van de EGL: het laat ontwikkelen, en moeilijk genetisch doel omdat veel van dezelfde neurogene moleculen ook cruciaal vroeger in het leven van korrel precursors in het ruitvormige lip. Om dit probleem te overwinnen zijn talrijke auteurs in vivo en ex vivo elektroporatie ontwikkeld als een methode om de postnatale cerebellum bij knaagdieren 43-48 richten. Hier hebben we pionier het gebruik van ex vivo elektroporatie in chick op de EGL, die aanzienlijke voordelen vertegenwoordigt in termen van kosten en het gemak bestuderen. Onze methode van elektroporatie en ex vivo stukje cultuur van chick cerebellaire weefsel maakt gebruik van weefsel ontleed uit embryonale dag 14 kuikens op het hoogtepunt van EGL proliferatie. Deze methode maakt genetische targeting van het EGL onafhankelijk van de ruitvormige lip en het stadium voor genetische dissectie van de overgang van granulevoorlopercellen te postmitotische korrel neuron in het cerebellum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Let op: Alle experimenten werden uitgevoerd met overeenstemming met het King's College in Londen, Verenigd Koninkrijk en het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken richtlijnen verzorging van dieren.

1. Dissectie van e14 kleine hersenen

  1. Broeden eieren bruin bevruchte kippeneieren bij 38 ° C tot embryonale Dag 14.
  2. Met behulp van ei schaar onthoofden kippenembryo in ovo en verwijder het hoofd naar een petrischaal met ijskoude PBS (Figuur 1A).
  3. Met behulp van standaard tang, maak insnijdingen achter elk oog helemaal door het weefsel, het verwijderen van de ogen en bovenkaak. Een tweede insnijding helemaal door de keelholte verwijderen van de onderkaak (Figuur 1B).
  4. Met behulp van standaard tang, verwijder alle huid van de oppervlakte van de schedel door het weg te pellen (figuur 1C) en verwijder de frontale en pariëtale botten, onthullen hersenen.
  5. Vanuit een ventrale aspect, verwijder pharyngeal kraakbeen en hulpstoffen mesenchym.
  6. Vanuit een dorsale aspect, voorzichtigly verwijderen mesenchym dorsale achterhersenen naar de zorg niet te pia, en aparte gehele hersenen (figuur 1D) beschadigen.
  7. Maak incisie helemaal door het weefsel tussen de middenhersenen en achterhersenen en aparte achterhersenen inclusief cerebellum (figuur 1E).
  8. Door het maken van incisies helemaal door het weefsel aan beide laterale kruispunten van cerebellum en alar plaat van de achterhersenen, verwijdert hele cerebellum, zorg ervoor dat de integriteit van de pia hele dissectie (Figuur 1F) handhaven. Verwijder de choroid plexus vormen (figuur 1G).
  9. Verplaats de kleine hersenen ontleed in ijskoude HBSS.

2. Slice Cultuur van e14 kleine hersenen

  1. Breng de hele cerebellum naar de steriele platform van een Tissue Chopper met een spatel of een 3 ml Pasteur pipet met de punt weggesneden om het diafragma te verbreden. Verwijder overtollige vloeistof met een pipet.
  2. Snijd hele hele cerebellum in tHij vereist oriëntatie 300 urn dik met de tissue chopper ingesteld met een snijsnelheid van 50% van het maximum. Weefsel integriteit is het meest gemakkelijk bewaard in sagittale doorsnede; Maar oriëntatie is ook een belangrijke overweging voor mobiele analyse (Purkinje cel dendrieten zijn sagittally uitgelijnd, terwijl de korrel cel axonen dwars lopen, loodrecht op het vlak van de Purkinje cel dendrieten).
  3. Met behulp van een 3 ml Pasteur pipet, hebben betrekking op de in plakjes gesneden cerebellum in ijskoude HBSS.
  4. Breng de plakjes in HBSS tot een 60 mm petrischaal met ijskoude verse HBSS met behulp van een 3 ml Pasteur pipet met cut tip.
  5. Zorgen voor een scheiding van de afzonderlijke segmenten met horlogemaker tang onder een dissectiemicroscoop verlicht met een fiber optic lichtbron. Identificeer segmenten te geëlektroporeerd, gebaseerd op hun weefselintegriteit en medio-laterale positie.
    Opmerking: Elke dissectie van embryo tot incubatie snijden in kweekmedium duurt ongeveer 10-20 minuten, afhankelijk upon ervaring. Voer dissecties een tegelijk zodat cerebella brengen minimale tijd tussen onthoofding en ex vivo kweken.

3. Elektroporatie van Slices

  1. Construct een elektroporatie kamer door vaststelling van de anode van een elektroporator aan de basis van een 60 mm petrischaal met isolatieband. Voeg ongeveer 1 ml HBSS om de elektrode bedekken.
  2. Plaats een 0,4 urn kweekinsert bovenop de elektrode bedekt met HBSS. Laat de cultuur insert te rusten op de elektrode ervoor te zorgen dat er altijd contact tussen de insert en de elektrode.
    Opmerking: In deze opstelling zal de kweekinsert de segmenten rusten op het oppervlak van de oplossing, het handhaven van de schakeling, maar waarbij ruimtelijke gerichtheid van de kathode.
  3. Transfer geïdentificeerd plakjes (maximaal vijf per cultuur insert) op cultuur insert met 3 ml Pasteur pipet met de cut tip. Aparte en laat bezinken op cultuur insert in een sagittal oriëntatie.
  4. Met behulp van een pipet, verwijderen overtollige HBSS zodat schijfjes niet meer badend in oplossing.
  5. Met een P10 pipetpunt, pipet DNA (bij een concentratie van 1 ug / ul) verdund met 20% snel groen over het oppervlak van doelgebied van een plak. 20% snel groen zorgt visceuze DNA-oplossing en voorkomt onbetaalbaar brede verspreiding van DNA. Voeg ongeveer 5 ul DNA / fast green oplossing voor elk segment (figuur 2B).
  6. Plaats de kathode op gewenste gerichte weefsel en electroporate met 3 x 10 V, 10 ms duur pulsen. Vermijd direct contact van de kathode met het weefsel. In plaats daarvan gebruik maken van de oppervlaktespanning van de vloeistof geleidbaarheid handhaven (plaats de kathode zo dicht bij het weefsel mogelijk zonder dat het aanraken van het weefsel).
  7. Herhaal DNA levering en elektroporatie meerdere gebieden van EGL op iedere afzonderlijke cerebellaire segment zoals gewenst.
  8. Na voltooiing van elektroporatie, de overdracht van cultuur insert tot 30 mm petrischaal.
  9. Aan elke kweek, voeg 1 ml voorverwarmd kweekmedium (Basaal Medium Eagle, 0,5% (w / v) D - (+) - glucose, 1% B27 supplement, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine) onder de kweekinsert zodanig dat de cultuur inzetstuk in contact met medium, maar schijfjes niet gebaad.
  10. Incubeer kweken bij 37 ° C / 6% CO 2 tot 3 dagen. Vervang alle van het kweekmedium elke 24 uur met verse voorverwarmde medium.
  11. Na cultuur, vast plakken cultuur inzetstukken voor 1 uur in 4% paraformaldehyde (of O / N bij 4 ° C) in een verse 30 mm schaal zonder kweekmedium.

4. beeldvorming van cerebellaire Slices

  1. Na fixatie, wassen plakken 3 maal gedurende 5 min in PBS.
  2. Met behulp van een scheermesje, ontleden elk geëlektroporeerd en gekweekt cerebellaire slice uit de cultuur insert door te snijden om de slice en het verwijderen van het segment en regio insert wordt nageleefd. Doniet proberen om slice uit de cultuur insert oppervlak te verwijderen.
  3. Mount plakjes in ongeveer 1 ml van de montage medium met DAPI (indien gewenst) onder een dekglaasje zorg niet te bellen in te voeren, en het beeld met behulp van laser-scanning confocale microscopie.
    Opmerking: Imaging parameters kunnen worden gevarieerd afhankelijk van de constructen geëlektroporeerd, en naar keuze van de individuele gebruiker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit gedeelte illustreert voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van slice elektroporatie en cultuur van cerebellum uit embryonale dag 14 chick. De ontleding van het cerebellum is geïllustreerd in figuur 1 en elektroporatie kamer ingesteld is weergegeven in figuur 2. We tonen aan dat het mogelijk is cultuur cerebellaire schijfjes, die de structuur en cellulaire morfologie (figuur 3A) behouden vitro electroporate en succesvol. Gerichte elektroporatie individuele folia gemakkelijk bereikt (figuur 3B). We succes electroporate verschillende plasmiden in de EGL cellen en laten zien dat het mogelijk is i) om cellen te labelen met reporter constructen hun gedrag (Figuur 3C acht), ii) mogelijke genomische regio functionaliteit in cerebellaire cellen getest (Figuur 3D ), en iii) het genetisch manipulerencellen in de EGL door misexpressing eiwitten van belang (figuur 3E). Bovendien farmacologische manipulaties op geëlektroporeerd segmenten mogelijk zijn (resultaten niet getoond). Na het kweken is het mogelijk om extra weefselanalyse voeren zoals immunohistochemie of proliferatie assays (figuur 3F). We voeren weefsel gezondheidsanalyse door calbindin en PH3 immunokleuring en laten zien dat weefselintegriteit wordt gedurende ten minste 3 div na kweek (Figuur 4). Deze resultaten demonstreren dat de EGL nu een toegankelijk en gemakkelijk te manipuleren structuur die volledig kunnen worden onderzocht en genetisch veranderde in het kuiken modelsysteem.

Figuur 1
Figuur 1. Dissectie van de kleine hersenen van E14 kippenembryo's. (A) Onthoofden het kuiken in het ei en verwijder de kop into een petrischaal met ijskoude PBS. Verwijder de onderkaak en de ogen door het maken van incisie achter de ogen en de keelholte (stippellijn). (B) Verwijder het vel van het oppervlak van de schedel. (C) Verwijder de frontale en pariëtale botten en (D) verwijderen van de hersenen van het mesenchym en kraakbeen omringen. (E) Onder een stereomicroscoop identificeren van de locatie van het cerebellum aan het achterste uiteinde van de hersenen. Snijd tussen de middenhersenen en achterhersenen (stippellijnen) te worden gelaten met het cerebellum en ventrale achterhersenen. (F) Voeg insnijdingen in de zijdelingse verbindingen (steel) van het cerebellum het cerebellum te scheiden van de achterhersenen (stippellijn). (G) Verwijder de choroid plexus (asterisk) vanaf de buikzijde van het cerebellum tot je achter met een geheel intact cerebellum met de pia bevestigd. Transfer het cerebellum in ijskoude HBSS voor de voorbereiding van schijfjes met een tissue Chopper. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. De elektroporatie kamer zetten. (A) Een foto van de op maat gemaakte elektroporatie kamer. De kamer bestaat uit een anode van een elektroporator stevig geplaatst op de bodem van een 60 mm petrischaal. De schotel bevat ongeveer 1 ml HBSS om de elektrode bedekken. De cultuur insert dient tegen de elektrode met constant contact tussen het inzetstuk en de elektrode, het handhaven van de schakeling, maar waarbij ruimtelijke gerichtheid van de kathode, die wordt gemanipuleerd met de hand. (B) Een beeld van plakjes worden geëlektroporeerd. Plakjes worden bedekt met de DNA / fast green oplossing. De schijfjes worden geëlektroporeerd als begeerted: elektroporatie kan worden gericht op één of meerdere locaties folium. Na elektroporatie het inzetstuk wordt geplaatst in een 30 mm petrischaal met voorverwarmd kweekmedium en gekweekt in de incubator. 1. De anode 2. De kathode 3. Cultuur insert 4. petrischaal met 1 ml HBSS 5. dissectiemicroscoop 6. Individuele plakjes van weefsel chopper 7. DNA-oplossing met snelle groene kleurstof. Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.

Figuur 3
Figuur 3. Representatieve resultaten. (A) Een lage vergroting beeld van een controle elektroporatie van een RFP coderend plasmide in de EGL op meerdere locaties. Het weefsel behoudt zijn structuur en geëlektroporeerde cellen zijn duidelijk zichtbaar in een dikke subpiale laag van het cerebellum. (B) Eenvoorbeeld van een gerichte elektroporatie met een controle GFP plasmide. De beoogde folium wordt aangegeven met een sterretje. Schaalbalk AB = 500 pm. (C) Een voorbeeld waar een construct coderend voor GFP aangedreven door een Atoh1 enhancer werd geëlektroporeerd in de EGL. De expressie van Atoh1 definieert korrel cel voorlopers binnen de EGL. Verschillende celmorfologieën duidelijk zichtbaar 3 div en mobiele gedrag kan worden gecontroleerd. (D) Een voorbeeld van etikettering volgens de elektroporatie van een construct dat een vermeende geconserveerde niet-coderende element (CNE) van de NeuroD1 gen rijden GFP. De CNE meldt activiteit in de cellen verwacht op basis van de endogene NeuroD1 expressie suggereert een actieve rol van de CNE in ontwikkeling. NeuroD1 expressie correleert met de initiatie van korrel celdifferentiatie. (E) Een voorbeeld waarbij het ​​weefsel genetisch kunnen worden gemanipuleerd door misexpression van NeuroD1 eiwit en een verandering in granule cellen Behaviour kan worden waargenomen. (F) Een voorbeeld waar de geëlektroporeerd weefsel (controle GFP plasmide) kunnen worden gefixeerd en gekleurd voor merkers van prolifererende cellen, zoals phosphohistone H3 (PH3). Schaalbalk CF = 50 pm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Tissue integriteit en proliferatie in de cultuur. (A - C) Calbindin kleuring van E14 cerebellaire weefsel geëlektroporeerd met een controle GFP plasmide op 1-3 dagen in vitro (div). Calbindin kleuring blijkt dat de integriteit weefsel in kweek gehouden gedurende minstens 3 div. De Purkinje cellaag vormt geen monolaag in dit stadium chick ontwikkeling, maar het is duidelijk te zien vormen van een laag onder deEGL waar de korrel cellen (groen) zijn gevestigd. (D) Phosphohistone H3 (PH3) vlekken op cerebellum weefsel gekweekt voor 2 div. PH3 kleuring zichtbaar in de EGL (pijlen) maar ook in andere cerebellaire regio (pijlpunten). Deze kleuring is representatief voor alle fasen in de cultuur onderzocht (1-3 div). Schaalbalk AD = 50 pm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol hier gemeld beschrijft een methode voor het ontleden, elektroporeren en het kweken van plakjes embryonale Dag 14 cerebellum van het kuiken. Dit protocol maakt targeting van elektroporatie kleine focale gebieden van de EGL, inclusief geïsoleerde targeting van individuele cerebellaire lobben. Het maakt genetische analyse en weergave met een hoge resolutie te bereiken, en tegen lage kosten in vergelijking met bestaande technieken bij knaagdieren 43-47. Dergelijke analyse is momenteel niet mogelijk in vivo vanwege de langere ontwikkelings- periode, het gebrek aan EGL-specifieke genetische targeting mogelijkheden in muis en de gemeenschappelijke moleculaire mechanismen tussen de ruitvormige lip en EGL, waardoor wijzigingen kunnen die invloed EGL biologie vaak niet geanalyseerd kan worden, omdat zij van invloed ruitvormige lip neurogenese en trekt EGL vorming 49. Ons systeem is dus een belangrijke stap vooruit in termen van gerichte genetische modificatie aan de EGL specifically, en we verwachten het zal van toepassing zijn op andere soorten worden dan het kuiken dat misschien vergelijkende belang, zoals niet-model zoogdieren en reptielen.

Bij het uitvoeren van de slice cultuur electroporatie techniek, een aantal technische overwegingen voorop. Ten eerste, de robuustheid plakken te overleven in kweek zonder aan de ene kant ondergaat uitgebreide celdood of andere structurele integriteit verliezen beperkt de dikte van de plak tot 300 urn in onze handen. Een tweede belangrijke overweging is de viscositeit van de DNA-oplossing, die elektroporatie van DNA garandeert bij concentraties die hoog genoeg zijn om zichtbaar of relevante niveaus van genetische modificatie induceren. In in ovo elektroporatie van DNA oplossingen geïnjecteerd in de vroege embryonale achterhersenen concentraties van snelle groene kleurstof van ongeveer 1% zijn typisch. In ons protocol gebruiken we meestal concentraties snel groen van 20%. Dit zorgt voor een voldoende viscous DNA-oplossing om verspreiding van het DNA volgende pipetting maar voordat elektroporatie te voorkomen, maar een voldoende te verdunnen een efficiënte elektrische geleiding bemiddelen.

Naast deze technische overwegingen waargenomen dat proliferatieve gedrag dat we waarnemen ex vivo niet precies overeen met die voorspeld uit in vivo studies waarschijnlijk te wijten aan pial integriteit verstoord door de weefsel bereiding. Onder dergelijke omstandigheden, wanneer een GFP expressieconstruct wordt geëlektroporeerd, een groot deel van de geëlektroporeerde cellen blijken de celcyclus verlaten hebben na één dag kweken zoals beoordeeld door PH3 kleuring (Figuur 3F). Dit betekent niet correleren met de verwachte EGL proliferatieve gedrag, waar de proliferatie van klonen in zowel de muis als kuiken strekt zich uit over een groot periode 27. De implicatie dat de pia moduleert proliferatie wordt ondersteund door de waarneming dat wanneer we electroporate een reporter construct met een NeuroD1 regulerend element rijden expressie van GFP alle geëlektroporeerde cellen brengen GFP na één dag in de cultuur (Figuur 3D). In vivo, deze constructie spiegels endogene NeuroD1 expressie in het markeren cellen van de binnenste EGL dat zijn post-mitotische 36,37, terwijl de volledige lengte NeuroD1 is voldoende om celdifferentiatie (figuur 3E) te rijden. Dit suggereert dat onder bepaalde omstandigheden, het proliferatieve vermogen van cellen niet worden gehandhaafd zoals in de buitenste EGL bij equivalente stadia in vivo. PH3 kleuring nochtans suggereren dat er veel proliferatie in cultuur, vaak gelokaliseerd in het gebied EGL (figuur 4D). Uitgebreide proliferatie buiten de EGL geeft eventueel versterkt gliogenesis of proliferatie van Pax2 GABAergic voorlopers in witte stof. De implicatie is dat interpretatie van elke experimentele procedure moet het rekening houden met de bovengenoemde proliferative gedrag, kan dat Purkinje cellen geen monolaag tot E18 in kuiken en die normale ontwikkeling vormen worden aangetast na slice preparaat (bijvoorbeeld vanwege gebrek aan interactie met klimvezels etc.)

Ondanks deze beperkingen, ons protocol is een belangrijke stap voorwaarts ten opzichte van het bestuderen van de vele aspecten van korrel celbiologie. Het essentiële voordeel dat ruimtelijk en temporeel specifieke labeling van de EGL worden onderscheiden van de ruitvormige lip zal meerdere onderzoeken van zowel de celbiologie van granule progenitors en de genetische regulatie grondslag liggen op een wijze die niet mogelijk is thans vivo vergemakkelijken. Onze techniek kuiken bestaande ex vivo cultuur en elektroporatie protocollen knaagdieren 43-48 vullen en draagt ​​de aanzienlijke voordelen in kosten en gemak die zijn geassocieerd met kuiken. Daarnaast is een belangrijke verbetering ten opzichtebestaande technieken van het kweken korrel voorouders 39. Hoewel het eerder dan een aanvulling vervanging voor deze zal ons protocol opent de besturing van granule neuron differentiatie tot diverse farmaceutische behandelingen en de diversiteit van cel autonoom genetische manipulaties die mogelijk zijn in het kuiken. Het biedt een basis voor de behandeling van korrel celbiologie in ongekend detail.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De methode die in dit artikel is ontstaan ​​uit het werk gefinancierd door de BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) en een MRC doctoraal studententijd (MH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Ltd Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco) Life Technologies 41010-026
L-glutamine Sigma G7513
penicillin/streptomycin Sigma P4333
0.4 μm culture insert Millipore PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator  Intracel 01-916-02 Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmahmann, J. D. The role of the cerebellum in cognition and emotion: personal reflections since 1982 on the dysmetria of thought hypothesis, and its historical evolution from theory to therapy. Neuropsychology Review. 20, 236-260 (2010).
  2. Becker, E. B., Stoodley, C. J. Autism spectrum disorder and the cerebellum. International Review of Neurobiology. 113, 1-34 (2013).
  3. Hatten, M. E., Roussel, M. F. Development and cancer of the cerebellum. Trends in Neurosciences. 34, 134-142 (2011).
  4. Butts, T., Green, M. J., Wingate, R. J. Development of the cerebellum: simple steps to make a 'little brain. Development. 141, 4031-4041 (2014).
  5. Rodriguez-Moldes, I., et al. Development of the cerebellar body in sharks: spatiotemporal relations of Pax6 expression, cell proliferation and differentiation. Neuroscience Letters. 432, 105-110 (2008).
  6. Kaslin, J., et al. Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 29, 6142-6153 (2009).
  7. Chaplin, N., Tendeng, C., Wingate, R. J. Absence of an external germinal layer in zebrafish and shark reveals a distinct, anamniote ground plan of cerebellum development. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 3048-3057 (2010).
  8. Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
  9. Butts, T., Modrell, M. S., Baker, C. V., Wingate, R. J. The evolution of the vertebrate cerebellum: absence of a proliferative external granule layer in a non-teleost ray-finned fish. Evolution & Development. 16, 92-100 (2014).
  10. Corrales, J. D., Blaess, S., Mahoney, E. M., Joyner, A. L. The level of sonic hedgehog signaling regulates the complexity of cerebellar foliation. Development. 133, 1811-1821 (2006).
  11. Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development. 126, 4395-4404 (1999).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
  14. Yamada, M., et al. Specification of spatial identities of cerebellar neuron progenitors by ptf1a and atoh1 for proper production of GABAergic and glutamatergic neurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 4786-4800 (2014).
  15. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
  16. Wilson, L. J., Wingate, R. J. Temporal identity transition in the avian cerebellar rhombic lip. Developmental Biology. 297, 508-521 (2006).
  17. Hausmann, B., Sievers, J. Cerebellar external granule cells are attached to the basal lamina from the onset of migration up to the end of their proliferative activity. The Journal of Comparative Neurology. 241, 50-62 (1985).
  18. Xenaki, D., et al. F3/contactin and TAG1 play antagonistic roles in the regulation of sonic hedgehog-induced cerebellar granule neuron progenitor proliferation. Development. 138, 519-529 (2011).
  19. Komuro, H., Yacubova, E., Yacubova, E., Rakic, P. Mode and tempo of tangential cell migration in the cerebellar external granular layer. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 527-540 (2001).
  20. Klein, R. S., et al. SDF-1 alpha induces chemotaxis and enhances Sonic hedgehog-induced proliferation of cerebellar granule cells. Development. 128, 1971-1981 (2001).
  21. Zhu, Y., et al. Role of the chemokine SDF-1 as the meningeal attractant for embryonic cerebellar neurons. Nature Neuroscience. 5, 719-720 (2002).
  22. Hagihara, K., et al. Shp2 acts downstream of SDF-1alpha/CXCR4 in guiding granule cell migration during cerebellar development. Developmental Biology. 334, 276-284 (2009).
  23. Borrell, V., Marin, O. Meninges control tangential migration of hem-derived Cajal-Retzius cells via CXCL12/CXCR4 signaling. Nature Neuroscience. 9, 1284-1293 (2006).
  24. Paredes, M. F., Li, G., Berger, O., Baraban, S. C., Pleasure, S. J. Stromal-derived factor-1 (CXCL12) regulates laminar position of Cajal-Retzius cells in normal and dysplastic brains. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 9404-9412 (2006).
  25. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 1613-1624 (2008).
  26. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  27. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 2301-2312 (2008).
  28. Legue, E., Riedel, E., Joyner, A. L. Clonal analysis reveals granule cell behaviors and compartmentalization that determine the folded morphology of the cerebellum. Development. 142, 1661-1671 (2015).
  29. Dahmane, N., Ruizi Altaba,, A, Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  30. Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Current Biology : CB. 9, 445-448 (1999).
  31. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
  32. Lewis, P. M., Gritli-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., McMahon, A. P. Sonic hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270, 393-410 (2004).
  33. Zhao, H., Ayrault, O., Zindy, F., Kim, J. H., Roussel, M. F. Post-transcriptional down-regulation of Atoh1/Math1 by bone morphogenic proteins suppresses medulloblastoma development. Genes & Development. 22, 722-727 (2008).
  34. Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
  35. Klisch, T. J., et al. In vivo Atoh1 targetome reveals how a proneural transcription factor regulates cerebellar development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3288-3293 (2011).
  36. Miyata, T., Maeda, T., Lee, J. E. NeuroD is required for differentiation of the granule cells in the cerebellum and hippocampus. Genes & Development. 13, 1647-1652 (1999).
  37. Butts, T., Hanzel, M., Wingate, R. J. Transit amplification in the amniote cerebellum evolved via a heterochronic shift in NeuroD1 expression. Development. 141, 2791-2795 (2014).
  38. Rios, I., Alvarez-Rodriguez, R., Marti, E., Pons, S. Bmp2 antagonizes sonic hedgehog-mediated proliferation of cerebellar granule neurones through Smad5 signalling. Development. 131, 3159-3168 (2004).
  39. Anne, S. L., et al. WNT3 inhibits cerebellar granule neuron progenitor proliferation and medulloblastoma formation via MAPK activation. PloS One. 8, e81769 (2013).
  40. Chedotal, A. Should I stay or should I go? Becoming a granule cell. Trends in Neurosciences. 33, 163-172 (2010).
  41. Penas, C., et al. Casein Kinase 1delta Is an APC/C(Cdh1) Substrate that Regulates Cerebellar Granule Cell Neurogenesis. Cell Reports. 11, 249-260 (2015).
  42. Penas, C., et al. GSK3 inhibitors stabilize Wee1 and reduce cerebellar granule cell progenitor proliferation. Cell Cycle. 14, 417-424 (2015).
  43. Yang, Z. J., et al. Novel strategy to study gene expression and function in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience Methods. 132, 149-160 (2004).
  44. Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nature Neuroscience. 10, 559-567 (2007).
  45. Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 16182-16187 (2007).
  46. Famulski, J. K., et al. Siah regulation of Pard3A controls neuronal cell adhesion during germinal zone exit. Science. 330, 1834-1838 (2010).
  47. Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. 14, 973-983 (2011).
  48. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. , (2014).
  49. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).

Tags

Developmental Biology cerebellum ontwikkeling kuiken externe korrel laag slice cultuur korrel cellen Purkinje cellen elektroporatie.
<em>Ex Vivo</em> Cultuur van Chick Cerebellaire Slices en Ruimtelijk Gerichte Elektroporatie van Korrel cel precursoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hanzel, M., Wingate, R. J. T.,… More

Hanzel, M., Wingate, R. J. T., Butts, T. Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors. J. Vis. Exp. (106), e53421, doi:10.3791/53421 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter