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Developmental Biology

पूर्व Vivo चिकी अनुमस्तिष्क स्लाइस की संस्कृति और स्पैटियली Electroporation ग्रेन्युल सेल व्यापारियों की लक्षित

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53421
Automatic Translation
1, 1, 2
1MRC Centre of Developmental Neurobiology, King's College London, 2School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary, University of London

Summary

अनुमस्तिष्क बाहरी दाना परत विकासशील मस्तिष्क में सबसे बड़ा पारगमन प्रवर्धन की साइट है। यहाँ, हम भ्रूण दिन 14 लड़की भ्रूण से पूर्व vivo electroporation और अनुमस्तिष्क स्लाइस की संस्कृति का उपयोग प्रसार के शिखर पर इस परत के लिए आनुवंशिक परिवर्तन लक्षित करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Abstract

अनुमस्तिष्क बाहरी दाना परत (EGL) विकासशील मस्तिष्क में सबसे बड़ा पारगमन प्रवर्धन की साइट है, और neuronal प्रसार और भेदभाव के अध्ययन के लिए एक शानदार मॉडल है। इसके अलावा, अपने proliferative क्षमता के विकासवादी संशोधनों सेरिबैलम कशेरुकी मस्तिष्क के एवो-देवो के अध्ययन के लिए एक शानदार मॉडल बनाने, उल्वों में अनुमस्तिष्क आकार के नाटकीय विस्तार के लिए जिम्मेदार है। EGL के घटक कोशिकाओं, अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल पूर्वज भी, medulloblastoma के लिए सबसे अधिक प्रचलित बाल चिकित्सा न्यूरोनल ट्यूमर मूल के एक महत्वपूर्ण सेल प्रतिनिधित्व करते हैं। पारगमन प्रवर्धन के बाद, दाना व्यापारियों वे परिपक्व स्तनधारी दिमाग में सबसे बड़ा न्यूरोनल आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं जहां सेरिबैलम के आंतरिक बारीक परत में त्रिज्यात पलायन। लड़की में, EGL प्रसार के शिखर हमल के दूसरे सप्ताह के अंत में होता है। पर इस परत के लिए आनुवंशिक परिवर्तन लक्षित करने के लिएप्रसार के शिखर, हम भ्रूण दिन 14 लड़की भ्रूण से सेरिबैलम स्लाइस के पूर्व vivo electroporation के माध्यम से आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक तरीका विकसित किया है। इस विधि में विवो दाना न्यूरॉन विकास के कई महत्वपूर्ण पहलुओं का स्मरण दिलाता है और अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल सेल प्रसार और भेदभाव की एक पूरी तरह से समझ पैदा करने में उपयोगी हो जाएगा, और इस तरह सेरिबैलम विकास, विकास और रोग की।

Introduction

सेरिबैलम hindbrain के पूर्वकाल अंत में बैठता है और परिपक्व मस्तिष्क में संवेदी और मोटर प्रसंस्करण के एकीकरण के लिए जिम्मेदार है और साथ ही उच्च संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं 1 को विनियमित है। स्तनपायी और पक्षियों में, यह वयस्क दिमाग में न्यूरॉन्स की आधी से अधिक उत्पादन करता है कि विकास के दौरान, progenitors के व्यापक पारगमन प्रवर्धन का एक उत्पाद एक विस्तृत आकृति विज्ञान के पास है और भारी foliated है। सेरिबैलम सदियों से neurobiologists के लिए और आणविक युग में अध्ययन के एक विषय रहा है वैसे ही महत्वपूर्ण ध्यान दिया गया है। यह अपने स्वाभाविक दिलचस्प जीव विज्ञान के लिए, लेकिन यह भी भारी ऐसे सबसे अधिक प्रचलित बाल मस्तिष्क है जो आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकारों के 2 और सबसे प्रमुखता अनुमस्तिष्क कैंसर, medulloblastoma 3, के रूप में विकास आनुवंशिक विकारों सहित मानव रोग में फंसा है कि इस तथ्य को न केवल संबंधित है ट्यूमर। महत्वपूर्ण बात है, यह क भीतर एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली हैआईसीएच मस्तिष्क के विकास को 4 के दौरान भाग्य आवंटन और न्यूरोजेनेसिस अध्ययन करने के लिए। हाल के वर्षों में, यह भी कशेरुकी फिलोजेनी 5-10 भर में देखा अनुमस्तिष्क रूपों की विशाल विविधता के कारण मस्तिष्क के विकास के तुलनात्मक अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित किया गया है।

सेरिबैलम hindbrain 11 में rhombomere 1 के पृष्ठीय आधे से विकसित और विकासात्मक दो प्राथमिक पूर्वज आबादी, विषमकोण होंठ और निलय क्षेत्र के शामिल है। विषमकोण होंठ छत की थाली के साथ सीमा पर hindbrain की neuroepithelium के पृष्ठीय क्षेत्र के आसपास फैली हुई है। यह सेरिबैलम 12-14 के ग्लूटामेटरगिक उत्तेजक न्यूरॉन्स का जन्मस्थान है। निलय क्षेत्र सबसे प्रमुखता से निरोधात्मक GABAergic अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स, बड़े पुर्किन्जे न्यूरॉन्स 14,15 को जन्म देता है। बाद विकास में (माउस में भ्रूण दिन 13.5 के बारे में से; लड़की 16 में E6), ग्लूटामेटरगिक PROGENitors rhombic होंठ से tangentially विस्थापित और progenitors के एक pial परत के रूप में: एक माध्यमिक पूर्वज क्षेत्र बाहरी दाना परत (EGL) कहा जाता है। यह परिपक्व मस्तिष्क में पाया दाना न्यूरॉन्स की भारी संख्या की ओर जाता है कि व्यापक पारगमन प्रवर्धन से होकर गुजरती है कि इस परत है।

EGL में प्रसार लंबे सेल चक्र से बाहर निकलें और बीच में बाहरी EGL परत से उनके बाहर निकलने के साथ जुड़े होने progenitors के neuronal भेदभाव करने के लिए स्विच के साथ, विषमकोण होंठ 17 से स्पर्शरेखा प्रवास से यह परिणाम है कि उप-pial स्थान से जोड़ा गया है EGL 18। औसत दर्जे का पार्श्व अक्ष में बाद mitotic दाना कोशिकाओं के व्यापक स्पर्शरेखा पलायन परिपक्व अनुमस्तिष्क कॉर्टेक्स के भीतरी दाना परत में अंतिम रेडियल माइग्रेशन से पहले, मध्य और भीतरी EGL 19 में होता है। अनुमस्तिष्क सतह पर rhombic होंठ से कोशिकाओं के प्रवास पिया 20-22 से CXCL12 सिगनल पर निर्भर है 23-25 ​​पलायन कर neocortical tangentially की है कि इस प्रकार याद ताजा करती है। दिलचस्प, इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म अध्ययनों 17 एक proliferative आकृति विज्ञान के साथ EGL कोशिकाओं स्तनधारी कोर्टेक्स 26 के बेसल पूर्वज की याद ताजा एक तरीके से proliferative क्षमता के साथ सेल के व्यवहार को जोड़ने, pial संपर्क बनाए रखने कि सुझाव दिया है। यह 18 हस्ताक्षर दाना व्यापारियों विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति है, जहां अलग बाह्य वातावरण और से परिभाषित कर रहे हैं कि तीन sublayers में EGL के aforementioned स्तरीकरण में दिखाई देता है।

OEGL में पूर्वज के प्रसार के पूर्वज व्यक्तिगत रूप से आनुवंशिक रूप से माउस में भ्रूण के विकास के अंत में चिह्नित कर रहे हैं, जब वे 250-500 postmitotic जी की एक मंझला औसत को जन्म दे ऐसी है कि क्लोन आकार के एक सामान्य वितरण के साथ होता हैranule न्यूरॉन्स 27,28। परमाणु अप्रसार पुर्किन्जे न्यूरॉन्स 29-32 अंतर्निहित से mitogenic श सिगनल पर निर्भर है। श करने के लिए प्रतिक्रिया करने की क्षमता प्रतिलेखन कारक Atoh1 की सेल स्वायत्त अभिव्यक्ति पर पूरी तरह से निर्भर होना दिखाया गया है, इन विट्रो 33 और इन विवो 34,35 में दोनों। इसी तरह, सेल चक्र से बाहर निकलें और भेदभाव की संभावना Atoh1 37 का एक सीधा repressor है जो नीचे की ओर प्रतिलेखन कारक NeuroD1 36, की अभिव्यक्ति पर निर्भर होने के लिए दिखाया गया है।

सेल चक्र से बाहर निकलने के 38-42 की सेल जैविक आधार गूढ़ रहस्य में इस प्रगति, और काफी उन्नति के बावजूद, निर्णय आबाद है कि मौलिक आणविक तंत्र (एस) सेल चक्र से बाहर निकलने के लिए और एक फर्क न्यूरॉन के लिए एक पूर्वज से संक्रमण के लिए, और भीतरी EGL में जुड़े postmitotic स्पर्शरेखा प्रवास के रूप में अच्छी तरह से बाद में स्विचरेडियल प्रवास करने के लिए, समझ में आ अधूरे रहते हैं। इस वजह से EGL की प्रयोगात्मक असभ्यता की एक बड़ी हद तक है: यह देर से विकास, और एक ही तंत्रिकाजन्य अणुओं के कई महत्वपूर्ण पहले दाना व्यापारियों के जीवन में rhombic होंठ पर भी रहे हैं के बाद से आनुवंशिक रूप से लक्षित करने के लिए मुश्किल है। इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए, कई लेखकों कृन्तकों 43-48 में प्रसव के बाद सेरिबैलम को लक्षित करने के एक तरीके के रूप विवो और पूर्व vivo electroporation में विकसित किया है। यहाँ, हम लागत और सुविधा के मामले में काफी फायदे का प्रतिनिधित्व करता है जो EGL, अध्ययन करने के लिए लड़की में पूर्व vivo electroporation के उपयोग के अग्रणी। Electroporation और लड़की अनुमस्तिष्क ऊतक के पूर्व vivo टुकड़ा संस्कृति की हमारी विधि 14 लड़कियों EGL प्रसार के चरम पर भ्रूण दिन से ऊतक विच्छेदित का उपयोग करता है। इस विधि rhombic होंठ की स्वतंत्र रूप से EGL के आनुवंशिक लक्ष्य-निर्धारण की अनुमति देता है और दाना से संक्रमण की आनुवंशिक विच्छेदन के लिए मंच तैयार करेंगेसेरिबैलम में postmitotic दाना न्यूरॉन के पूर्वज।

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Protocol

नोट: सभी प्रयोगों किंग्स कॉलेज लंदन, ब्रिटेन और ब्रिटेन के गृह मंत्रालय जानवरों की देखभाल के दिशा-निर्देशों के अनुसार के साथ प्रदर्शन किया गया।

E14 सेरिबैलम के 1. विच्छेदन

  1. भ्रूण दिन 14 से 38 डिग्री सेल्सियस पर भूरे रंग निषेचित मुर्गियाँ 'अंडे सेते हैं।
  2. का प्रयोग अंडे कैंची ओवो में लड़की भ्रूण सिर काटना और बर्फ के ठंडे पीबीएस (चित्रा 1 ए) युक्त एक पेट्री डिश के लिए सिर को हटा दें।
  3. मानक संदंश का प्रयोग, आँखें और ऊपरी जबड़े को हटाने, ऊतकों के माध्यम से हर आंख पीछे सभी तरह चीरों बनाते हैं। सभी तरह से निचले जबड़े (चित्रा 1 बी) को हटाने ग्रसनी के माध्यम से एक दूसरे चीरा।
  4. मानक संदंश का प्रयोग, चित्रा (1 सी) इसे दूर छीलने द्वारा खोपड़ी की सतह से सभी त्वचा को हटाने और मस्तिष्क का खुलासा, ललाट और पार्श्विका हड्डियों को हटा दें।
  5. एक उदर पहलू से, ग्रसनी उपास्थि और सहायक mesenchyme हटा दें।
  6. एक पृष्ठीय पहलू से, सावधानLy पिया, और अलग पूरे मस्तिष्क (चित्रा -1) को नुकसान नहीं hindbrain देखभाल करने के लिए mesenchyme पृष्ठीय हटा दें।
  7. सभी तरह से मध्यमस्तिष्क और hindbrain और सेरिबैलम (चित्रा 1E) सहित अलग hindbrain के बीच ऊतकों के माध्यम से चीरा।
  8. सभी तरह से सेरिबैलम और पश्च मस्तिष्क की alar थाली के दोनों पार्श्व जंक्शनों पर ऊतकों के माध्यम से चीरों करके, विच्छेदन भर पिया की अखंडता (चित्रा 1F) को बनाए रखने के ख्याल रख रही है, पूरे सेरिबैलम हटा दें। गठन रंजित जाल (चित्रा 1G) निकालें।
  9. बर्फ ठंड HBSS में विच्छेदित सेरिबैलम ले जाएँ।

E14 सेरिबैलम के 2 स्लाइस संस्कृति

  1. एक रंग या टिप के साथ एक 3 मिलीलीटर पाश्चर विंदुक का उपयोग कर एक ऊतक हेलिकॉप्टर की बाँझ मंच करने के लिए पूरे सेरिबैलम स्थानांतरण एपर्चर चौड़ा करने के लिए दूर काटा। एक विंदुक का उपयोग अतिरिक्त तरल निकालें।
  2. टी में पूरे पूरे सेरिबैलम कटवह अधिकतम 50% से कम एक काटने की गति के साथ सेट ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग कर 300 माइक्रोन मोटाई पर उन्मुखीकरण की आवश्यकता है। ऊतक अखंडता सबसे आसानी से बाण अनुभाग में संरक्षित है; हालांकि, अभिविन्यास भी सेल के विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है (दाना सेल एक्सोन transversely चलाने जबकि Purkinje सेल डेन्ड्राइट sagittally Purkinje सेल dendrites के हवाई जहाज को सीधा, गठबंधन कर रहे हैं)।
  3. एक 3 मिलीलीटर पाश्चर विंदुक का प्रयोग, बर्फ में कटा हुआ सेरिबैलम ठंड HBSS को कवर किया।
  4. कटौती टिप के साथ एक 3 मिलीलीटर पाश्चर विंदुक का उपयोग कर बर्फ के ठंडे ताजा HBSS युक्त एक 60 मिमी पेट्री डिश के लिए HBSS में स्लाइस स्थानांतरण।
  5. एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोत के साथ प्रकाशित एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, घड़ीसाज़ संदंश का उपयोग व्यक्तिगत स्लाइस की जुदाई किया जाता है। स्लाइस की पहचान उनके ऊतक अखंडता और मिडफील्डर-पार्श्व स्थिति पर आधारित है, electroporated किया जाना है।
    नोट: संस्कृति के माध्यम में ऊष्मायन टुकड़ा करने के लिए के माध्यम से भ्रूण से प्रत्येक विच्छेदन के आसपास 10-20 मिनट के आधार UPO लेता हैएन अनुभव। कि cerebella कत्ल और पूर्व vivo संस्कृति के बीच समय की न्यूनतम राशि खर्च सुनिश्चित करने के लिए एक समय में विच्छेदन एक निष्पादित करें।

स्लाइस की 3. Electroporation

  1. इन्सुलेशन टेप के साथ एक 60 मिमी पेट्री डिश के आधार करने के लिए एक electroporator की एनोड फिक्सिंग से एक इलेक्ट्रोपोरेशन कक्ष का निर्माण। इलेक्ट्रोड को कवर करने के HBSS के लगभग 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. HBSS में कवर इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर एक 0.4 माइक्रोन संस्कृति डालने रखें। संस्कृति डालने इलेक्ट्रोड हमेशा डालने और इलेक्ट्रोड के बीच वहाँ से संपर्क कर रहा है सुनिश्चित कर रही है पर आराम करने की अनुमति दें।
    नोट: इस सेटअप में, स्लाइस के साथ संस्कृति डालने सर्किट बनाए रखने पर कैथोड के स्थानिक लक्ष्य-निर्धारण की अनुमति देता है, समाधान की सतह पर बनी रहेगी।
  3. स्थानांतरण की पहचान की स्लाइस (संस्कृति डालने प्रति पांच तक) में कटौती टिप के साथ 3 मिलीग्राम पाश्चर विंदुक का उपयोग संस्कृति डालने पर। अलग-अलग और एक sagitt में संस्कृति डालने पर व्यवस्थित करने की अनुमतिअल उन्मुखीकरण।
  4. स्लाइस अब कोई समाधान में स्नान कर रहे हैं ताकि एक विंदुक का प्रयोग, अतिरिक्त HBSS हटा दें।
  5. एक टुकड़ा के लक्षित क्षेत्र की सतह पर 20% तेजी से हरे रंग के साथ पतला (1 माइक्रोग्राम / μl की एकाग्रता में) एक P10 विंदुक टिप, पिपेट डीएनए का उपयोग करना। 20% तेजी से हरे रंग का चिपचिपा डीएनए समाधान सुनिश्चित करता है और बेहद डीएनए की व्यापक प्रसार को रोकता है। प्रत्येक टुकड़ा (चित्रा 2 बी) के लिए लगभग 5 μl डीएनए / फास्ट ग्रीन समाधान जोड़ें।
  6. वांछित लक्षित ऊतक के ऊपर कैथोड रखें और 3 एक्स 10 वी, 10 मिसे अवधि दालों के साथ electroporate। ऊतक के साथ कैथोड के सीधे संपर्क से बचें। इसके बजाय, प्रवाहकत्त्व बनाए रखने के (वास्तव में ऊतकों को छूने के बिना संभव के रूप में ऊतक के करीब के रूप कैथोड जगह) के लिए तरल की सतह तनाव का लाभ ले।
  7. वांछित के रूप में प्रत्येक व्यक्ति अनुमस्तिष्क टुकड़ा पर EGL के कई क्षेत्रों के लिए डीएनए वितरण और electroporation दोहराएँ।
  8. इलेक्ट्रोपोरेशन के पूरा होने के हस्तांतरण संस्कृति Inse पर30 मिमी पेट्री डिश के लिए RT।
  9. , ग्लूकोज, 1% B27 पूरक, 2 मिमी एल glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन - (+) - प्रत्येक संस्कृति के लिए, पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से (बेसल मध्यम ईगल के 1 मिलीलीटर, 0.5% (w / v) डी जोड़ने संस्कृति डालने माध्यम के साथ संपर्क में है, लेकिन स्लाइस यह में स्नान नहीं कर रहे हैं कि इस तरह की संस्कृति डालने के नीचे 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन)।
  10. अप करने के लिए 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 6% सीओ 2 संस्कृतियों सेते हैं। संस्कृति के माध्यम से नए सिरे से पूर्व गर्म माध्यम के साथ हर 24 घंटे के सभी जगह।
  11. संस्कृति कोई संस्कृति मीडिया के साथ एक ताजा 30 मिमी डिश में (4 डिग्री सेल्सियस पर या हे / एन) 4% paraformaldehyde में 1 घंटे के लिए सम्मिलित करता है पर संस्कृति के बाद, स्लाइस को ठीक।

अनुमस्तिष्क स्लाइस की 4. इमेजिंग

  1. निर्धारण के बाद, पीबीएस में 5 मिनट के लिए स्लाइस 3 बार धोएं।
  2. एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, टुकड़ा आसपास काटने और टुकड़ा और इसका पालन किया जाता है डालने के क्षेत्र को हटाने के द्वारा संस्कृति डालने से प्रत्येक electroporated और सुसंस्कृत अनुमस्तिष्क टुकड़ा काटना। करसंस्कृति डालने की सतह से टुकड़ा दूर करने के लिए प्रयास नहीं।
  3. एक coverslip देखभाल के तहत (यदि वांछित) DAPI युक्त बढ़ते मध्यम के लगभग 1 मिलीलीटर में माउंट स्लाइस बुलबुले परिचय नहीं, और छवि लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग।
    नोट: इमेजिंग पैरामीटर electroporated निर्माणों के अनुसार अलग है, और व्यक्तिगत उपयोगकर्ता के विवेक पर किया जा सकता है।

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Representative Results

इस अनुभाग में भ्रूण दिन 14 लड़की से टुकड़ा electroporation और सेरिबैलम की संस्कृति का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है कि परिणाम के उदाहरण दिखाता है। सेरिबैलम के विच्छेदन चित्रा 1 में सचित्र है और स्थापित इलेक्ट्रोपोरेशन चैम्बर चित्रा 2 में दिखाया गया है। हम इसे सफलतापूर्वक इन विट्रो में (चित्रा 3) उनकी संरचना और सेलुलर morphologies बनाए रखने जो संस्कृति अनुमस्तिष्क स्लाइस, electroporate और संभव है कि पता चलता है। व्यक्तिगत फ़ोलिया को लक्षित इलेक्ट्रोपोरेशन आसानी से (चित्रा 3 बी) हासिल की है। हम सफलतापूर्वक द्वितीय) अनुमस्तिष्क कोशिकाओं में कार्यक्षमता के लिए संभव जीनोमिक क्षेत्रों का परीक्षण करने के लिए) EGL कोशिकाओं में विभिन्न plasmids के एक नंबर electroporate और रिपोर्टर उनके व्यवहार (चित्रा -3 सी निरीक्षण करने के लिए constructs के साथ कोशिकाओं लेबल) यह संभव मैं चलता है कि (चित्रा 3 डी ), और तृतीय) आनुवंशिक हेरफेर करने के लिएब्याज (3E चित्रा) के प्रोटीन misexpressing द्वारा EGL में कोशिकाओं। इसके अतिरिक्त, electroporated स्लाइस पर औषधीय जोड़तोड़ (नहीं दिखाया परिणाम) संभव हो रहे हैं। संवर्धन के बाद यह इस तरह के इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री या प्रसार assays (3F चित्रा) के रूप में अतिरिक्त ऊतक विश्लेषण करने के लिए संभव है। हम Calbindin और PH3 immunostaining के द्वारा ऊतक स्वास्थ्य विश्लेषण करते हैं और ऊतक अखंडता संस्कृति के बाद कम से कम 3 div (चित्रा 4) के लिए बनाए रखा है कि पता चलता है। इन परिणामों के EGL पूरी तरह से जांच की और आनुवंशिक रूप से लड़की मॉडल प्रणाली में बदला जा सकता है कि एक सुलभ और आसानी से छेड़छाड़ संरचना है कि अब प्रदर्शित करता है।

आकृति 1
E14 लड़की भ्रूण से सेरिबैलम के चित्रा 1. विच्छेदन। (ए) अंडे में लड़की सिर काटना और सिर पूर्णांक को दूरबर्फ के ठंडे पीबीएस के साथ OA पेट्री डिश। निचले जबड़े और आंखों और ग्रसनी (धराशायी लाइन) के पीछे चीरा द्वारा आंखों निकालें। (बी) खोपड़ी की सतह से त्वचा निकालें। (सी) यह आसपास mesenchyme और उपास्थि से मस्तिष्क को हटाने ललाट और पार्श्विका हड्डियों और (डी) निकालें। एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत (ई) मस्तिष्क के पीछे अंत में सेरिबैलम के स्थान की पहचान। मध्यमस्तिष्क और पश्च (धराशायी लाइनों) के बीच में कटौती सेरिबैलम और उदर hindbrain साथ नहीं छोड़ा जा सकता। (एफ) hindbrain (धराशायी लाइन) से सेरिबैलम अलग करने के लिए सेरिबैलम के पार्श्व जंक्शनों (डंठल) पर चीरों बनाओ। आप संलग्न पिया के साथ एक पूरी बरकरार सेरिबैलम के साथ छोड़ दिया जाता है जब तक (जी) सेरिबैलम के उदर की ओर से रंजित जाल (तारांकन) निकालें। एक ऊतक chopp साथ स्लाइस तैयार करने से पहले ठंडा HBSS में सेरिबैलम स्थानांतरणइंजी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
इलेक्ट्रोपोरेशन चैम्बर 2. चित्रा की स्थापना की। (ए) कस्टम बनाया इलेक्ट्रोपोरेशन चैम्बर की एक तस्वीर। चैम्बर एक 60 मिमी पेट्री डिश के आधार पर सुरक्षित रखा एक electroporator की एक anode के होते हैं। पकवान इलेक्ट्रोड को कवर करने के HBSS के लगभग 1 मिलीलीटर होता है। संस्कृति डालने सर्किट को बनाए रखने, लेकिन हाथ से चालाकी है जो कैथोड, के स्थानिक लक्ष्य-निर्धारण की अनुमति देता है, डालने और इलेक्ट्रोड के बीच लगातार संपर्क के साथ इलेक्ट्रोड पर आराम करना चाहिए। स्लाइस (बी) एक तस्वीर electroporated जा रहा है। स्लाइस डीएनए / फास्ट ग्रीन समाधान के साथ आते हैं। स्लाइस इच्छा के रूप में electroporated कर रहे हैंडी: इलेक्ट्रोपोरेशन एक Folium या कई स्थानों को निशाना बनाया जा सकता है। Electroporation के बाद डालने इनक्यूबेटर में पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से और सुसंस्कृत के साथ एक 30 मिमी पेट्री डिश में रखा गया है। 1. एनोड 2. 1 मिलीलीटर HBSS 5. विदारक माइक्रोस्कोप ऊतक हेलिकॉप्टर से 6. व्यक्तिगत स्लाइस तेजी से हरे रंग के साथ 7. डीएनए समाधान के साथ कैथोड 3. संस्कृति डालने 4. पेट्री डिश। कृपया यहाँ क्लिक करें इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए आंकड़ा।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रतिनिधि परिणाम है। (ए) से अधिक स्थानों पर EGL में एक आरएफपी एन्कोडिंग प्लाज्मिड के एक नियंत्रण electroporation की एक कम बढ़ाई तस्वीर। ऊतक इसकी संरचना को बरकरार रखे हुए है और electroporated कोशिकाओं स्पष्ट रूप से सेरिबैलम की एक मोटी परत subpial में दिखाई दे रहे हैं। (ख) एकएक नियंत्रण GFP प्लाज्मिड के साथ एक लक्षित electroporation की उदाहरण। लक्षित Folium एक तारांकित ने संकेत दिया है। स्केल बार एबी 500 माइक्रोन =। (सी) एक Atoh1 बढ़ाने के द्वारा संचालित एक निर्माण एन्कोडिंग GFP EGL में electroporated गया है, जहां एक उदाहरण है। Atoh1 की अभिव्यक्ति EGL भीतर दाना सेल व्यापारियों को परिभाषित करता है। विभिन्न सेल morphologies स्पष्ट रूप से 3 div पर दिखाई दे रहे हैं और सेल के व्यवहार पर नजर रखी जा सकती है। (डी) GFP ड्राइविंग NeuroD1 जीन की एक ख्यात संरक्षित गैर-कोडिंग तत्व (सीएनई) युक्त एक निर्माण की electroporation निम्नलिखित लेबलिंग का एक उदाहरण है। सीएनई विकास में इस सीएनई के एक सक्रिय भूमिका सुझाव अंतर्जात NeuroD1 अभिव्यक्ति के आधार पर उम्मीद की कोशिकाओं में गतिविधि की रिपोर्ट। NeuroD1 अभिव्यक्ति दाना सेल भेदभाव की दीक्षा के साथ संबद्ध है। (ई) ऊतक आनुवंशिक रूप से NeuroD1 प्रोटीन की misexpression और दाना सेल बिहेव में एक परिवर्तन से चालाकी से किया जा सकता है, जहां एक उदाहरणiour मनाया जा सकता है। (एफ) electroporated ऊतक (GFP प्लाज्मिड नियंत्रण) तय की और इस तरह के phosphohistone H3 (PH3) के रूप में proliferating कोशिकाओं के मार्कर के लिए कलंकित किया जा सकता है, जहां एक उदाहरण है। स्केल बार सीएफ = 50 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
संस्कृति में 4. ऊतक अखंडता और प्रसार चित्रा। (एक - सी) विट्रो (div) में 1-3 दिनों में एक नियंत्रण GFP प्लाज्मिड के साथ electroporated E14 अनुमस्तिष्क ऊतक के Calbindin धुंधला हो जाना। Calbindin धुंधला ऊतक अखंडता कम से कम 3 div के लिए संस्कृति में बनाए रखा है कि पता चलता है। Purkinje सेल परत लड़की विकास में इस स्तर पर एक monolayer फार्म नहीं करता है, लेकिन यह स्पष्ट रूप से नीचे एक परत बनाने में देखा जाता हैदाना कोशिकाओं (हरा) स्थित हैं जहां EGL। 2 div के लिए सुसंस्कृत अनुमस्तिष्क ऊतक पर (डी) Phosphohistone H3 (PH3) धुंधला। PH3 धुंधला EGL (तीर) में दिखाई दे रहा है लेकिन यह भी अन्य अनुमस्तिष्क क्षेत्रों (तीर) में है। यह धुंधला जांच की संस्कृति में सभी चरणों (1-3 div) का प्रतिनिधि है। स्केल बार ई = 50μm यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां बताया प्रोटोकॉल, विदारक electroporating और लड़की से भ्रूण दिन 14 सेरिबैलम के स्लाइस के संवर्धन के लिए एक विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल व्यक्ति अनुमस्तिष्क पालियों के अलग लक्ष्य-निर्धारण सहित EGL के छोटे फोकल क्षेत्रों को electroporation की को निशाना बनाता है। यह एक उच्च संकल्प और सुविधानुसार आनुवांशिक विश्लेषण और इमेजिंग के लिए सक्षम बनाता है, और एक कम कीमत पर कृन्तकों 43-47 में स्थापित तकनीकों की तुलना में। इस तरह के विश्लेषण के कारण परिवर्तन EGL प्रभावित कर सकता है जिसका मतलब है कि विस्तारित विकास समय की अवधि, माउस में EGL-विशिष्ट आनुवंशिक लक्ष्य-निर्धारण संभावनाओं की कमी है, और rhombic होंठ और EGL के बीच आणविक तंत्र की समानता, vivo में वर्तमान में संभव नहीं है वे rhombic होंठ न्यूरोजेनेसिस प्रभावित करते हैं और EGL गठन 49 निराकृत के बाद से जीव विज्ञान अक्सर विश्लेषण नहीं किया जा सकता है। हमारी प्रणाली इस प्रकार EGL एस के लिए आनुवंशिक संशोधन को निशाना बनाने के मामले में एक प्रमुख अग्रिम का प्रतिनिधित्वpecifically, और हम इसे लड़की से परे अन्य प्रजातियों के लिए लागू होगा आशा है कि शायद इस तरह के गैर मॉडल स्तनपायी और सरीसृप के रूप में तुलनात्मक ब्याज की।

टुकड़ा संस्कृति electroporation तकनीक का प्रदर्शन करने में तकनीकी कारणों की एक संख्या सर्वोपरि हैं। सबसे पहले, स्लाइस की मजबूती व्यापक कोशिका मृत्यु के दौर से गुजर एक हाथ पर बिना या अन्य खोने संरचनात्मक अखंडता पर संस्कृति में जीवित रहने के लिए हमारे हाथ में 300 माइक्रोन के लिए टुकड़ा की मोटाई की सीमा। एक दूसरा महत्वपूर्ण विचार आनुवंशिक संशोधन के दृश्य या प्रासंगिक स्तरों प्रेरित करने के लिए काफी अधिक हैं कि सांद्रता में डीएनए की electroporation सुनिश्चित करता है जो डीएनए समाधान की चिपचिपाहट है। जल्दी भ्रूण hindbrain में इंजेक्शन डीएनए समाधान के ओवो electroporation में, लगभग 1% की तेजी से हरे रंग की सांद्रता विशिष्ट हैं। हालांकि, हमारे प्रोटोकॉल में, हम आम तौर पर 20% की तेजी से हरे रंग की सांद्रता का उपयोग करें। यह एक पर्याप्त तुलना सुनिश्चित करता हैcous डीएनए समाधान pipetting लेकिन इलेक्ट्रोपोरेशन पहले निम्नलिखित डीएनए के प्रसार को रोकने के लिए, लेकिन एक पर्याप्त कुशल विद्युत चालन मध्यस्थता करने के लिए एक पतला।

इन तकनीकी कारणों के अलावा, हम पूर्व vivo पालन कि कि proliferative व्यवहार मनाया करता pial अखंडता ऊतक तैयारी द्वारा बाधित किया जा रहा करने की वजह से शायद इन विवो अध्ययनों से भविष्यवाणी की है कि ठीक नहीं है मैच। एक GFP अभिव्यक्ति का निर्माण electroporated है जब इस तरह की स्थितियों के तहत, electroporated कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा PH3 धुंधला (चित्रा 3F) द्वारा न्याय के रूप में संस्कृति के सिर्फ एक दिन के बाद सेल चक्र छोड़ दिया है दिखाई देते हैं। इस माउस और लड़की दोनों में क्लोन के प्रसार के एक बड़े समय अवधि 27 से अधिक फैली जहां उम्मीद EGL proliferative व्यवहार, के साथ संबंध स्थापित नहीं है। पिया प्रसार modulates निहितार्थ है कि अवलोकन के द्वारा समर्थित है कि हम एक संवाददाता निर्माण electroporate जबमें विवो, इस निर्माण 36,37 बाद mitotic हैं कि भीतरी EGL की कोशिकाओं के अंकन में अंतर्जात NeuroD1 अभिव्यक्ति दर्पण GFP संस्कृति में एक दिन (चित्रा 3 डी)। सब के बाद electroporated कोशिकाओं को व्यक्त GFP के एक NeuroD1 नियामक तत्व ड्राइविंग अभिव्यक्ति के साथ टी, पूरी लंबाई NeuroD1 सेल भेदभाव (3E चित्रा) ड्राइव करने के लिए पर्याप्त है, जबकि। इस तरह से यह विवो में बराबर चरणों में बाहरी EGL में है के रूप में कुछ शर्तों के तहत, कोशिकाओं के proliferative क्षमता नहीं रखा जा सकता है। PH3 धुंधला हालांकि अक्सर EGL क्षेत्र (चित्रा 4D) के लिए स्थानीय संस्कृति में प्रसार का एक बहुत है कि वहाँ सुझाव है। EGL के बाहर व्यापक प्रसार संभवतः सफेद पदार्थ में Pax2 GABAergic व्यापारियों की gliogenesis या प्रसार बढ़ाया इंगित करता है। निहितार्थ यह है कि किसी भी प्रयोगात्मक प्रक्रिया की व्याख्या खाते के ऊपर proliferativ में रखना होगा कि हैई व्यवहार, Purkinje कोशिकाओं सामान्य विकास लड़की में और कहा कि E18 तक एक monolayer फार्म नहीं है कि इस तथ्य के कारण (आदि फाइबर चढ़ाई के साथ बातचीत की कमी करने के लिए, उदाहरण के लिए) टुकड़ा तैयारी के बाद समझौता किया जा सकता है

इन सीमाओं के बावजूद, हमारे प्रोटोकॉल दाना कोशिका जीव विज्ञान के कई पहलुओं का अध्ययन करने के संबंध में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है। विषमकोण होंठ से अलग रूप में स्थानिक और अस्थायी EGL की विशिष्ट लेबलिंग से सक्षम बनाने के लिए महत्वपूर्ण लाभ दाना progenitors की कोशिका जीव विज्ञान दोनों और इन विवो में वर्तमान में संभव नहीं है कि एक तरह से यह underpinning आनुवंशिक विनियमन के कई परीक्षाओं की सुविधा होगी। लड़की में हमारी तकनीक कृन्तकों 43-48 में मौजूदा पूर्व vivo संस्कृति और electroporation प्रोटोकॉल के पूरक हैं और लागत और लड़की के साथ जुड़े रहे हैं कि सुविधा में काफी फायदे किया जाता होगा। इसके अतिरिक्त, इस पर एक महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्वसंवर्धन दाना पूर्वज 39 की मौजूदा तकनीक। यह पूरक के बजाय बाद के बदल देगा, वहीं हमारे प्रोटोकॉल दवा उपचार की एक विस्तृत विविधता के लिए और लड़की में संभव हो रहे हैं कि सेल स्वायत्त आनुवंशिक जोड़तोड़ की विविधता के लिए दाना न्यूरॉन भेदभाव के नियंत्रण खुल जाएगा। यह अभूतपूर्व विस्तार में दाना कोशिका जीव विज्ञान की जांच के लिए एक आधार प्रदान करता है।

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Acknowledgments

इस लेख में प्रस्तुत विधि बीबीएसआरसी बी बी / द्वारा वित्त पोषित काम से उठी I021507 / 1 (टीबी, RJTW) और एक एमआरसी डॉक्टरेट की छात्रवृत्ति (महाराष्ट्र)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Ltd Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco) Life Technologies 41010-026
L-glutamine Sigma G7513
penicillin/streptomycin Sigma P4333
0.4 μm culture insert Millipore PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator  Intracel 01-916-02 Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.

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<em>पूर्व Vivo</em> चिकी अनुमस्तिष्क स्लाइस की संस्कृति और स्पैटियली Electroporation ग्रेन्युल सेल व्यापारियों की लक्षित
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Hanzel, M., Wingate, R. J. T.,… More

Hanzel, M., Wingate, R. J. T., Butts, T. Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors. J. Vis. Exp. (106), e53421, doi:10.3791/53421 (2015).

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